جلد 14، شماره 2 - ( 2-1394 )                   جلد 14 شماره 2 صفحات 125-136 | برگشت به فهرست نسخه ها


XML English Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Mortazavi H, Nakhaei Moghaddam M, Nejad Shahrokh Abadi K. Study of the Effect of Silver Nanoparticles on Biofilms Formation by Staphylococcus epidermidis. JRUMS. 2015; 14 (2) :125-136
URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-2196-fa.html
مرتضوی حانیه، نخعی مقدم محبوبه، نژاد شاهرخ آبادی خدیجه. بررسی اثـر نانـوذرات نقـره بر بیـوفیلم‌های ناشی از استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس. مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان. 1394; 14 (2) :125-136

URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-2196-fa.html


استاديار دانشگاه آزاد اسلامی، واحد مشهد، گروه زیست شناسی، مشهد، ایران
متن کامل [PDF 229 kb]   (1006 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (3423 مشاهده)
متن کامل:   (72 مشاهده)
مقاله پژوهشی

مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

دوره 14، اردیبهشت 1394، 136-125

بررسی اثـر نانـوذرات نقـره بر بیـوفیلم‌های ناشی از استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس

حانیه مرتضوی[1]، محبوبه نخعی مقدم[2]، خدیجه نژاد شاهرخ آبادی[3]

دریافت مقاله: 4/4/93        ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 28/7/93    دریافت اصلاحیه از نویسنده: 26/11/93    پذیرش مقاله: 19/1/94

AWT IMAGEچکیده

زمینه و هدف: استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس پلی‌ساکارید خارج سلولی تولید می‌کند که به عنوان بیوفیلم شناخته می‌شود. بیوفیلم در ایجاد عفونت‌های این باکتری بسیار مؤثر است و می‌تواند روی وسایل پزشکی که در بدن به کار گرفته می‌شوند، ایجاد شود. هدف از اجرای این تحقیق بررسی اثر نانوذرات نقره کلوئیدی بر رشد باکتری استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و بیوفیلم ناشی از آن بود.

مواد و روش‌ها: در این مطالعه مقطعی تجربی، آزمایشات بر روی 13 ایزوله بالینی و یک سویه استاندارد استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس (ATCC 12228) انجام شد. حداقل غلظت ممانعت از رشد (MIC) و کشندگی (MBC) نانوذرات با روش رقت در آگار تعیین شد. آزمایشات ایجاد بیوفیلم با روش میکروتیتر پلیت و رنگ آمیزی با سافرانین انجام شد. داده‌ها با استفاده از آنالیز واریانس یکطرفه تجزیه تحلیل شدند.

یافته‌ها: میانگین MIC و MBC نانوذرات برای ایزوله‌های بیمارستانی به ترتیب 61/19±350 و  ppm05/64‌±‌69/707 بود و نانوذره در غلظت‌های پایین اثر باکتریواستاتیک داشت. نانوذره در غلظت ppm 5/0 اثر ضد بیوفیلمی داشت و با افزایش غلظت تا ppm 4 اثر ضد بیوفیلمی آن افزایش یافت. همچنین، نانوذره در غلظت‌های بالاتر از ppm 150 توانایی از بین بردن بیوفیلم تشکیل شده را داشت.

نتیجه‌گیری: نتایج تحقیق نشان داد نانوذرات کلوئیدی نقره توانایی مهار تشکیل بیوفیلم استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس را دارند و می‌توان پیشنهاد داد که از این ترکیبات در تهیه روکش‌های پروتزها و وسایل مصنوعی که در بدن تعبیه می‌شوند و یا پوشاندن سطوح مراکز درمانی استفاده شود.

واژه‌های کلیدی: استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس، بیوفیلم، میکروتیتر پلیت

مقدمه

عفونت‌های بیمارستانی از جمله مهمترین مشکلات گریبان‌گیر تمامی بیمارستان‌ها در سراسر دنیا هستند و در کشورهای پیشرفته و در حال توسعه، هر دو یکی از دلایل مهم مرگ و میر محسوب می‌شوند. شیوع استافیلوکوک‌ها در عفونت‌های بیمارستانی در سراسر جهان گسترش زیادی پیدا کرده است و این باکتری یکی از فراوان‌ترین عوامل شایع عفونت‌های خون، چشم، گوش، بینی، قلب و عروقی است. استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس پلی‌ساکارید خارج سلولی تولید می‌کند که باعث تشکیل بیوفیلم می‌شود. بیوفیلم در ایجاد عفونت‌های این باکتری بسیار مؤثر است [1]. بیوفیلم یک مجموعه میکروبی متصل به سطح و محصور در ماتریکس است که سبب قدرتمندی باکتری می‌شود. عفونت‌های مربوط به بیوفیلم پایدارتر از عفونت‌های ناشی از حالت پلانکتونی باکتری‌ها و همچنین، مقاومتر به آنتی‌بیوتیک‌ها هستند. یکی از دلایلی که امروزه بیوفیلم‌ها مورد توجه دانشمندان قرار گرفته‌اند، مشکلات قابل توجهی است که بیوفیلم‌ها در پزشکی و صنعت ایجاد کرده‌اند. آنها بر روی سطوح بیمارستان‌ها باقی می‌مانند و موجب آلودگی و بیماری‌های ناشی از آن می‌گردند [3-2].

فن‌آوری مدرن امکان استفاده از وسایل جدید پزشکی که در بدن به کار می‌روند (ایمپلنت، لنزهای چشمی، دریچه‌های مصنوعی قلب، کاتتر و ...) را فراهم کرده است. باکتری‌های مختلف که توانایی تشکیل بیوفیلم را دارند به این وسایل متصل می‌شوند و عفونت ایجاد می‌کنند. آزاد شدن این باکتری‌ها به درون خون باعث یک عفونت منتشره می‌شود که درمان آن به واسطه وجود بیوفیلم مشکل است، چون دفاع میزبان و درمان دارویی را با اختلال روبرو می‌کند [4]. استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس به طور فرصت طلب عفونت‌های بیمارستانی یا اکتسابی ایجاد می‌کند که نوع بیمارستانی آن خطر بیشتری برای بیماران دارد. این باکتری توانایی ایجاد بیوفیلم بر روی وسایل، سطوح و تجهیزات پزشکی را دارد [1] و سبب ایجاد عفونت در مبتلایان به دیالیز، اندوکاردیت (عفونت لایه داخلی قلب) به ویژه در بیماران مبتلا به نقص‌های دریچه قلب یا سپتی سمی در بیماران بستری در بیمارستان می‌شود. آنتی‌بیوتیک انتخابی برای درمان ونکومایسین به همراه ریفامپین یا آمینوگلیکوزید است، اما مشکل استفاده از آنتی‌بیوتیک‌ها مقاوم شدن باکتری به آنتی‌بیوتیک‌ها مانند پنی‌سیلین، آموکسی‌سیلین و متی‌سیلین می‌باشد [1]. بنابراین نیاز به روش‌های جدید درمانی برای مبارزه با استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس است. گسترش علم نانوتکنولوژی در دهه‌ گذشته، فرصت‌هایی را برای کشف اثرات ضدمیکروبی نانوذرات فلزی فراهم آورده است [5].

نانومواد جایگاه ویژه‌ای در پزشکی به خصوص در تشخیص و درمان بیماری‌های گوناگون دارند. آنتی‌بیوتیک‌ها، تنها تعداد بسیار کمی از عوامل مسبب بیماری‌های مختلف را از بین می‌برند، در حالی که با استفاده از نانوذرات می‌توانیم طیف وسیعی از باکتری‌ها را از بین ببریم. نقره در ابعاد بزرگتر فلزی خاصیت واکنش‌دهی کمی دارد، ولی زمانی که به ابعاد کوچکتر در حد نانومتر تبدیل می‌شود، خاصیت میکروب‌کشی آن افزایش می‌یابد، به همین دلیل در پزشکی به بررسی اثرات آن اهمیت داده می‌شود [6]. استفاده از نقره کلوئیدی اولین بار توسط lee در سال 1889 برای پزشکی به کار گرفته شد. در جنگ جهانی اول از نقره برای پانسمان زخم و به عنوان ماده ضد عفونی کننده استفاده می‌شد، اما بعدها پنی‌سیلین جایگزین آن شد. در حدود 1000 سال پیش از میلاد مسیح، نقره برای تصفیه آب آشامیدنی و در حدود سال 1700 میلادی، نیترات نقره برای بهبود بیماری‌های مقاربتی و بزاقی استفاده شده است [8-7].

با توجه به مطالعات پیشین مبنی بر وجود خاصیت ضدمیکروبی نانوذرات نقره بر آن شدیم تا اثراین نانوذرات را بر رشد باکتری استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و بیوفیلم ناشی از آن، مورد مطالعه قرار دهیم.

مواد و روش‌ها

در این مطالعه مقطعی تجربی، آزمایشات بر روی 13 ایزوله استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس غیر تکراری و متناوب که از نمونه‌های پوست، خون و ادرار بیماران بستری در بخش‌های مختلف بیمارستان 17 شهریور شهر مشهد در سال 1392 جمع آوری شده بودند، انجام گرفت. باکتری‌ها بر اساس مورفولوژی کلنی، مورفولوژی میکروسکوپی و آزمایشات بیوشیمیایی افتراقی شامل کاتالاز، کواگولاز، تخمیر مانیتول، DNase، حساسیت به نووبیوسین مورد شناسایی قرار گرفتند. در این تحقیق از یک سویه استاندارد استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس (12228 (ATTC نیز استفاده شد.

نانوذره نقره با قطر میانگین 20 نانومتر به صورت محلول کلوئیدی از شرکت Nanosunny (ساخت کشور آمریکا) در مشهد خریداری و قطر نانوذرات توسط میکروسکوپ الکترونی اندازه‌گیری و از سوسپانسیون نانوذره رقت‌های سری آماده شد.

آزمایشات حداقل غلظت ممانعت کننده از رشد (MIC) و حداقل غلظت کشنده (MBC) نانوذرات در محیط مولر هینتون آگار با روش Agar dilution مطابق با استانداردهای CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) انجام شد. سوسپانسیون نانوذرات نقره با غلظت‌های مختلف تهیه و به محیط مذاب Cº45 در چاهک‌های میکروپلیت 24 خانه‌ای از جنس پلی استیرنی اضافه شد. طوری که غلظت نانوذره در چاهک‌ها 0، 50، 100، 150، 200، 250، 300، ... ، ppm 800 بود. به هر چاهک 10 میکرولیتر از سوسپانسیون استاندارد باکتریایی تلقیح شد. رشد و عدم رشد باکتری در غلظت‌های مختلف نانوذره بعد از گذشت 24 ساعت گرمخانه‌گذاری در دمای Cº37 تعیین گردید. برای تعیین MBC، از سطح چاهک‌های فاقد رشد به پلیت‌های فاقد نانوذرات تلقیح و در گرمخانه Cº37 به مدت 24 ساعت قرار داده شد. تشکیل کلنی بر سطح پلیت، زنده بودن باکتری‌ها را تأیید می‌کند و عدم تشکیل کلنی باکتری نشان می‌دهد که باکتری در آن غلظت (MBC) کشته شده است. برای اطمینان، آزمایشات سه بار تکرار شدند.

در ابتدا توانایی تشکیل بیوفیلم توسط هر کدام از 13 ایزوله بالینی و همینطور سویه استاندارد با روش اصلاح شده میکروتیتر پلیت بررسی شد [9]. از جمله اصلاحات انجام شده، استفاده از آب مقطر برای شستشو به جای فسفات بافر نمکی و زمان گرمخانه‌گذاری بیشتر بود. برای این منظور به تمام چاهک‌های میکروپلیت 96 خانه‌ای، 180 میکرولیتر محیط تریپتون سوی براث یا TSB (Tryptone Soy Broth) و سپس به هر چاهک 10 میکرولیتر آب مقطر استریل اضافه شد. در نهایت به هر چاهک 10 میکرولیتر از سوسپانسیون خالص باکتریایی با 01/0= OD 620 (Optical Density) اضافه گردید، طوری که حجم محتویات هر چاهک 200 میکرولیتر شد. از چاهک‌های ردیف اول به عنوان شاهد منفی (بلانک) استفاده شد که حاوی فقط 200 میکرولیتر محیط کشت TSB بدون باکتری بود. سپس میکروپلیت 24 ساعت در گرمخانه Cº37 قرار گرفت. بعد از گذشت 24 ساعت میکروپلیت از گرمخانه خارج و محتویات آن به آرامی‌خالی شد و چاهک‌ها سه بار با آب مقطر شسته شدند. برای تثبیت بیوفیلم از 200 میکرولیتر اتانول 95% به مدت 15 دقیقه و برای رنگ‌آمیزی از 200 میکرولیتر سافرانین 025/0% به مدت 10 دقیقه استفاده شد. بعد از خالی کردن محتویات چاهک‌ها، میکروپلیت چندین بار با آب مقطر شست و شو و در نهایت خشک گردید. 200 میکرولیتر اسید استیک گلاسیال 33% به عنوان حلال اضافه گردید و بعد از گذشت 15 دقیقه جذب چاهک‌ها توسط دستگاه الایزاریدر در طول موج 492 نانومتر خوانده شد. آزمایش برای جدایه استاندارد و هر کدام از باکتری‌ها سه بار تکرارگردید.

اثرات ضد بیوفیلمی نانوذرات کلوئیدی نقره با روش میکروتیتر پلیت اصلاح شده بررسی شد [9]. برای این منظور ابتدا به تمام چاهک‌های میکروپلیت 96 خانه‌ای 180 میکرولیتر از محیط TSB و سپس به هر چاهک 10 میکرولیتر از رقت‌های سری نانوذرات کلوئیدی نقره اضافه گردید. در نهایت به هر چاهک 10 میکرولیتر از سوسپانسیون خالص باکتریایی (01/0=OD620) تلقیح شد. طوری که حجم هر چاهک 200 میکرولیتر و غلظت نانوذرات کلوئیدی نقره در چاهک‌ها به ترتیب 10، 20، 40، 80 و ppm 160 بود. چاهک‌های ردیف اول به عنوان شاهد حاوی 180 میکرولیتر محیط کشت TSB، 10 میکرولیتر سوسپانسیون باکتریایی و 10 میکرولیتر آب مقطر استریل و چاهک‌های بلانک فقط حاوی 200 میکرولیتر محیط TSB و فاقد باکتری بودند. بعد از این که میکروپلیت به مدت 24 ساعت در انکوباتور Cº37 قرار گرفت، باکتری‌ها مشابه روش قبلی تثبیت و رنگ آمیزی شدند. آزمایش‌ها سه بار تکرار و پس از خواندن جذب، میانگین داده‌ها مقایسه شد.

برای بررسی اثر نانوذرات نقره بر بیوفیلم تشکیل شده ابتدا به تمام چاهک‌های میکروپلیت 96 خانه‌ای، 180 میکرولیتر از محیط TSB و سپس 10 میکرولیتر سوسپانسیون باکتریایی با غلظت استاندارد اضافه شد. میکروپلیت به مدت 24 ساعت در گرمخانه Cº37 قرار گرفت و از چاهک‌های شاهد نیز استفاده شد. بعد از گذشت 24 ساعت میکروپلیت از گرمخانه خارج و به هر چاهک 10 میکرولیتر از رقت‌های سوسپانسیون کلوئیدی نقره اضافه گردید. غلظت‌های نهایی در هر چاهک با غلظت 160، 200، 250، 300، 350 و ppm 400 بود. بعد از گذشت 3 ساعت محتویات میکروپلیت به آرامی خارج و چاهک‌ها سه بار با آب مقطر شست و شو شدند [10]. بعد از تثبیت محتویات چاهک‌ها با اتانول و رنگ آمیزی با سافرانین، مشابه روش‌های قبلی، جذب رنگ حل شده در اسید استیک توسط دستگاه الایزاریدر در طول موج 492 نانومتر خوانده شد. این آزمایش نیز برای هر باکتری سه بار تکرار و میانگین‌ها در نظر گرفته شدند.

در این تحقیق از آماره‌های توصیفی میانگین، انحراف معیار و نمودار برای توصیف داده‌ها استفاده شد و داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 20 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. اختلاف بین مقادیر OD و میانگین‌ها با استفاده از آنالیز واریانس یکطرفه (ANOVA) مقایسه شدند و سطح معنی داری در آزمون‌ها 05/0 در نظر گرفته شد.

نتایج

نتایج حاصل از آزمایش‌های مورفولوژی و بیوشیمیایی مختلف بر روی ایزوله‌ها نشان داد که باکتری‌های جدا شده، استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس بودند.

حداقل غلظت مهارکننده رشد (MIC) نانوذره کلوئیدی نقره برای سویه استاندارد ppm 100 بود که در این غلظت اثر باکتریواستاتیک داشت و در غلظت‌های بالاتر، ppm 400، اثر باکتری کشی داشت. MIC و MBC برای ایزوله‌های بیمارستانی استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس به ترتیب 6/434 و ppm 5/738 بود که در مقایسه با سویه استاندارد مقادیر آنها بیشتر بود. همچنین، MBC نانوذرات نقره از MIC بیشتر است که نشان می‌دهد نانوذرات کلوئیدی نقره در غلظت MIC فقط از رشد باکتری‌ها ممانعت می‌کنند و در غلظت‌های بالاتر باکتری را می‌کشند.

آزمایش توانایی تشکیل بیوفیلم در ایزوله‌های بالینی و سویه استاندارد استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس از طریق اندازه گیری جذب نوری توسط دستگاه الایزاریدر بعد از گذشت 24 ساعت مورد سنجش قرار گرفت و نتایج به دست آمده در جدول 1 دسته بندی شد.

جدول 1- جذب نوری (OD) باکتری های استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس به دنبال تشکیل بیوفیلم بعد از 24 ساعت

شاهد

انحراف معیار ± میانگین

تکرار سوم

تکرار دوم

تکرار اول

باکتری

325/0

0015/0±718/0

715/0

719/0

720/0

سویه استاندارد

324/0

0015/0±743/0

745/0

740/0

744/0

ایزوله1

325/0

0017/0±614/0

612/0

618/0

614/0

ایزوله2

327/0

0011/0±581/0

579/0

581/0

583/0

ایزوله3

327/0

0008/0±572/0

573/0

574/0

571/0

ایزوله4

326/0

0120/0±706/1

700/1

730/1

690/1

ایزوله5

325/0

0018/0±486/0

489/0

488/0

483/0

ایزوله6

324/0

0026/0±084/1

085/1

080/1

089/1

ایزوله7

323/0

0020/0±404/0

401/0

405/0

408/0

ایزوله8

326/0

0023/0±963/0

960/0

963/0

968/0

ایزوله9

327/0

0015/0±406/0

407/0

408/0

403/0

ایزوله10

324/0

0008/0±897/0

896/0

898/0

899/0

ایزوله11

323/0

0012/0±682/0

683/0

684/0

680/0

ایزوله12

321/0

0023/0±684/0

685/0

688/0

680/0

ایزوله13

همانطور که در جدول 1 مشاهده می‌شود، ایزوله‌های شماره 6، 8 و 10 نسبت به سایر ایزوله‌ها بیوفیلم ضعیف تری در طی 24 ساعت تشکیل دادند، ولی در مدت 48 و 72 ساعت یعنی زمان بیشتر بیوفیلم بیشتری تشکیل دادند. میانگین جذب نوری بعد از 48 ساعت، برای ایزوله‌های 6، 8 و 10 به ترتیب 0014/0±686/0، 0027/0±702/0 و 0017/0±726/0 و بعد از 72 ساعت برای همین ایزوله‌ها به ترتیب 0035/0±885/0، 0023/0±884/0 و 0014/0±966/0 بود.

تشکیل بیوفیلم در حضور غلظت‌های مختلف نانوذرات
نقره بررسی شد. میانگین جذب نوری (OD) در طول موج 492 نانومتر پس از سه بار تکرار آزمایشات سنجش توانایی نانوذرات در ممانعت از تشکیل بیوفیلم در جدول 2 نشان داده شده است. همانطور که جدول 2 نشان می‌دهد، جذب نوری به دنبال افزایش غلظت نانوذره در چاهک‌ها در مقایسه با کنترل مثبت کم شده که نشان دهنده آن است که میزان تشکیل بیوفیلم در حضور نانوذره کاهش یافته است. نمودار 1 نشان می‌دهد با افزایش غلظت نانوذره نقره اثر ضد بیوفیلمی آن نیز افزایش می‌یابد.

جدول 2- میانگین جذب نوری (OD) باکتری‌های استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس به دنبال تشکیل بیوفیلم در حضور غلظت‌های مختلف نانوذرات محلول کلوئیدی نقره

                                                    غلظت نانوذره نقره (ppm)

استافیلوکوکوس

اپیدرمیدیس

4

2

1

5/0

کنترل مثبت

کنترل منفی

402/0

662/0

696/0

706/0

717/0

321/0

سویه استاندارد (ATCC=12228)

356/0

537/0

637/0

725/0

744/0

325/0

ایزوله1

396/0

483/0

593/0

603/0

615/0

323/0

ایزوله2

385/0

396/0

559/0

573/0

581/0

325/0

ایزوله3

366/0

466/0

543/0

555/0

573/0

332/0

ایزوله4

107/1

222/1

333/1

527/1

700/1

333/0

ایزوله5

360/0

394/0

402/0

472/0

488/0

331/0

ایزوله6

754/0

987/0

007/1

068/1

085/1

320/0

ایزوله7

355/0

356/0

372/0

398/0

406/0

324/0

ایزوله8

590/0

798/0

889/0

943/0

964/0

328/0

ایزوله9

366/0

364/0

371/0

390/0

406/0

325/0

ایزوله10

501/0

694/0

741/0

877/0

895/0

331/0

ایزوله11

369/0

375/0

600/0

664/0

683/0

331/0

ایزوله12

380/0

382/0

449/0

580/0

597/0

333/0

ایزوله13

032/0±477/0

040/0±580/0

041/0±664/0

045/0±719/0

0458/0±732/0

0007/0±327/0

انحراف‌‌‌معیار±میانگین

AWT IMAGE

نمودار 1- اثر غلظت‌های مختلف نانوذرات کلوئیدی نقره بر تشکیل بیوفیلم باکتری‌های استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس

برای سنجش توانایی نانوذرات در از بین بردن بیوفیلم تشکیل شده بعد از تشکیل بیوفیلم به مدت 24 ساعت، چاهک‌ها به مدت 3 ساعت با غلظت‌های مختلف نانوذرات تیمار شدند. نتایج نشان داد محلول کلوئیدی نانوذرات نقره در غلظت‌هایی که توانایی مهار تشکیل بیوفیلم را دارند، نمی‌توانند بیوفیلم تشکیل شده را از بین ببرند، بلکه در غلظت‌های بالاتر (بالاتر از ppm 150)، بیوفیلم تشکیل شده را از بین می‌برد. با افزایش غلظت نانوذره، اثر ضد بیوفیلمی آن افزایش داشت و اختلاف جذب نوری برای غلظت‌های مختلف به تفکیک ایزوله‌ها معنی دار بود (01/0p<).

AWT IMAGE

نمودار 2- اثر غلظت‌های مختلف نانوذرات کلوئیدی نقره بر بیوفیلم تشکیل شده‌ باکتری‌های استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس بر اساس میزان جذب نوری

غلظت‌های ppm 150، ppm 200، ppm 250 و ppm 300 به ترتیب باعث کاهش درصد OD به میزان 1/2%، 5%، 2/8% و 12% شد. نمودار 2 اثر غلظت‌های مختلف نانوذره را بر بیوفیلم تشکیل شده نشان می‌دهد.

بحث

نانوذرات نقره به دلیل خواص ضد میکروبی بی‌نظیر و سمیت کم برای سلول‌های پستانداران به یکی از رایجترین نانوذرات در محصولات مصرفی تبدیل گشته‌اند‌‌. در میان نانومواد دارای خاصیت ضدمیکروبی، نانوذرات نقره به صورت گسترده استفاده می‌شوند. این ذرات به عنوان عوامل ضد میکروبی در بیش از 100 محصول مصرفی از مکمل‌های غذایی گرفته تا پوشش دهندگان سطوح به کار رفته‌اند [11].

در پژوهش حاضر اثر نانوذرات نقره در جلوگیری از تشکیل بیوفیلم استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج به خوبی نشان داد نانوذرات کلوئیدی نقره می‌توانند مانع تشکیل بیوفیلم این باکتری شوند. نانوذره نقره در غلظت ppm 5/0≤ مانع تشکیل بیوفیلم شد و در غلظت‌های بالاتر (ppm 150≤) توانست بیوفیلم تشکیل شده را از بین ببرد.

محققین در بررسی اثر آنتی‌بیوتیک‌های کینولونی بر بیوفیلم‌‌های تولید شده بوسیله سویه‌های استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس جدا شده از بیماران مبتلا به عفونت ادراری دریافتند که این باکتری‌ها در حالت بیوفیلم مقاومت بیشتری نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها دارند [12]. Chaudhari و همکارانش نشان دادند نانوذرات نقره با میانگین قطر 39 نانومتر و غلظت mM 1 می‌توانند سبب کاهش تشکیل بیوفیلم ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس شوند [13].

Shahrokh و همکارش تأثیر محلول کلوئیدی نانوذرات نقره را بر تشکیل بیوفیلم استافیلوکوکوس اورئوس مورد مطالعه قرار دادند. آنها گزارش کردند محلول کلوئیدی نانوذره نقره، در غلظت نهایی  ppm2 می‌تواند تشکیل بیوفیلم این باکتری را کاهش دهد [14]. نتایج آنها مشابه با پژوهش حاضر است که محلول کلوئیدی نانوذره نقره در غلظت نهایی  ppm4-2 توانست باعث کاهش تشکیل بیوفیلم باکتری استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس شود.

در تحقیقی دیگر بیوفیلم تشکیل شده باکتری‌های استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و سودوموناس آئروژینوزا با غلظت‌های مختلف نانوذرات نقره به مدت 2 ساعت تیمار گردید و محققین گزارش کردند که نانوذره نقره در غلظت 100 نانومولار توانایی از بین بردن بیوفیلم تشکیل شده این باکتری‌ها را دارد [15].

Kim گزارش کرد که نانوذرات نقره با قطر حدود 20 نانومتر می‌توانند مانع رشد استافیلوکوکوس اورئوس شوند و MIC نانوذرات را 33 نانومولار گزارش کردند [16]. Niakan و همکاران، MIC و MBC نانوذرات نقره کلوئیدی با قطر کمتر از 100 نانومتر را برای سودوموناس آئروژینوزا به ترتیب 10 و ppm 500 و MIC و MBC را برای استافیلوکوکوس اورئوس برابر و حدود ppm 10 گزارش کردند [17]. در پژوهش حاضر حداقل غلظت نانوذرات کلوئیدی نقره با قطر 20 نانومتر که مانع رشد استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس شد، برای سویه استاندارد ppm 100 و برای ایزوله‌های بالینی ppm 6/434 بود و در این غلظت‌ها نانوذره اثر باکتریواستاتیک داشت.

همانطور که نتایج تحقیق حاضر و سایر تحقیقات نشان می‌دهد، نانوذرات نقره اثرات ضد باکتریایی علیه باکتری استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس دارند. اختلاف در مقادیر MIC و MBC می‌تواند مربوط به قطر نانوره، غلظت و نوع آن باشد. هر نوع از مواد نانو با توجه به ویژگی‌هایی مانند اندازه، شکل، نوع ترکیب سورفکتانت، پایدار کننده و روش تهیه منحصر به خود هستند و این ویژگی‌های نانوذرات بر خاصیت ضدمیکروبی آنها اثر دارد. در منابع مختلف اثر ضد باکتریایی نانوذرات نقره به ناپایدار کردن پتانسیل غشایی (که نتیجه آن کاهش سطح آدنوزین تری‌فسفات درون سلولی است)، اتصال به گروه‌های عاملی پروتئین‌ها (از بین رفتن خواص اصلی پروتئین‌ها و آنزیم‌ها)، نفوذ به درون سلول‌ها، غیر فعال کردن آنزیم‌ها و تولید هیدروژن پراکسید و در نهایت مرگ باکتری نسبت داده شده است. نانوذرات نقره  خصوصیات ضد باکتریایی بارزی را نسبت به سایر نمک‌های نقره از خود نشان می‌دهند که به دلیل سطح بالای آنها می‌باشد که تماس مؤثرتری را با میکروارگانیسم برای آن‌ها فراهم می‌آورد [19-18]. نانوذرات نقره با چسبیدن به سلول باکتری، تشکیل بیوفیلم را به تأخیر می‌اندازند که این عمل باعث می‌شود گروهی از باکتری‌ها نتوانند تثبیت شوند و تکثیر یابند. تشکیل کلونی، رشد سلول باکتری و تشکیل ماتریکس‌های بیوفیلمی فشرده میکروبی، باکتری‌ها را در مقابل سیستم دفاعی میزبان مقاوم می‌کند که نانوذرات از تشکیل این عوامل دفاعی میکروب در برابر سیستم ایمنی میزبان جلوگیری می‌کنند. نانوذرات آنزیم‌ها و DNA باکتری‌ها را غیر فعال می‌نمایند [22-20].

با توجه به مطالب ذکر شده می‌توان نانوذرات نقره را جایگزین مناسبی برای از بین بردن باکتری‌های موجود در بیوفیلم در نظر گرفت. نانوذرات کلوئیدی نقره توانایی مهار تشکیل بیوفیلم استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس را دارند و می‌توان پیشنهاد داد که از این ترکیبات در تهیه روکش‌های پروتزها و وسایل مصنوعی که در بدن تعبیه می‌شوند و یا پوشاندن سطوح حساس برای ایجاد بیوفیلم‌های میکروبی در بیمارستان‌ها و مراکز درمانی استفاده شود. مهمترین محدودیت این تحقیق محدودیت زمانی بود.

نتیجه‌گیری

نتایح تحقیق حاضر نشان داد نانوذرات کلوئیدی نقره
می‌تواند از تشکیل بیوفیلم باکتری استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس جلوگیری نماید و در غلظت‌های بالاتر توانایی از بین بردن بیوفیلم از قبل تشکیل شده را دارد.

تشکر و قدردانی

این مطالعه در دانشکده علوم دانشگاه آزاد اسلامی مشهد انجام شده است که بدین وسیله از مسئولین محترم این دانشگاه تشکر و قدردانی می‌شود.

References

[1] Cargill JS, Upton M. Low concentration of vancomycin stimulate biofilm formation in some clinical isolates of Staphylococcus epidermidis. J Clin Pathol 2010; 62(12): 1112-6.

[2] Otto M. Staphylococcus epidermidis - the ‘accidental’ pathogen. Nat Rev Microbiol 2009; 7(8): 555-67.

[3] Fey PD, Olson ME. Current concepts in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. J Future Microb 2010; 5(6): 917-33.

[4] Darabi N, Roudbar Mohammadi S, Naderi Manesh H, Mostafai A, Vahidi M. Antifungal effect of Zinc oxide nanoparticles of the standard strains of Candida albicans biofim growth on catheters. Journal of Army University of Medical Sciences I.R.Iran 2012; 10(3): 207-12. [Farsi]

[5] Blinova I, Ivask A, Heinlaan M, Mortimer M, Kahru A. Ecotoxicity of nanoparticles of CuO and ZnO in natural water. J Environ Pollut 2010; 158(1): 41-7.

[6] Chen X, Schluesener HJ. Nanosilver: A nanoproduct in medical application. Toxi Lett 2008; 176(1): 1-12.

[7] Schmid G. Nanoparticles from theory to application, Wiley-VCH Verlag GmbH and Co. KGaA, Weinheim, 2004; 192-4.

[8] Rai M, Yadav A, Gade A. Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials. Biotechnol Adv 2009; 27(1): 76-83.

[9] Saderi H, Owlia P, Hashemi S. The Effect of essential oil of Matricaria chamomilla L. on biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa. Iran J Med Microbiol 2007; 1(2):9-14. [Farsi]

[10] Pompilio A, Pomponio S, Di Vincenzo V, Crocetta V, Nicoletti M, Piovano M, et al. Antimicrobial and antibiofilm activity of secondary metabolites of lichens against methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains from cystic fibrosis patients. Future Microbiol 2013; 8(2): 281-92.

[11] Li Q, Mahendra S, Lyon DY, Brunet L, Liga MV, Li D, et al. Antimicrobial nanomaterials for water disinfection and microbial control: Potential applications and implications. Water Res 2008; 42(18): 4591-602.

[12] Tavakkoli M, Soudi M, Malekzadeh F, Hajy Zarghany G. Effects of quinolones on biofilm formed by Staphylococcus epidermidis isolated from patients with urinary tract infection. Iran J Med Microbiol 2008; 2(1): 23-30. [Farsi]

[13] Chaudhari PR, Masurkar SA, Shidore VB, Kamble SP. Effect of biosynthesized silver nanoparticles on Staphylococcus aureus biofilm quenching and prevention of biofilm formation. Nano-Micro Lett 2012; 4(1): 34-9.

[14] Shahrokh S, Emtiazei G. A comparative study of the effects of colloidal nanosilver and industrial biocide E-265 on bacterial respiration and biofilm formation using microtiterplate method. J Water Wastewater 2013; 24 (85): 26-33. [Farsi]

[15] Kalishwaralal K, BarathManiKanth S, Pandian SR, Deepak V, Gurunathan S. Silver nanoparticles impede the biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus epidermidis. Colloids Surf B 79(2): 340-4.

[16] Kim JS. Antibacterial activity of Ag+ ion-containing silver nanoparticles prepared using the reduction method. Ind J Eng Chem Res 2007; 13(4): 718-22.

[17] Niakan M, Abassi F, Hamedi R, Aliasghar E. Antibacterial effect of nanosilver colloidal particles and its omparison with dental disinfectant solution against two strains of bacteria. Daneshvar Medicine 2012; 19(96): 65-72 [Farsi]

[18] Feng QL, Wu J, Chen GQ, Cui FZ, Kim TN, Kim JO. A mechanistic study of the antibacterial effect of silver ions on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. J Biomed Mater Res 2000; 52(4): 662-8.

[19] Mirjalili M, Yaghmaei N, Mirjalili M. Antibacterial properties of nano silver finish cellulose fabric. J Nanostructure Chem 2013; 3:43.  

[20] Imani S, Zagari Z, Rezaei-Zarchi S, Zand A, Dorodiyan M, Bariabarghoyi H, et al. Antibacterial effect of CrO and CoFe2O4 nanoparticles upon Staphylococcus aureus. JFUMS (J Fasa Univ Med Sci) 2011; 1(3): 175-81. [Farsi]

[21] Jons GL, Muller CT, O'Reilly M, Stickler DJ. Effect of triclosan on the development of bacterial biofilms by urinary tract pathogens on urinary catheters. J Antimicrob Chemother 2006; 57(2): 266-72.

[22] Schrand AM, Rahman MF, Hussain SM, Schlager JJ, Smith DA, Syed AF. Matal-based nanoparticles and their toxicity assessment. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol 2010; 2(5): 544-68.


 

Study of the Effect of Silver Nanoparticles on Biofilms Formation by Staphylococcus epidermidis

H. Mortazavi[4], M. Nakhaei Moghaddam [5], Kh. Nejad Shahrokhabadi[6]

Received: 25/06/2014      Sent for Revision: 20/10/2014      Received Revised Manuscript: 15/02/2015     Accepted: 08/04/2015

Background and Objective: Staphylococcus epidermidis produces extracellular polysaccharide which is known as a biofilm. Biofilm is highly effective in establishing of this bacterium infections and can be formed on medical devices that are used in the body. The purpose of this study was to evaluate the effects of silver colloidal nanoparticles on bacterial growth and biofilm formation of Staphylococcus epidermidis.

Materials and Methods: In this empirical and cross-sectional study, experiments were performed on 13 clinical isolated specimens of Staphylococcus epidermidis and a reference strain (ATCC 12228). The minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration (MBC) of nanoparticles were determined by the agar dilution method. The experiments of biofilm formation were done by micro titer plate method and stained by Safranin. Data were analyzed using ANOVA.

Results: The mean MIC and MBC of nanoparticles for clinical isolated specimens were 350 ± 19.61 ppm and 707.69 ± 64.05 ppm, respectively and nanoparticles had bacteriostatic effect at low concentrations . Nanoparticles showed the anti-biofilm activity at the concentration of 0.5 ppm and this effect enhanced with increasing concentration up to 4 ppm. Nanoparticles at higher concentrations of 150 ppm had the ability to eliminate the pre-formed biofilm.

Conclusion: The results showed that colloidal silver nanoparticles have the ability to inhibit the S. epidermidis biofilm formation. It is offered to use these compounds to coat prosthetic devices which are placed in the body or to cover environmental surfaces in medical centers.

Key words: Staphylococcus epidermidis, Biofilm, Micro titer plate

Funding: This research was funded personally.

Conflict of interest: None declared.

Ethical approval: This research was conducted in accordance with ethical principles on clinical specimens.

How to cite this article: Mortazavi H, Nakhaei Moghaddam M, Nejad Shahrokhabadi Kh. Study of the Effect of Silver Nano particles on Biofilms Formation by Staphylococcus Epidermidis. J RafsanjanUniv Med Sci 2015; 14(2): 125-36. [Farsi]

 

[1]- دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه زیست شناسی، واحد دامغان، دانشگاه آزاد اسلامی، دامغان، ایران

[2]- (نویسنده مسئول) استادیار،گروه زیست‌شناسی، واحد مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی، مشهد، ایران

    تلفن: 38435050-051، دورنگار: 38435050-051، پست الکترونیکی: m.nakhaei@mshdiau.ac.ir

[3]- استادیار، گروه زیست‌شناسی، واحد مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی، مشهد، ایران

[4]- MSc Student, Dept. of Microbiology, Damghan Branch, Islamic Azad University, Damghan, Iran

[5]- Assistant Prof., Dept. of Biology, Mashhad Branch, Islamic Azad University, Mashhad, Iran

   (Corresponding Author) Tel: (051) 38435050, Fax: (051) 38435050, E-mail: m.nakhaei@mshdiau.ac.ir

[6]- Assistant Prof., Dept. of Biology, Mashhad Branch, Islamic Azad University, Mashhad, Iran

نوع مطالعه: پژوهشي | موضوع مقاله: ميكروبيولوژي
دریافت: ۱۳۹۳/۳/۲۲ | پذیرش: ۱۳۹۴/۱/۱۹ | انتشار: ۱۳۹۴/۲/۲۲

ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
کد امنیتی را در کادر بنویسید

ارسال پیام به نویسنده مسئول


کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق

© 2015 All Rights Reserved | Journal of Rafsanjan University of Medical Sciences

Designed & Developed by : Yektaweb