مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

مقاله پژوهشی

مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

دوره 15، خرداد 1395، 222-209

بررسی آزمایشگاهی اثر ضد باکتریایی عصاره اتیل‌استاتی جلبک دریایی قرمز (Gelidiella acerosa) بر برخی باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی

مصطفی غفاری[1]، علی طاهری[2]، مریم زبیدی‌نژاد[3]

دریافت مقاله: 18/8/94      ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 6/10/94    دریافت اصلاحیه از نویسنده: 4/2/95        پذیرش مقاله: 15/2/95

چکیده

زمینه و هدف: امروزه افزایش استفاده بی‌رویه از آنتی‌بیوتیک‌ها سبب ایجاد فرم مقاوم باکتری‌ها شده است. لذا یافتن ترکیبات ضد میکروبی فعال زیستی مورد توجه محققان است. هدف از این مطالعه بررسی آزمایشگاهی اثر ضد میکروبی عصاره اتیل‌استاتی جلبک دریایی قرمز (Gelidiella acerosa) بر برخی باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی می‌باشد.

مواد و روش‌ها: در این مطالعه آزمایشگاهی، پس از نمونه‌برداری، عصاره اتیل‌استات جلبک دریایی قرمز در 4 غلظت 10 تا 80 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بر روی 3 گونه باکتری گرم مثبت Lactoccocus garviae، Listeria monocytogenes، Staphylococcus aureus و 4 گونه باکتری گرم منفی Escherchia coli، Kelbsiella pneumoniae،Proteus vulgaris،Photobacterium damselae  به روش انتشار نفوذی و با اندازه‌گیری ‌هاله عدم رشد بررسی و نتایج با 2 آنتی‌بیوتیک استاندارد مقایسه گردید. در این مطالعه آزمون حداقل غلظت بازدارندگی (Minimum Inhibitory Concentration; MIC) به روش رقت‌های متوالی انجام شد. جهت مقایسه میانگین بین گروه‌ها از آنالیز واریانس یک طرفه و جهت مقایسه میانگین گروه‌ها از آزمون دانکن (Duncan) استفاده شد.

یافته‌ها: در این مطالعه، باکتریK. pneumoniae  حساسیت بیشتری نسبت به عصاره جلبکی با قطر ‌هاله عدم رشد 33/1±50/12 میلی‌متر در غلظت 80 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر از خود نشان داد، این مقدار دارای اختلاف معنی‌دار با آنتی‌بیوتیک تتراسایکلین و سایر غلظت‌ها بود (05/0p<). اما نسبت به آنتی‌بیوتیک نئومایسین اختلاف معنی‌داری نشان نداد (05/0 p>).

نتیجه‌گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که عصاره اتیل‌استاتی جلبک دریایی قرمز در شرایط آزمایشگاهی اثر بازدارندگی بیشتری بر میکروارگانیسم‌های K.pneumoniae،E.coli ، L.garviae  و P.damselae  دارد.

واژه‌های کلیدی: اثر ضد باکتریایی، عصاره اتیل‌استاتی، جلبک دریایی قرمز

مقدمه

با توجه به محدودیت‌های استفاده از آنتی‌بیوتیک‌ها و افزایش فرم مقاوم میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا، گرایش به جایگزینی آن‌ها با مواد طبیعی و ارزان‌تر را تقویت نموده است. هم‌چنین پتانسیل بالای ضد میکروبی، ضد قارچی و ضد ویروسی ارگانیسم‌های دریایی رویکرد تازه‌ای را برای دستیابی به ضد میکروب‌های جدید موجب شده است. جلبک‌ها منبع غنی از ترکیبات فعال بیولوژیکی به شمار رفته و مهم ترین منابع ترکیبات ضد میکروبی دریایی محسوب می‌شوند [1].

جلبک‌ها به 3 شاخه اصلی سبز (Clorophyta)، قهوه‌ای (Phaeophyta) و قرمز (Rhodophyta) تقسیم می‌شوند [2]. ترکیبات شیمیایی جلبک‌های دریایی به گونه، منطقه جغرافیایی، فصل و درجه حرارت آب وابسته است. جلبک‌های دریایی به طور گسترده‌ای در پزشکی، صنایع غذایی، صنایع شیمیایی و صنایع آرایشی و بهداشتی مورد استفاده قرار می‌گیرند. به منظور استفاده بهتر از جلبک‌های دریایی، محققان در تلاش برای جدا کردن ترکیبات با ارزش از آنها هستند و علاقه رو به رشدی برای پیدا کردن مواد نگه‌دارنده طبیعی برای مواد غذایی و سایر محصولات فاسد شدنی وجود دارد [3].

علاوه بر این، تحقیقات بر روی جلبک‌های دریایی ماکرو (Macroalgae) نشان داده است که عصاره این گیاهان دریازی قابلیت‌های فراوانی از جمله خواص آنتی‌اکسیدان [4]، ضد زخم [5]، ضد سرطان [6]، ضد قارچ [7]، آنتی‌پروتوزئوا [8]، آنتی‌ویروس ]9] و ضد میکروبی [10] دارند.

هم‌چنین، جلبک‌های دریایی به عنوان منبع اصلی در مواد غذایی، رنگدانه‌ها و پلی ساکاریدهای سولفاته شناخته شده‌اند [11]. آن‌ها هم‌چنین حاوی ترکیبات شیمیایی متنوعی از جمله آلکالوئیدها، فلانوئیدها، فنل‌ها، ساپونین، استرول‌ها، تری پنوئیدها، قندها، گلیکوزیدها، کوئین، تانن و رنگدانه‌های فتوسنتزی مانند کلروفیل و کاروتنوئیدها می‌باشند [12]. در مقایسه با گیاهان خشکی‌زی و غذاهای حیوانی، برخی جلبک‌های دریایی سرشار از امگا 3، اسیدهای چرب ضروری، مواد معدنی، اسیدهای آمینه و ویتامین‌های A، B، C و با خواص ضد میکروبی می‌باشند که می‌توانند رشد برخی از میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا و مخمرها را مهار کنند [11].

تاکنون مطالعات بسیاری در زمینه خواص ضد باکتریایی جلبک‌های دریایی انجام شده است از جمله مطالعاتی در این زمینه بر جلبک‌های قرمز، سبز و قهوه‌ای بر باکتری‌های گرم مثبت، گرم منفی و قارچ‌ها توسط Taskin [13]، Osman [14]،Jeynathi Rebecca  [15]، Sangeetha [16] و همکاران آن‌ها انجام شده است و نتایج قابل‌توجهی مشاهده شده است. از بین مطالعات انجام شده مطالعه‌ای که توسط El-sheekh و همکاران انجام شد نتایج قابل‌توجهی به دست آمد. در این مطالعه جلبک‌های قرمز مورد مطالعه، بالاترین خواص ضد باکتریایی ثبت‌شده، مربوط به Sarcodiotheca furcata در مقابل باکتری گرم منفی Shigella flexneri با قطر ‌هاله عدم رشد 33 میلی‌متر بوده است [17].

هم‌چنین در مطالعه‌ای که توسط Chandrasekaran و همکاران در این زمینه انجام شد، از حلال‌های متفاوتی از جمله هگزان، کلروفرم، اتیل‌استات، استون و متانول
 

استفاده شد و نتایج نشان داد که عصاره اتیل‌استاتی جلبک‌های قهوه‌ای S.wightii و S.marginatum بالاترین فعالیت ضد باکتریایی را در مقابل Enterococcus faecalis از خود نشان دادند [18].

هم‌چنین، Rhimou و همکاران مطالعه‌ای بر روی اثر ضد باکتریایی 26 گونه جلبک دریایی قرمز بر برخی باکتری‌های گرم مثبت و برخی باکتری‌های گرم منفی انجام دادند. عصاره متانولی H.musciformi بالاترین حد مهاری را از خود نشان داد. از این 26 گونه جلبک مورد مطالعه، 25 گونه (96%) فعالیت ضد باکتریایی را نشان دادند. به علاوه، نتایج به دست آمده نشان داد که عصاره‌های جمع‌آوری شده در فصل بهار نسبت به فصل زمستان فعال‌تر بودند [19].

سویه‌های باکتریایی در مطالعه حاضر، باکتری‌های گرم مثبت Listeria monocytogenes وStaphylococcus aureus به ترتیب عامل مهمی‌از مسمومیت‌های غذایی و عفونت‌های موضعی هم‌چون کورک، آبسه و غیره به صورت التهاب شدید همراه با درد می‌باشد [20]. باکتری Lactococcus garviae، باکتری گرم مثبت و عامل اصلی بیماری‌زا در آبزیان محسوب می‌شود و باعث سپتی‌سمی ‌فوق حاد در ماهی‌ها همراه با علائمی ‌چون تیرگی بدن، اگزوفتالمی، شنای غیرعادی، خون‌ریزی در بدن و اطراف چشم می‌باشد [21].

هم‌چنین، باکتری‌های گرم منفی Escherichia coli، Klebsiella pneumoniae،Proteus vulgaris ، باسیل‌های گرم منفی روده‌ای می‌باشند و در پزشکی اهمیت دارند [20] و نیز، Photobacterium damselae  از فراوان‌ترین باکتری‌ها در آب‌های سطحی و شور بوده و همه جا پراکنده است و یکی از عوامل بیماری‌زای ماهی و انسان به حساب می‌آید [22].

سواحل چابهار منبع غنی از جلبک‌های دریایی سبز، قرمز و قهوه‌ای بوده که در فصول مختلف، قابل بهره برداری می‌باشند. جلبک قرمز Gelidiella acerosa از جلبک‌های سواحل صخره‌ای جنوب ایران می‌باشد. رنگ جلبک ارغوانی تیره، افراشته، سفت و سیمی ‌است. محل رویش در قسمت‌های میانی محدوده بین جزر و مدی روی سطح بستر‌های صخره‌ای و اغلب در مکان‌های کم‌عمق و موج‌خیز است [2]. متأسفانه در کشور ایران مطالعات کمی ‌در زمینه خواص زیست فعال این منابع ارزشمند صورت گرفته است و مطالعات زیست‌فناوری در این زمینه ضروری می‌باشد. لذا هدف از این مطالعه، بررسی اثرات ضد باکتریایی جلبک قرمز (Gelidiella acerosa) سواحل جزر و مدی چابهار در مقابل 3 گونه باکتری گرم مثبت Listeria monocytogenes،Lactoccocus garviae  وStaphylococcus aureus  و 4 گونه باکتری گرم منفی Escherchia coli، Klebsiella pneumonia ،Proteus vulgaris  و Photobacterium damselae بود.

مواد و روش‌ها

برای انجام این مطالعه آزمایشگاهی، ابتدا نمونه‌برداری از جلبک قرمزGelidiella acerosa  (از شاخه Rhodophyceae ) در فصل پاییز سال 1393 از منطقه جزر و مدی سواحل چابهار انجام گردید و با همکاری سازمان علوم تحقیقات چابهار شناسایی شد. نمونه‌های جمع‌آوری شده در کیسه‌های نایلونی حاوی مقدار کمی ‌آب دریا نگه‌داری و سپس به آزمایشگاه فرآوری محصولات شیلاتی دانشگاه دریانوردی و علوم دریایی چابهار منتقل شدند. مقداری از نمونه‌ها نیز جهت شناسایی و تأیید نهایی در یخچال درون کیسه‌های نایلونی در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگه‌داری شد.

ابتدا جلبک‌ها را کاملاً شسته و عاری از شن و ماسه و جانداران اپی‌فیت گردیدند. سپس درون آون با دمای 60 درجه سانتی‌گراد به مدت یک روز خشک و توسط آسیاب برقی کاملا ًپودر شدند [23].

عصاره‌گیری به روش غوطه‌وری 10 درصد جرمی‌-حجمی‌ با استفاده از حلال اتیل‌استات (Merck 100864 Germany) به ترتیب زیر انجام پذیرفت. ابتدا 20 گرم از پودر خشک توزین و به ارلن مایر 250 سی سی منتقل شد. سپس 200 میلی‌لیتر اتیل‌استات به آن افزود شد و پس از تکان دادن به مدت 48 ساعت در تاریکی نگه‌داری گردیدند. هر 16 ساعت محتویات ارلن به مدت 25 دقیقه هم زده شد و در پایان محتویات ارلن به وسیله کاغذ صافی واتمن شماره 1 (ساخت واتمن انگلستان) صاف و مایع صاف شده در دستگاه تبخیرگر چرخان تحت خلاء (RE300B Rotary شرکت تجهیز گستر ایران) در دمای 50 درجه سانتی‌گراد عصاره گیری گردید. ابتدا اپندروف‌ها را به طور جداگانه توزین کرده و پس از آن به مقدار 10، 20، 40، 80 میلی‌گرم عصاره جلبک مورد نظر نیز به طور جداگانه در اپندروف‌های توزین شده، به وسیله ترازوی دیجیتالی (KIA BL 2000) توزین گردید و با 1 میلی‌لیتر حلالDMSO  (Germany Merck 116743) مخلوط گردید. سپس عصاره جلبکی به همراه حلال DMSO به وسیله دستگاه ورتکس (Vortex شرکت دلتا ایران) یکنواخت شد [24]. غلظت‌های 10، 20، 40 و 80 میلی‌گرم/میلی‌لیتر تهیه گردید [25].

سویه‌های باکتریایی مورد استفاده در این پژوهش شامل باکتری گرم مثبت L.monocytogenes (PTCC1163)، S.aureus (PTCC1431) وLactoccocus garvieae  (PTCC No.1403) و هم‌چنین باکتری‌های گرم منفیE.coli  (PTCC1763)، (GenBank database No.KF529965) Photobacterium damselae، P.vulgaris (PTCC1182) و Klebsiella pneumoniae (PTCC1290) بود که از مرکز کلکسیون قارچ و باکتری ایران (سازمان پژوهش‌های علمی‌و صنعتی ایران) و دامپزشکی شهرستان چابهار خریداری و تهیه شد.

برای بررسی اثرات باکتریایی از آزمون حساسیت ضد میکروبی (تست آنتی‌بیوگرام) به روش اصلاح شده انتشار دیسک و آزمون کمّی‌ حداقل غلظت بازدارنده به روش رقت‌های متوالی استفاده گردید. سوسپانسیون باکتریایی مورد استفاده در آزمون‌های آنتی‌بیوگرام مطابق با استاندارد 5/0 مک فارلند از کشت‌های یک روزه شامل Muller-Hinton Agar بود [26].

در روش انتشار دیسک پس از تلقیح باکتریایی (کشت سطحی سوسپانسیون باکتریایی به وسیله سوآب استریل) روی محیط آگار، دیسک‌های آماده بلانک محصول شرکت پادتن طب (ساخت کشور ایران) به فاصله حداقل 25 میلی‌متر از یکدیگر و از لبه پلیت، به وسیله پنس استریل روی سطح محیط کشت Muller-Hinton Agar قرار گرفتند. سپس مقدار 18 میکرولیتر از عصاره استریل با غلظت‌های مشخص روی دیسک بلانک توسط سمپلر چکانده شد. سپس پلیت‌ها را به مدت 30 دقیقه برای پیش انتشار درون یخچال (AL-145RE ساخت کشور ژاپن) با دمای 4 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. بعد از گذشت این زمان، در مرحله بعد پلیت‌ها را به انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت منتقل شدند. پس از گذشت 24 ساعت قطر‌ هاله‌های عدم رشد اطراف دیسک توسط کولیس ورنیه دیجیتالی (16EWRi Mahr ساخت آلمان) اندازه گیری و ثبت شد [27].

به منظور کنترل نتایج آزمون از آنتی‌بیوتیک‌های تجاری نئومایسین (Ne 30µg) و تتراسایکلین (Tet30µg) پادتن طب به‌عنوان کنترل مثبت و DMSO به عنوان کنترل منفی استفاده شد. آزمون‌های حساسیت ضد باکتریایی به روش انتشار دیسک با 3 بار تکرار انجام گردید و از نتایج به دست آمده در هر مرحله میانگین گرفته شد. در این بررسی جهت تعیین حداقل عصاره بازدارنده از روش رقت‌های متوالی در لوله آزمایش برای عصاره جلبکی استفاده شد. برای هر باکتری یک سری لوله آزمایش 9 تایی استفاده شد که در آن 7 لوله برای رقت‌های مختلف، یک لوله شاهد مثبت و یک لوله به‌عنوان شاهد منفی در نظر گرفته شد. به لوله‌های آزمایش 9 میلی‌لیتر محلول آبگوشت مغذی (Nutrient broth) افزوده و استریل شد. بعد از فیلتر کردن عصاره توسط فیلتر میکروبی 22/0 میکرون، مقدار 1000 میکرولیتر از عصاره به لوله شماره 1 اضافه شد و بعد از هموژن کردن آن 1000 میکرولیتر از مایع هموژن شده را برداشته و به لوله شماره 2 منتقل گردید و این کار ادامه یافت و 1000 میکرو لیتر از لوله شماره 7 دور ریخته شد. به همه لوله‌ها به غیر از شاهد منفی 20 میکرولیتر از کشت رقیق شده در محیط مایع (کشت رقیق شده با کشت استاندارد شده با 5/0 مک فارلند) به تمام لوله‌های آزمایش افزوده شد. همه لوله‌ها به مدت 24 ساعت و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. پس از آن لوله‌ها از نظر کدورت ناشی از رشد باکتری‌ها بررسی شدند. آخرین لوله‌ای که هیچ کدورتی در آن دیده نشد به‌عنوان حداقل غلظت ممانعت کنندگی رشد (Minimum Inhibitory Concentration; MIC) در نظر گرفته شد. از همه لوله‌های فاقد کدورت رشد جهت تعیین (Minimum Bactericidal Concentration; MBC) حداقل غلظت کشندگی عصاره جلبک Gelidiella acerosa به روش پورپلیت کشت داده شد و آخرین غلظتی از عصاره که قادر به مرگ 9/99 درصد از باکتری‌های اولیه بود به‌عنوان حداقل غلظت کشندگی میکروارگانیسم‌ها در نظر گرفته شد. کلیه آزمایش‌ها در 3 بار تکرار صورت گرفت [28].

به منظور تجزیه و تحلیل داده‌ها از نرم‌افزار آماری SPSS نسخه 21 استفاده گردید. داده‌های حاصل از 4 غلظت متفاوت از عصاره اتیل‌استاتی جلبک دریایی قرمز بر برخی باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی مورد بررسی با 3 تکرار، با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (One- way ANOVA) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. همچنین برای بررسی اختلاف میانگین زوج گروه‌ها از آزمون دانکن (Duncan) در سطح معنی‌داری 05/0 استفاده شد.

نتایج

نتایج تست آنتی‌بیوگرام در جدول 1 آورده شده است. عملکرد ضد باکتریایی عصاره اتیل‌استاتی جلبک دریایی قرمز بر باکتری‌های گرم منفی Escherichia coli، Klebsiella pneumoniae وابسته به غلظت بوده و با افزایش غلظت عصاره افزایش معنی‌داری در فعالیت ضد باکتریایی مشاهده شده است. در این مطالعه آزمایشگاهی در روش انتشار دیسک در آگار باکتری گرم منفی Klebseilla pneumoniae حساسیت بیشتری نسبت به عصاره جلبکی، با قطر ‌هاله عدم رشد 33/1±50/12 میلی‌متر در غلظت 80 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر از خود نشان داد که در مقایسه با نتایج آنتی‌بیوتیک نئومایسین، عصاره جلبکی از تأثیر نسبتاً بالایی برخوردار می‌باشد. در صورتی که در مقایسه با نتایج آنتی‌بیوتیک تتراسایکلین، اختلاف معنی‌داری را از خود نشان داد (05/0p<). هم‌چنین نتایج اثرات ضد باکتریایی عصاره اتیل‌استاتی جلبک مورد مطالعه بر باکتری E.coli نیز اختلاف معنی‌داری با آنتی‌بیوتیک‌های تتراسایکلین و نئومایسین از خود نشان داد. عصاره اتیل‌استاتی جلبک دریایی قرمز Gelidiella acerosa هیچ تأثیری بر باکتری‌های Stapylococcus aureus، Listeria monocytogens و Proteus vulgaris از خود نشان نداد. هم‌چنین، باکتری‌های اخیر نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های استاندارد تتراسایکلین و نئومایسین مقاوم بودند. بر اساس نتایج،  عصاره اتیل‌استاتی جلبک Gelidiella acerosa روی باکتری‌های Photobacterium damselae و Lactococcus garviae بیشترین قطر‌ هاله عدم رشد را در غلظت 40 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر نشان داد (05/0p>) که به ترتیب معادل 32/1±50/9 و 57/0±66/9 میلی‌متر بود (جدول 1).

جدول 1- مقایسه میانگین قطر‌ هاله عدم رشد (بر حسب میلی‌متر) برخی باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی و آنتی‌بیوتیک‌های استاندارد در حضور عصاره اتیل‌استاتی جلبک Gelidiella acerosa

داده‌های جدول به صورت انحراف معیار ± میانگین گزارش شده است.

• علامت (-) نشان دهنده عدم وجود فعالیت ضد باکتری عصاره اتیل‌استاتی جلبک دریایی قرمز می‌باشد.
• حروف غیرمشابه در ستون نشان‌دهنده تفاوت معنی‌دار میان اثر ضد میکروبی در غلظت‌های مختلف می‌باشد.
• نتایج با استفاده از روش آنالیز واریانس یک طرفه (One-way ANOVA)تجزیه و تحلیل گردید. هم‌چنین برای بررسی اختلاف میانگین زوج گروه‌ها از آزمون دانکن (Duncan) در سطح معنی‌داری 5 0/0 استفاده شد.

هم‌چنین در مورد باکتری E.coli، بیشترین قطر ‌هاله عدم رشد مربوط به غلظت 40 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر با قطر‌ هاله عدم رشد 11/2±56/10 میلی‌متر بود که در مقایسه با آنتی‌بیوتیک‌های استاندارد تتراسایکلین و نئومایسین دارای اختلافی معنی‌دار (05/0p<)، اما در سایر غلظت‌ها فاقد اختلاف معنی‌دار بود ( جدول 1).

هم‌چنین، حداقل غلظت ممانعت‌کنندگی (MIC) عصاره اتیل‌استاتی جلبک دریایی قرمز Gelidiella acerosa برای باکتری‌های مورد آزمون 08/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر مشاهده شد. در باکتری‌های Staphylococcus aureus،Listeria monocytogens و Proteus vulgaris نیز مقدار حداقل غلظت ممانعت‌کنندگی، 08/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر مشاهده شد. همان‌گونه که در جدول 1 مشاهده می‌شود در روش انتشار دیسک در آگار، باکتری‌های S.aureus، P.vulgaris و L.monocytogens مقاوم بودند و‌ هاله عدم رشدی مشاهده نشد اما حداقل غلظت مهارکنندگی 08/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر را از خود نشان دادند. هم‌چنین حداقل غلظت کشندگی (MBC) عصاره اتیل‌استاتی جلبک دریایی قرمز Gelidiella acerosa بر تمام باکتری‌های مورد آزمون 08/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بود.

بحث

مصرف روز افزون داروهای شیمیایی باعث ایجاد خودایمنی و عوارض جانبی دیگر می‌گردد که از خود بیماری خطرناک‌تر است [29]. امروزه به دلیل تغییر فرم مقاومتی باکتری‌های بیماری‌زا و مقاوم شدن آن‌ها به آنتی‌بیوتیک‌های معمول، گرایش به سمت جایگزینی آن‌ها با آنتی‌بیوتیک‌های نوین می‌باشد [30]. جلبک‌های دریایی متابولیت‌های ثانویه‌ای تولید می‌کنند که در گیاهان خشکی‌زی وجود ندارد [31]. در سال‌های اخیر، فرآورده‌هایی با منشاء گیاهی که دارای اثر ضد میکروبی می‌باشند، به شدت مورد توجه قرار گرفته‌اند [32].

در این مطالعه عصاره اتیل‌استاتی جلبک دریایی قرمز Gelidiella acerosa، بیشترین تأثیر را بر باکتری Klebsiella pneumoniae از خود نشان داد. تأثیر مثبت عصاره جلبکی برEscherchia coli ، Photobacterium damsella وLactoccocus garviae  نیز به خوبی در غلظت 40 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر مشاهده شد. باکتری‌های L.monocytogenes، Proteus vulgaris وS.aureus  نیز نسبت به عصاره جلبکی مقاوم بودند و‌ هاله عدم رشد مشاهده نشد.

نتایج مطالعه Kandhasamy و همکارش نشان داد عصاره متانولی جلبک قرمزGracillaria folifera  هیچ اثر بازدارندگی روی رشد E.coli ندارد [24]؛ در صورتی که در تحقیق حاضر، عصاره اتیل‌استات جلبک مورد نظر بر روی این باکتری اثر بازدارندگی نسبتاً خوبی را در غلظت‌های مختلف نشان داد که در این مورد می‌توان گونه جلبک، روش عصاره‌گیری و فصول سال را مؤثر دانست [33].

هم‌چنین نتایج به‌دست آمده در ارتباط با اثر عصاره اتیل‌استاتی جلبک‌های قرمز Gelidiella acerosa در عدم رشد باکتری S.aureus با بررسی انجام شده توسطBouhla  و همکاران بر روی خواص ضد باکتریایی جلبک‌های قرمز Gelidiella attenatum ، Gelidiella spinullosum و Hypneme muciformis، مطابقت نداشت [34]. در تحقیق فوق، بالاترین قدرت مهاری عصاره متانولی جلبک‌های قرمز روی باکتری‌های مورد مطالعه، مربوط به S.aureus بوده است در حالی که در مطالعه حاضر هیچ فعالیت مهاری بر روی این باکتری مشاهده نشد که در این رابطه، مقاومت باکتریایی و فعالیت متابولیکی جلبک و گونه جلبک را می‌توان مؤثر دانست. تنوع در فعالیت ضد باکتریایی را می‌توان به روش استخراج، حلال و فصلی که در آن نمونه‌ها جمع‌آوری شده‌اند، نیز نسبت داد.

Rosalin و همکاران از متاتول، اتیل‌استات، استون و هگزان برای عصاره‌گیری استفاده کردند. نتایج بررسی آنها نشان داد که عصاره استونی به دست آمده از جلبک‌های مورد نظر اثر ضد باکتریایی بیشتری نسبت به عصاره‌های دیگر دارد [35].Lavanya  و همکارش نشان دادند که برخی از ترکیبات فعال از جمله ترکیبات نیتروژنی عصاره جلبکی، توسط حلال اتیل‌استات فعالیت مهاری کمی‌ بر برخی پاتوژن‌ها دارد [36].

Salem و همکاران اثر ضد باکتریایی عصاره متانولی و اتیل‌استاتی 8 گونه از جلبک‌های دریایی را مورد بررسی قرار دادند و نتیجه گرفتند که عصاره متانولی نسبت به اتیل‌استات تأثیر بیشتری دارد [37]. Varier و همکاران برای عصاره‌گیری از اتانول، متانول و کلروفرم استفاده کرده و بیان کردند که در بین این حلال‌ها، عصاره متانولی بهترین نتایج را برای هر دو باکتری گرم مثبت و گرم منفی نشان می‌دهد [38].

با وجودی که حلال اتیل‌استات در مطالعات انجام شده قدرت مهاری کمی ‌داشت اما در مطالعه حاضر نتایج نسبتاً خوبی حاصل گردید که با نتایج مطالعات Omar و همکاران مطابقت نداشت. در تحقیق مذکور، حداکثر فعالیت بیولوژیکی عصاره اتیل‌استات جلبک سبز Entermorpha prolifera در برابر MRSA (Methicillin Resistant Staphyliococcus Arueus) با قطر‌ هاله عدم رشد 25 میلی‌متر بود که به دلیل حضور بسیاری از ترکیبات فعال از جمله هیدروکسیل اسیدهای چرب، گلیکولیپید، استروئیدها، فنولیک و ترپنوئیدها می‌باشد [3]. در صورتی که در مطالعه حاضر باکتری مذکور مقاوم بود و در مقابل عصاره جلبک دریایی قرمز هیچ فعالیتی از خود نشان نداد.

Peymani و همکاران اثر ضد باکتریایی و ضد‌ قارچی جلبک قرمز Gracillaria arcuata جمع‌آوری شده از سواحل چابهار را بر برخی پاتوژن‌های بیماری‌زا مورد مطالعه قرار دادند.

در بررسی آن‌ها از اتانول جهت عصاره گیری استفاده شد که در پایان نتایج خوبی را علیه هر دو باکتری گرم مثبت S.aureus (PTCC1431)،L.monocytogenes  (PTCC1163) و گرم منفی، P.vulgaris (PTCC1182) و V.cholerae از خود نشان داد. اما اثر آن بر باکتری گرم منفی E.coli (PTCC1763) نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های استاندارد کمتر بود [39]. بر خلاف انتظار، در تحقیق حاضر عصاره اتیل‌استاتی علیه باکتری E.coli نتایج نسبتاً خوبی را در پی داشت و نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های تجاری اختلاف معنی‌داری از خود نشان داد که برای این اختلاف می‌توان روش عصاره‌گیری و فصل جمع‌آوری نمونه جلبکی را مؤثر دانست.

در مورد حداقل غلظت کشندگی در مطالعه حاضر باید عنوان نمود با توجه به پیش تیمار انجام شده جهت خشک کردن عصاره به دست آمده، مشخص شد بر خلاف روش‌های معمول برای خشک کردن عصاره گیاهان دارویی خشکی‌‌زی، انجام تیمار گرمایی می‌تواند خاصیت ضد باکتریایی جلبک‌های دریایی را کاهش دهد که این مسئله شاید به دلیل شکستن ساختار بیوشیمیایی ماده فعال ضد باکتری عصاره در اثر تیمار گرمایی باشد. بر این اساس عصاره جلبک را بدون خشک کردن و تنها با استفاده از فیلتر میکروبی 22/0 میکرون و تلقیح با محیط کشت مایع (Nutrient broth) از نظر حداقل غلظت کشندگی مورد بررسی قرار گرفت [40] و مشخص شد با افزایش غلظت عصاره، تعداد کلنی باکتریایی به شدت کاهش یافت به طوری که در باکتری‌های P.damselae، K.pneumoniae، E.coli و L.garviae در غلظت 08/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر کلنی باکتریایی مشاهده نشد. بر این اساس در صورتی که امکان خشک کردن عصاره با روشی غیر از تیمار گرمایی، مانند خشک کردن تحت خلاء، صورت گیرد، میزان حداقل کشندگی قابل بررسی دقیق‌تر خواهد بود [40].

محدودیت مهم در این مطالعه، کار با میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا بود که این امر با در نظر گرفتن شرایط ایمنی مرتفع گشت. در این مطالعه آزمایشگاهی اثر ضد میکروبی جلبک دریایی قرمز بررسی گردید تا بتوان اطلاعات کامل‌تری از خواص یک گونه از جلبک‌های دریایی را فراهم آورد. لذا پیشنهای می‌شود در مطالعات آتی درباره اثر ضد میکروبی جلبک مورد مطالعه بر گونه‌های بیشتری از میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا و  مقایسه اثر ضد میکروبی عصاره‌های حاصل از روش‌های مختلف عصاره‌گیری بررسی ‌شود. در ادامه لازم است مطالعات بیشتری در شرایط آزمایشگاه انجام شود و به شناسایی و خالص‌سازی ترکیبات ضد باکتریایی مؤثر پرداخت. بر همین اساس پیشنهاد می‌شود با استفاده از انواع دیگر حلال‌ها مانند استون، متانول، هگزان و کلروفرم برای عصاره‌گیری، فعالیت ضد باکتریایی این جلبک مورد مطالعه بیشتر قرار گیرد.

نتیجه‌گیری

با توجه با نتایج به دست آمده، می‌توان گفت که افزایش غلظت عصاره اتیل‌استاتی جلبک دریایی قرمز Gelidiella acerosa، اثر بیشتری بر باکتری‌های K.pneumoniae و L.garviae دارد. هم‌چنین مشاهده شد عصاره اتیل‌استاتی جلبک مورد مطالعه بر باکتری‌های K.pneumoniae و L.garviae عملکردی مشابه به آنتی‌بیوتیک نئومایسین و تتراسایکلین از خود نشان داد که می‌توان با تحقیقات بیشتر جایگزینی برای برخی از آنتی‌بیوتیک‌های معمولی باشد.

تشکر و قدردانی

نویسندگان از دانشگاه دریانوردی و علوم دریایی چابهار به جهت تسهیل در دسترسی به امکانات آزمایشگاهی و آقای مهندس ‌زاد عباس شاه‌آبادی کارشناس محترم آزمایشگاه دانشکده علوم دریایی این دانشگاه به خاطر همکاری علمی‌ تشکر و قدردانی می‌نمایند.

References

[1] Silva GC, Albuquerque-Costa R, Oliveira-Peixoto JR, Pessoa-Nascimento FE, Macedo-Carneiro PB, Fernandes-Vieira RHS. Tropical Atlantic marine macroalgae with bioactivity against virulent and antibiotic resistant Vibrio. Lat Am J Aquat Res 2013; 41(1): 183-8.

[2] Qaranjic BM, Rouhani Qadikalaee K. Atlas of Marine algae of Persian Gulf and Oman Sea coasts. Tehran: Ira. Ins. Fisheries Research, Scientific Information Management. 2009 [Farsi]

[3] Omar HH, Shiekh HM, Gumgumjee NM, El-kazan MM, El-Gendy AM. Antibacterial activity of extracts of marine algae from the Red Sea of Jeddah, Saudi Arabia. Afr J Biotechnol 2012; 11(71): 13576-85.

[4] Lekameera RV, Somasundaram S. Evaluating antioxidant property of brown alga Colpomenia sinuosa(DERB. ET SOL). Afr J Food Sci 2008; 2: 126-30.

[5] Mori J, Hayashi T, Iwashima M, Matsunaga T, Saito H. Effects of plastoquinones from the brown algae Sargassum micracanthum and a new chromene derivative converted from the plastoquinons on acute gastric lesions in rats. Bio pharm Bull 2006; 29: 1197-201.

[6] Ly B, Buu N, Nhut N, Thinh P, Van T. Studies on fucoidan and its production from vietnamese brown seaweeds. Asean J Sci Tech Dev 2005; 22: 371-80.

[7] Zheng Y, Chen Y, Lu H. Screening for antibacterial and antifungal activites in some marine algae from the fujian coast of china with threedifferent solvents. Chin J Oceanol Limnol 2001; 19: 327-31.

[8] Genovese G, Tredone L, Hamann M, Morabito M. The mediterranean red alga Asparagopsis: A source of compounds against Leishmania. Mar Drugs 2009; 7: 361-6.

]9] Zandi k, Salimi M, Sartavi K. In vitro antiviral activity of the red marine alga from persian Gulf, Gracilaria salicornia against herpes simplex virus type2. J Biol Sci 2007; 7: 1274-7.

[10] Nagayama K, Iwamura Y, Shibata T, Hirayama I, Nakamura T. Bactericidal activity of Phlorotannins from the brown alga Ecklonia kurome . J anti chem 2002; 50: 889-93.

[11] Mendez M, Pereira R, Sousa Pinto I, Carvalho A, Gomes A. Antimicrobial activity and lipid profle of seaweed extracts from the North Portuguese Coast. Int F Res J 2013; 20(6): 3337-45.

[12] Seenivasan R, Rekha M, Indu H, Geetha S. Antibacterial activity and phytochemical analysis of selected Seaweeds from Mandapam Coast, India. J App phar Sci 2012; 2(10): 159-69.

[13] Taskin E, Ozturk M, Kurt O. Antibacterial activities to some marine algae from the Aegean Sea (Turkey). Afr J Biotechnol 2007; 6(24): 2746-51.

[14] Osman M, Abushady A, Elshobary M. In vitro screening of antimicrobial activity of extracts of some macroalgae collected from Abu-Qir Bay, Alexandria, Egypt. Afr J Biotechnol 2010; 9(12): 7203-8.

 [15] Jeynathi Rebecca L, Dhanalakshmi V, Sharmila S. Effect of the extract of Ulva sp on pathogenic microorganisms. J Che Phar Res 2012; 4(11): 4875-8.

[16] Sangeetha S, Dhayanithi NB, Sivakumar N. Antibacterial activity of Sargassum longifolium and Gracilaria corticata from Gulf of Mannar against selected common shrimp pathogens. Int J phar Bio Sci 2014; 5(2): 76-82.

[17] El-Sheekh MM, Gharieb MM, El-Sabbagh SM, Hamza WT. Antimicrobial Efficacy of some marine Macroalgae of Red Sea. Int J Micr Imm Res 2014; 3(3): 21-8.

[18] Chandrasekaran M, Venkatesalu V, Raj GA. Antibacterial activity of selected Marine Macro algae against Vancomycin resistant Enterococcus faecalis. J Coa Li Medi 2014; 2(12): 940-6.

[19] Rhimou B, Hassane R, Jose M, Nathalie B. The antibacterial potential of the seaweeds (Rhodophyceae) of the Strait of Gibraltar and the Mediterranean Coast of Morocco. Afr J Biotechnol 2010; 9(38): 6365-72.

[20] Brooks GF, Corroll K, Butel JS, Morse S A. Jawetz Melnick and Adelberg's Medical microbiology 2007: 24 th Edition.

 [21] Rafiee pour A, Mirzargar SS, Soltani M, Mousavi HAE, Mostafavi SA. The antibacterial Effects of Cuminum cyminum L. and Rosmarinus officinalis Extracts and Essential Oil against Loctococcus garvieae in Laboratory conditions on Rainbow Trout. Eur J Exper Bio 2014; 4(1): 456-63.

[22] Fouz B, Larse JL, Nielsen B, Barja JL, Toranzo AE. Characterization of Vibrio damsela strains isolated from Turbot Scophthalmus maximus in Spain. Dis Aqu Org 1992;12: 155-66.

[23] Elnabris KJ, Elmanama AA, Chihadeh WN. Antibacterial activity of four marine seaweeds collected from the coast of Gaza Strip, Palestine. Mesopot J Mar Sci 2013; 81-92.

[24] Kandhasamy M, Arunachalam KD. Evaluation of in vitro antibacterial property of seaweeds of southeast coast of India. Afr.J. Biotechnol2008; 7(12): 1958-61.

[25] Taheri A, Seyfan A, Jalalinezhad S, Nasery F. Antibacterial Effect of Myrtus communis Hydro-Alcoholic Extract on some Pathogenic Bacteria. Zah J Res Medi Sci 1391; 47-53. [Farsi]

 [26] Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. Bailey & Scott`s Diagnostic Microbiology. 12th ed. Missouri, Mosby 2007.

[27] Devi KN, Ajithkumar TTP, Kv D, Marudhupandi T, Balasubramanian T. Evaluation of Antibacterial and antioxidant properties from Brown Seaweed, Sargassum wightii (Greville,1848) against Human bacterial pathogens. Int J Pharm Phar Sci 2012; 143-9.

[28] Nagi M, Tanabe K, Takano Y, Kikuchi K, Miyazaki Y, Niimi M. Serum or bile affects the in vitro azole susceptibilities of Candida spp. Jpn J Infect Dis 2009; 62: 306–8.

[29] Mimica-Dukie N, Bugarin D, Grbovic S, Mitic-Culafic D, Vukovic-Gacic B, Orcic D, et al. Essential oil of Myrtus communis L. as a potential antioxidant and antimutagenic Agents. Molecu 2010;15: 2759-70.

[30] Gonzalez del val A, Platas G, Basillio A, Cabello A, Gorrochategui J, Suay I, et al. Screening of antimicrobial activities in red, green and brown macroalgae from Gran Canaria (Canary Island, Spain). Int Microbiol 2001; 4: 35-40.

[31] Blunt JW, Copp BR, Munro MHG, Northcote PT, Prinsep MR. Marine natural products. Natur Prod Report 2006;23: 26-78.

[32] Immanuel G, Vincybai VC, Sivaram V, Palavesam A, Marian MP. Effect of butanolic extracts from terrestrial herbs and seaweeds on the survival, growth and pathogen (Vibrio parahaemolyticus) load on shrimp Penaeus indicus juveniles. Aqu 2004; 236(1-4): 53-65.

[33] Taskin E, Caki Z, Ozturk M, Taskin E. Assessment of in vitro antitumoral and antimicrobial activities of marine algae harvested from the eastern Mediterranean sea. Afr J biotechnol 2010; 9(27): 4272-7.

[34] Bouhla R, Riadi H, Martínez J, Bourgougnon N. The antibacterial potential of the seaweeds (Rhodophyceae) of the Strait of Gibraltar and the Mediterranean Coast of Morocco. Afr J Bio 2010; 9(38): 6365-72.

[35] Rosaline X, Sakthivelkumar S, Rajendran Ks, Janarthanan S. Screening of Selected marine algae from the Coastal Tamil Nadu, South India for Antibacterial Activity . Asi Paci J Tro Biom 2012; 140-6.

[36] Lavanya R, Veerappan N. Antibacterial Potential of Six Seaweeds Collected from Gulf of Mannar of Southeast Coast of India. Adv Bio Res 2011; 5(1): 38-44.

[37] Salem WM, Galal H, Nasr El-deen F. Screening for antibacterial activities in some marine algae from the red sea (Hurghada, Egypt). Afr J Micro Res 2011; 5(15): 2160–7.

[38] Varier KM, Milton MCJ, Arulvasu C, Gajendran B. Evaluation of antibacterial properties of selected red seaweeds from Rameshwaram, Tamil Nadu, India. J Acad Indus Res 2013; 667-70.

[39] Peymani J, Qaraee A, Ghaffari M, Taheri A.
Investigation of antibacterial and antifungal Effect of marine alga Gacialria arcuata from Chabahar Coasts. J Q uni med sci 2014; 8(1): 69-76. [Farsi]

[40] Peymani J, Qaraee A, Ghaffari M, Taheri A. Investigation of antibacterial Effect of aqueous and ethanolic extract of brown alga Sargassum glaucescens from Chabahar Coasts. Sci J Ira Fi 2014; 22(4): 13-21. [Farsi]