جلد 17، شماره 2 - ( 2-1397 )                   جلد 17 شماره 2 صفحات 143-156 | برگشت به فهرست نسخه ها

XML English Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Mohebrad B, Rezaee A, Dehghani S, Zamanian M, Hamedrahmat M. Feasibility of Rhamnolipid Biosurfactant Production from Oily Wastewaters by Pseudomonas aeruginosa Isolated from Hospital Wastewater . JRUMS. 2018; 17 (2) :143-156
URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-3441-fa.html
محب راد بتول، رضایی عباس، دهقانی سمیه، زمانیان معصومه، حامد رحمت مهدی. امکان سنجی تولید بیوسورفکتانت رامنولیپِیدی از فاضلاب روغنی با استفاده از سودموموناس آئروژنزا جداسازی شده از فاضلاب بیمارستانی . مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان. 1397; 17 (2) :143-156

URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-3441-fa.html


استاد دانشگاه تربیت مدرس
متن کامل [PDF 253 kb]   (68 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (306 مشاهده)
متن کامل:   (42 مشاهده)
مقاله پژوهشی
مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان
دوره 17، اردیبهشت 1397، 156-143
 
امکان سنجی تولید بیوسورفکتانت رامنولیپِیدی از فاضلاب روغنی با استفاده از سودموموناس آئروژنزا جداسازی شده از فاضلاب بیمارستانی
 
بتول محبراد[1]، عباس رضایی[2]، سمیه دهقانی[3]، معصومه زمانیان[4]، مهدی حامد رحمت[5]
 
دریافت مقاله:2/9/95 ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح:3/11/95 دریافت اصلاحیه از نویسنده:9/12/96 پذیرش مقاله: 27/12/96
 
 

چکیده
زمینه و هدف: در سال‌های اخیر، تولید و استفاده از ترکیبات با ارزش نظیر بیوسورفکتانت‌ها از فاضلاب با توجه به مزایای زیست محیطی و اقتصادی آن مورد توجه قرار گرفته است. امروزه بیوسورفکتانت­ها­­ی تولیدی میکروارگانیسم­ها با استفاده از منابع کربن مختلف، در صنایع غذایی، دارویی، پتروشیمی، استخراج نفت، تصفیه فاضلاب مورد استفاده می‌گیرند. این مطالعه، با هدف ارزیابی استفاده از فاضلاب­های روغنی به عنوان سوبسترای ارزان­قیمت با استفاده از سویه های سودوموناس آئروژنزا جدا شده از فاضلاب بیمارستانی جهت تولید بیوسورفکتانت‌های رامنولیپیدی انجام شده است.
مواد و روش‌ها: این تحقیق یک مطالعه تجربی و در مقیاس آزمایشگاهی است که در رآکتور ناپیوسته حاوی باکتری بومی جدا شده از پساب فاضلاب های بیمارستانی در محیط معدنی حاوی روغن­های مختلف انجام شده است که روغن کشت در زمان‌ها و غلظت‌های مختلف، با آزمایش­های همولیز، گسترش نفت، انهدام قطره، فعالیت امولسیون­ کنندگی و اکسیژن مورد نیاز شیمیایی، سنجش گردید. در این تحقیق تحلیل‌های آماری بر مبنای ارزیابی‌های گروههای شاهد – تست مطابق با آزمون‌های student T-test انجام شد.
یافته‌ها: نتایج نشان داد که باکتری سودوموناس آئروژنزا جدا شده، توانایی مطلوبی را در تولید بیوسورفکتانت دارد. کاهش کشش سطحی، امولسیون­کنندگی بیش از 70 درصد و کاهش COD (Chemical oxygen demand) به میزان 85 درصد، حاصل استفاده از بیوسورفکتانت جدا شده بود.
نتیجه‌گیری: بر اساس یافته­های این تحقیق، به نظر می رسد فاضلاب­های روغنی حاوی مقادیر بالای مواد آلی، گزینه مناسبی جهت تولید بیوسورفکتانتهای رامنولیپیدی باشند. بیوسورفکتانت‌های تولیدی، بدلیل خاصیت امولسیون­کنندگی مطلوب، می‌توانند به منظور حذف آلاینده‌های دیر تجزیه‌پذیر و فرآیندهای اصلاح زیستی مورد استفاده قرار گیرند.
واژه‌های کلیدی: بیوسورفکتانت رامنولیپیدی، پساب روغن، سودوموناس آئروژنزا، امولسیون کنندگی
 
مقدمه
امروزه تولید محصولاتی نظیر بیوسورفکتانت‌ها از پسماندهای جامد و مایع، یکی از اهداف زیست محیطی است که علاوه بر مزایای اقتصادی، کاهش آلایندگی ناشی از سورفکتانت‌های مصنوعی را نیز به دنبال دارد ]1[. این مواد، در سطوح سلول‌های میکروبی معمولا به شکل خارج سلولی ترشح می‌گردند. باکتری‌ها، مخمرها و قارچ­ها تولیدکنندگان مهم این ترکیبات بوده که مورد علاقه بسیاری از بیو تکنولوژیست­ها می­باشند ]3[.
بیوسورفکتانت­ها دارای گروه­های هیدروفیلی و هیدروفوبی می باشند که مانند ترکیبات فعال سطحی عمل می کنند و بین فازهای مایع با قطب­های متفاوت و پیوندهای هیدروژنی قرار می­گیرند و بر این اساس کشش سطحی و بین سطحی را در این نواحی کاهش می‌دهند. کاربردشان در پنج دهه گذشته به طور وسیعی به جای سورفکتانت­های شیمیایی(کربوکسیلات­ها، سولفونات­ها، استرهای اسیدی سولفات) بالاخص در صنایع غذایی، دارویی و نفتی توسعه یافته است. از کاربردهای مطرح دیگر بیوسورفکتانت‌ها، استفاده در تجزیه ترکیبات و آلاینده‌های نفتی است ]7-4[.
استفاده از بیوسورفکتانت­ها به­جای سورفکتانت­ها در صنایع مختلف مانند نفت و پتروشیمی بدلیل گران بودن فرآیند تولید، توجیه اقتصادی ندارد. یکی از استراتژی‌های رفع این مشکل استفاده از پسماندها و ضایعات صنایع است که به­عنوان یک سوبسترای تجدید‌پذیر و ارزان قیمت مطرح اند. از جمله این مواد می‌توان به پسماندهای صنایع روغن‌کشی، صنایع لبنی و تولید قند، پسماند لیگنو سلولوزی و غیره را نام برد [8].
با توجه به تولید بالای روغن در دنیا در حدود 5/2 تا 3 میلیون تن در سال و همچنین توجه به این نکته که روغن‌های خام یا تصفیه نشده حاوی اسیدهای چرب شامل مونو، دی و تری‌گلیسریدها، فسفانیدها، پیگمان‌ها، توکوفرول‌ها، فلزات کمیاب، آفت کش­ها و صمغ و سایر آلاینده­ها می‌باشد، لذا دفع آن به محیط زیست نگران کننده است. وجود مواد مغذی در این پسماندها باعث شده که امروزه به عنوان یک سوبسترای مناسب برای تولید ترکیبات ثانویه مورد توجه قرار گیرند ]9-10[.
توانایی میکرو ارگانیسم‌ها در تولید بیوسورفکتانت‌ها سبب شده است که میکروارگانیسم­های متنوعی در تولید بیوسورفکتانت­ها مورد توجه قرار گیرند. سودوموناس (باکتری گرم منفی، میله‌ای غیر تخمیری، اکسیداز و کاتالاز مثبت) یکی از این میکروارگانیسم‌هاست که با توجه به توانایی زیاد در استفاده از منابع مختلف کربن در حذف آلاینده‌های زیستی و حضور در بیشتر مکان‌ها مورد توجه خاصی قرار گرفته است. امروزه از این باکتری­ها در مهندسی ژنتیک استفاده می‌شود و نقش بسیار مهمی در فعالیت­های متابولیکی محیط زیست مانند چرخه عناصر و تجزیه آلاینده­های ناشی از فعالیت­های زیستی و غیر زیستی بازی می­کند. چرخه تنفسی این باکتری شامل سیتوکروم­های مختلف و انواع گوناگون اکسیدازهای انتقالی متصل به اکسیژن است که توانایی زیادی به آن داده است. ویژگی دیگر این باکتری این است که قادر به زندگی در هردو شرایط هوازی و بی‌هوازی است [11].
امروزه تحقیقات زیادی در خصوص تولید بیوسورفکتانت­ها به منظورهای متفاوت انجام می­شود ]7-4[. Jain و همکاران تولید بیوسورفکتانت توسط باکتری قلیایی دوست کلبسیلا SP. گونه RJ-03 را با استفاده از منابع مختلف کربن غیرمتعارف پودر و تفاله نیشکر و پوست و پودر سیب مورد بررسی قرار دادند. بیوسورفکتانت تولید شده توسط توسط نیشکر بیشترین ویسکوزیته و حداکثر کاهش کشش سطحی را داشت [12]. همچنین Amani و همکاران، توانایی پسودوموناس آرئوژنوزا را برای تولید بیوسورفاکتات رامنولیپید مورد بررسی قرار دادند. منبع کربن، ساکاروز و منبع نیترات، سولفات آمونیم بود. در این تحقیق 8/2 گرم در لیتر رامنولیپید تولید شد [13].
Franc و همکاران در سال 2015 توسط سویه جدیدی ازباسیلوس سوبتیلیس AC56 جداشده از جنگل‌های حرا با استفاده ازضایعات کشاورزی وصنعتی (گلیسرول، روغن آفتابگردان، آب پنیر وآب سیب، بادام زمینی) به عنوان منبع جایگزین برای تولید بیوسورفکتانت استفاده کردند در این تحقیق گلیسرول بهترین منبع کربن با بازده 1290 میلی‌گرم در لیتر سورفاکتانت خام بود [14].
با توجه به مطالب ذکر شده، در این تحقیق سعی برجداسازی باکتری موجود در پساب فاضلاب­های بیمارستانی با توجه به تحمل شرایط سخت توسط آن­ها است که بتواند در حین تولید بیوسورفکتانت، روغن­های نامحلول­ را نیز حذف نماید. به این منظور باکتری­های موجود در پساب یکی از بیمارستان­ها که به عنوان یک باکتری وحشی که در شرایط سخت به زندگی خود ادامه می‌دهند، جداسازی و تولید بیوسورفاکتانت و حذف روغن توسط آن مورد بررسی قرار گرفت. پس از جداسازی باکتری‌های بومی وحشی بدون خودهی از فاضلاب، توانایی آن‌ها در تولید بیوسورفکتانت مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین پس جداسازی بیوسورفاکتانت از فاضلاب روغنی میزان کاهش بار آلی خروجی بر حسب COD مورد مطالعه قرار گرفت. لذا این مطالعه با هدف امکان سنجی تولید بیوسورفکتانت توسط باکتری­های جدا شده از فاضلاب با بهره‌گیری از فاضلاب‌های حاوی روغن­های متفاوت گیاهی خوراکی و زیتون و صنعتی (مانند روغن خودرو و بنزین) به عنوان سوبسترا، انجام گرفت.
مواد و روش‌ها
این تحقیق یک مطالعه تجربی در مقیاس آزمایشگاهی است که در راکتور ناپیوسته حاوی باکتری سودوموناس آئروژنزا جدا شده از پساب فاضلاب بیمارستانی و در گروه بهداشت محیط دانشگاه تربیت مدرس در سال ....... [j1] انجام شده است. تمام مواد شیمیایی مورد استفاده در این تحقیق عمدتاً از شرکت مرک آلمان با دارای درجه خلوص آزمایشگاهی خریداری شده است.
دستگاه‌های pH متر (Sension 378, HACH)، اسپکتروفتومتر (Ray Leigh UV-9200)، همزن مغناطیسی (ALFA HS-8600)، فورMemert) آلمان)، ترازوی آنالیتیکی (Sartrious, Germany)، دستگاه تنسیومتر (مدلSigma 700 KSV، فنلاند) و سانتریوفوژ (UNIVERSAL 320) از جمله دستگاه‌های مورد استفاده در این تحقیق بودند.
ابتدا، باکتری‌های موجود در پساب فاضلاب بیمارستانی، در محیط­های آگار خون­دار ­کشت داده شدند و سپس بر روی محیط کشت ائوزین متیلن بلو Eosin Methylene Blue Agar (EMB Agar)] [ و لوریا براث Luria Broth (LB)] [ حاوی 5 درصد عصاره مخمر، 10 درصد پپتون و 5 درصد سدیم کلراید در pH حدود 7 و در دمای 30-25 درجه سانتی‌گراد کشت داده شد. باکتری‌های رشد کرده در محیط‌های کشت توسط تست­های بیوشیمیایی ارزیابی و باکتری‌های سودوموناس و باسیلوس شناسایی شدند. جهت نگهداری باکتری‌ها، از محیط کشت پایه حاوی گلیسرول استفاده شد و باکتری‌ها در 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.
جهت تهیه تولید بیوسورفکتانت از محیط کشت از فرمول زیر استفاده شد ]5-1[:
5/2 g/L از NaNO3، 1 g/L از KCl ،1 g/L ازNaCl ، 1/0 g/L از CaCl2، 2/0 g/L ازMgSO4,7H2O ،4 g/L از KH2PO4, ،4 g/L از K2HPO4 و1 g/L yeast extract و 1 میلی‌لیتر عناصر جزئی شامل:
116/0g/L FeSO4,7H2O،23/0 g/L از H3BO3،41/0 g/L از .6H2O CoCl2، 008/0g/L از ,CuSO4,5H2O 008/0 g/L از MnSO4,H2O، 022/0 g/L از [NH4]6Mo7O24 و 174/0 از g/L ازZnSO4 آماده شد.
پس از تنظیم pH بیوسورفکتانت استریل بر روی 7، 100 میلی‌لیتر از آن داخل ارلن مایرهای 250 میلی‌لیتر ریخته شد و به آن درصدهای مختلف (حجمی‌/حجمی) از روغن­های خودرو ، روغن زیتون، روغن خوراکی آفتابگردان و بنزین، به عنوان منبع کربن و 5/2 درصد باکتری آماده شده بوسیله بافر سالین با غلظت نیم مک فارلند افزوده شد و روی شیکر ارلن در دمای آزمایشگاه به مدت 1 تا 6 روز برای تشکیل بیوسورفاکتانت قرار گرفت. هر روز نمونه‌برداری انجام و در این مدت عواملی مانند pH و کدورت پس از انتخاب بهترین منبع کربن غلظت­های 25/0، 5/0 و 1 درصد آن (حجمی‌/حجمی) مورد مطالعه قرار گرفت.
جداسازی سلول­های باکتریایی توسط سانتریفوژ با 5000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه انجام گرفت. سپس جهت حذف هیدروکربن، رسوب ابتدا دو بار با استفاده از استون شسته و سپس توسط آب مقطر برای حذف محیط کشت اضافی شستشو شد. سلول­های جداسازی شده در پلیت ریخته شد و به آن 3 میلی‌لیتر آب مقطر افزوده و در دمای 70 درجه سانتی­گراد به مدت 24 ساعت خشک گردید و وزن خشک آن بر حسب گرم در لیتر بدست آمد. منحنی کالیبراسیون کدورت ایجاد شده توسط باکتری در مدت 6 روز در هر 24 ساعت در
جذب نوری 600 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر ترسیم گردید[15].

پس از آماده­سازی محیط کشت، به ارلن مایرهای حاوی محیط و منبع کربن، 5/2 درصد نیم مک فارلند باکتری سودوموناس که قبلاً بر روی محیط نوترینت آگار غنی‌سازی شده بود افزوده و بر روی شیکر ارلن با دور 150 دور در دقیقه به مدت 6 روز در دمای آزمایشگاه بین 25 تا 30 درجه سانتی­گراد نگهداری گردید و هر 24 ساعت برای بررسی تولید بیوسورفکتانت نمونه‌برداری شد.
به­منظور بررسی تولید بیوسورفکتانت، مایع رویی کشت باکتری توسط دستگاه سانتریفیوژ با دور 5000 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شده و پس از جداسازی باکتری­ها و به کمک چند تست ویژه، توانایی تولید بیوسورفکتانت مورد ارزیابی قرار گرفت. در هر سری از آزمایشات برای هر کدام از منبع کربن­ها یک نمونه بدون باکتری و یک نمونه بدون منبع کربن به منظور کنترل گذاشته شد. به طور معمول گونه­هایی از سودوموناس که توانایی تولید بیوسورفکتانت را دارند، از توانایی ایجاد همولیز نیز بهره‌مند می­باشند. لذا در این پژوهش کلنی خالص باکتری بر روی آگار خون­دار کشت داده شد و فعالیت همولیز آن مورد بررسی قرارگرفت. برای این منظور، مقداری روغن روی سطح لام پخش و پس از یک ساعت 10 میکرولیتر از روماند باکتری به آن اضافه گردید و پس از یک دقیقه شکل قطره با عدسی 10 میکروسکوب نوری بررسی شد.
غلظت بحرانی (Critical Micelle Concentration) غلظتی است که در آن میسل­ها شروع به تجمع می­کنند و در آن سورفاکتانت کم­ترین کشش سطحی را نشان می‌دهد ]16[. در بالای غلظت بحرانی میسل (CMC)، مونومرهای سورفاکتانت به منظور تشکیل میسل تجمع می‌یابند. بسیاری از ویژگی­های سیستم در مقادیر بالاتر از(CMC) بدون تغییر باقی می­ماند، زیرا سورفکتانت مازاد به جای آن­که فعالیت مائی سورفکتانت را افزایش دهد، میسل تولید می‌کند. کشش سطحی محیط کشت عاری از سلول باکتریایی با استفاده از دستگاه تنسیومتر سنجیده شد و میانگین سه بار تکرار برای بالا بردن دقت آزمایش گزارش شد. قبل از هر بار کار با دستگاه لازم است حلقه پلاتینی با آب مقطر شستشو داده شود تا در نتایج خللی ایجاد نشود. کشش سطحی با غوطه‌ور کردن حلقه در محیط کشت عاری از سلول و ثبت نیروی لازم برای خارج کردن حلقه از حد فاصل محیط آبی و هوا در مانیتور دستگاه انجام شد [16].
4 میلی­لیتر از محلول بیوسورفکتانت تولید شده توسط باکتری را با غلظت­های مختلف به 4 میلی لیتر از روغن­های مختلف خوراکی، روغن خودرو، بنزین و نفت خام افزوده و به مدت 3 دقیقه به شدت چرخانده (Vortex) شد و پس از گذشت 24 ساعت فاکتور امولسیون­کنندگی (Emulsification index)  از تقسیم ارتفاع ناحیه سوسپانسیون شده بر مجموع ارتفاع دو سیال محاسبه گردید (معادله 1).
معادله (1)
E24= 
H 24 ارتفاع امولسیون شده پس از 24 ساعت و H ارتفاع کل مایع می‌باشد .
برای تایید تولید بیوسورفکتانت از آزمایش گسترش روغنODA ( Oil displacement area) استفاده شد، آزمایش به این صورت بود که ابتدا 30 میلی‌لیتر آب مقطر درون پلیت ریخته و 50 میکرولیتر نفت و یا انواع روغن به آن افزوده شد. بعد از 1 تا 2 دقیقه لایه یکنواختی بر سطح آب تشکیل می‌شود. 10 میکرولیتر از بیوسورفکتانت تولید شده را به آن افزوده و قطر لایه شفاف سطح لایه رویی پلیت در مقایسه با حجم یکسانی از آب مقطر بررسی می شود. این آزمایش بیان‌گر کارا بودن بیوسورفکتانت تولیدی می‌باشد (معادله 2) :
                 معادله (2)                                                ODA = 3.14 x r2 
از طریق این آزمایش می­توان به میزان پایداری امولسیون ایجاد شده توسط بیوسورفکتانت پی برد ]17[. پس از تلقیح باکتری به محیط کشت حاوی نمک­های معدنی، زمانی جهت رشد باکتری­ها در نظر گرفته می­شود. بدین منظور ارلن­های حاوی باکتری در دما و دور مناسب گرم­خانه­گذاری می­شوند. سپس پایداری و ارتفاع کف تولید شده بررسی می­شود. جهت استخراج بیوسورفکتانت تولیدی، پس از جداسازی باکتری­ها با استفاده از سانتریفیوژ با دور 5000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه، روماند باکتری در ارلن مایر ریخته شد و بوسیله اسید کلریدریک 6 مولار، pH درون ارلن به زیر 2 رسانده شد تا بیوسورفکتانت تولیدی رسوب نماید. سپس به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری گردید و سپس حجم برابر دی کلرومتان به آن اضافه و جداسازی فاز آلی آن در قیف دکانتور انجام شد. پس از تبخیر حلال، ماده عسل مانند که همان رامنولیپید می­باشد، جهت استفاده بعدی در دمای یخچال نگهداری شد. عمل استخراج به صورت سه بار تکرار انجام گرفت  ]18[.
جهت اندازه‌گیری رامنولیپید، منحنی استاندار قند رامنوز در غلظت­های 01/0 تا 09/0 گرم در لیتر رسم گردید. به منظور سنجش قند، 3 میلی‌لیتر از مایع رویی برداشته را با حجم مساوی از حلال دی کلرومتان مخلوط و فاز رویی آلی استخراج گردید ]19[. این عمل به­صورت سه بار تکرار انجام ­شد. حلال را تبخیر و رسوب به­دست آمده را در 3 میلی‌لیتر کربنات سدیم 1/0 مولار حل نموده تا به حجم اولیه برسد. به 2 میلی‌لیتر از محلول آماده شده، 1 میلی‌لیتر فنل 5 درصد و سپس 5 میلی‌لیتر اسید سولفوریک غلیظ اضافه نموده تا تشکیل بخار نمایان شود. سپس محلول را به مدت 10 دقیقه به حالت سکون قرار داده و پس از سرد شدن، جذب نمونه­ها و استانداردها را که به آن اسید و فنل افزوده شده بود، در جذب نوری 480 نانومتر قرائت شد. با استفاده از منحنی کالیبراسیون، غلظت قند که مناسب با رامنولیپید است، به­دست آمد. تحلیل‌های آماری این تحقیق به کمک نرم افزار Spss و بر مبنای ارزیابی‌های گروه های شاهد – تست مطابق با آزمون‌های student T-test انجام شد. در این روش به طور معمول با فاصله اطمینان 95 درصد، گروه‌های شاهد و تست مورد مقایسه قرار گرفته اند و نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار (Mean ± SEM) بیان شده اند.
نتایج
مطابق نتایج اخذ شده، هر دو باکتری سودوموناس و باسیلوس جدا سازی شده، توانایی تولید بیوسورفکتانت را دارا می باشند و هر دو همولیز مثبت بودند. به منظور تعیین ارتباط تولید سورفکتانت و نوع منبع کربن از انواع روغن­های خوراکی آفتابگردان، زیتون، روغن سوخته خودرو و روغن استفاده شد و با درصدهای متفاوت به محیط کشت تهیه شده افزوده شد. بر اساس ارتفاع کف ایجاد شده طبق نتایج، بیش­ترین کف مربوط به روغن زیتون54 درصد، سپس روغن خوراکی 43 درصد و روغن خودرو 2 درصد و بنزین1 درصد بود (نمودار 1).
 
نمودار 1- میزان بیوسورفکتانت تولیدی متعاقب استفاده از روغن‌های مختلف به عنوان منبع کربن
در آزمون تشکیل کف در لوله­های آزمایش، از نمونه‌های سانتریفیوژ شده با حجم برابر، ریخته و به شدت توسط دستگاه ورتکس هم زده شد. ارتفاع و زمان پایداری کف بررسی گردید.
نتایج نشان داد که کف مربوط به باکتری سودوموناس ارتفاع و پایداری بیشتری در مدت زمان 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی­گراد داشت [12]. به منظور تأیید تولید بیوسورفکتانت از آزمایش گسترش روغن ODA استفاده شد. طبق نتایج بدست آمده، قدرت گسترش قطره نفت توسط بیوسورفکتانت تولیدی، با استفاده از معادله، ارزیابی شد. همان­طور که نتایج نمودار 1 نشان می‌دهد، پس از 72 ساعت ODA حدود 127 سانتی‌متر مربع ایجاد گردید .
 
 
 
نمودار 2- رابطه بین تست ODA و میزان بیوسورفکتانت تولیدی توسط سودوموناس با استفاده از روغن زیتون 1 درصد به عنوان منبع کربن
در بررسی توان باکتری برای تولید بیوسورفکتانت، باکتری رشد نموده درفاضلاب حاوی روغن در محیط بلاد آگار کشت داده شد. هر دو باکتری سودوموناس و باسیلوس، بتا همولیز تشکیل دادند. اما قطر دایره ایجاد شده توسط سودوموناس، بیش­تر بود. در ادامه تحقیق از باکتری سودوموناس به منظور تشکیل بیوسورفکتانت رامنولیپید استفاده گردید.
بر مبنای اطلاعات ارائه شده در جدول (1)، مشخص است بیوسورفکتانت تولید شده از منبع مختلف دارای قدرت امولسیون­کنندگی متفاوتی می­باشد. رامنولیپید تولیدی توسط روغن زیتون با حضور ترکیبات مختلف حدود 70 درصد و روغن خوراکی با روغن زیتون 60 درصد، گازوئیل با حضور گازوئیل 70 درصد بدست آمد.
 
جدول 1- ارزیابی توانایی امولسیون­کنندگی رامنولیپید بدست آمده از منابع مختلف کربن
 
انواع منبع کربنی هیدروکربن مایع (24E) اندیکس امولسیون کنندگی % نتایج
SDS%1 گازوئیل 62 کنترل
روغن زیتون 65
نفت سفید 61
روغن آفتابگردان 68
       
روغن زیتون گازوئیل 70 خیلی خوب
روغن زیتون 65
نفت سفید 54
روغن آفتابگردان 50
       
روغن آفتابگردان گازوئیل 53 خوب
روغن زیتون 56
نفت سفید 20
روغن آفتابگردان 68
       
گازوئیل گازوئیل 75 متوسط
روغن زیتون 40
روغن آفتابگردان 22
نفت سفید 0
       
نفت سفید گازوئیل 0 بد
روغن زیتون 0
روغن آفتابگردان 0
نفت سفید 0
 
 
در این بررسی، غلظت­های مختلف رامنولیپید تهیه و غلظت بحرانی کاهش کشش سطحی آن توسط دستگاه تنسیومتر مورد بررسی قرار گرفت. غلظت برای تشکیل میسل حدود 65 میلی­گرم در لیتر بدست آمد که توانست کشش سطحی را تا حدود mN/m2 9/28 کاهش دهد (نمودار 3).

 
 
 
 
 
 
 
 
 
نمودار 3 - نمودار غلظت بحرانی CMC با استفاده از غلظت­های مختلف بیوسورفکتانت تولیدی
 
رابطه بین رشد سلولی و تشکیل رامنولی‍‍پید در نمودار 4 بیان شده است. سودوموناس آئروژنزا جدا شده از فاضلاب بیمارستانی در محیط کشت توانست توسط منبع کربن روغن زیتون، حدود ۲۵ گرم در لیتر و برای روغن آفتابگردان ۲۰ گرم در لیتر بیوسورفکتانت تولید کند. همان­طور که نتایج نشان می­دهد بیش­ترین تولید بیوسورفکتانت در فاز ثابت رشد به­ عنوان متابولیت­های ثانویه اتفاق می­افتد.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
نمودار 4- منحنی رابطه کدورت ایجاد شده با استفاده از روغن زیتون 1% به عنوان منبع کربن
نتایج حاصل از حذف COD متعاقب استفاده از غلظت‌های 5/0 (a) و 25/0 (b) روغن زیتون در نمودار 5 ارائه شده است.
                                                                           a)
 
 
 
 
 
 
 

نمودار 5- درصد حذف COD قبل و بعد از استخراج بیوسورفکتانت تولیدی غلظت 5/0 % (a)  و 25/0 %  (b )روغن زیتون
بحث
با توجه به کاربردهای زیاد بیوسورفکتانت­ها در صنایع، تولید این محصول بیولوژیکی در سال­های اخیر مورد توجه محققین قرار گرفته است. روش­های مختلفی برای تولید و جداسازی این محصول از طریق بهینه­سازی شرایط کشت و مهندسی ژنتیک و استراتژی مهندسی متابولیک انجام شده­است.
همان طور که بیان شد، بیوسورفکتانت‌ها مولکول‌های بیوشیمیایی آمفی فیلیک هستند. این مواد ترکیبات فعال سطحی هستند که بین فازهای مایع با قطب‌های متفاوت و پیوندهای هیدروژنی قرار می‌گیرند این مواد در سطوح سلول‌های میکروبی تولید می‌شوند، یا به شکل خارج سلولی ترشح می‌گردند و شامل گروه‌های هیدروفیلی و هیدروفوبی هستند که توانایی تجمع بین فازهای مایع را فراهم نموده و کشش سطحی و بین سطحی را در این نواحی کاهش می‌دهند. یکی از مهم‌ترین کاربرد های سورفکتانت‌ها، استفاده آنها در Bioremediation آلاینده‌های مختلف خصوصاً نفتی بوده است ]20-17[. باکتری‌ها، مخمرها و قارچ‌ها، تولید کنندگان مهم این ترکیبات بوده و مورد علاقه بسیاری از بیوتکنولوژیست‌ها می‌باشد ]21[.
استفاده از نوع بومی باکتری­ها می­تواند منجر به افزایش قابل ملاحظه­ این محصول شود. سودوموناس ها توانایی زیادی در استفاده از منابع مختلف کربن در حذف آلایندهای زیستی دارند و در همه جا موجود هستند. امروزه از این باکتری‌ها در مهندسی ژنتیک استفاده می‌شود. همچنین این باکتری نقش بسیار مهمی در فعالیت‌های متابولیکی محیط زیست مانند چرخه عناصر و تجزیه آلایند‌های ناشی از فعالیت‌های زیستی و غیر زیستی بازی می‌کند. توانایی سودوموناس در زمینه عملیات و فعالیت‌های بیوتکنولوژی بویژه در زمینه تجزیه زیست محیطی آلاینده‌ها بسیار مورد توجه قرار گرفته است. چرخه تنفسی این باکتری شامل سیتوکروم‌های مختلف و انواع گوناگون اکسیدازهای انتقالی متصل به اکسیژن است که باعث توانایی آن در استفاده از منابع مختلف کربن و شرایط سخت شده است [21].
هم­چنین با استفاده از منابع مختلف کربنی می‌توان میزان متفاوتی از این محصول را تولید نمود. یکی از روغن­هایی که بالاترین تولید بیوسورفکتانت خصوصاً رامنولیپید را دارا می­باشد، فاضلاب صنایع روغن زیتون است که علت عمده آن زیاد بودن چربی آب­گریز آن می‌باشد. استفاده از فاضلاب­های صنعتی ناشی از صنایع تصفیه روغن به لحاظ اقتصادی می­تواند به­عنوان یک منبع ارزان قیمت جهت تولید این محصول در نظر گرفته شود. بهینه‌سازی و تولید بیشتر محصول و استفاده از منابع مختلف نیترات و نسبت کربن به ازت می­تواند تولید بیش­تر بیوسورفکتانت را حاصل سازد ]6].
در این تحقیق از سودوموناس آئروژنزا جهت تولید بیوسورفکتانت با حضور منابع مختلف کربن (روغن آفتابگردان، روغن زیتون، نفت سفید، گازوئیل) استفاده شد. در تحقیق Gorfi و همکاران نیز شرایط بهینه تولید بیوسورفکتانت به وسیله سودوموناس آئروژینوزا شامل منبع کربن روغن زیتون، منبع نیتروژن نیترات آمونیوم، نسبت کربن به ازت 5، شوری 5/0 درصد و pH برابر 7 تعیین گردید. بازده حذف پایرن در غلظت اولیه 100 و 500 میلی‌گرم در هر کیلوگرم در زمان 63 روز و کاربرد بیوسورفکتانت به ترتیبب 91 و 84 درصد تعیین شد. با توجه به نتایج بدست آمده از تحقیق حاضر، سودوموناس توانایی زیادی برای تولید بیوسورفکتانت جهت حذف COD دارد که با نتایج این مطالعه همخوانی دارد ]22[.
همچنین در مطالعه‌ای Chaprão و همکاران، از بیوسورفکتانت‌های تولید شده توسط مخمر و باکتری‌های باسیلوس رشد کرده در سوبسترای ارزان قیمت در شرایط آزمایشگاهی استفاده نمود و با سورفکتانت مصنوعی توئین 80 و تریتون 100-X مقایسه کردند. نتایج نشان داد که بیوسورفکتانت‌های تولید شده از توانایی بالایی برای حذف روغن موتور از شن و ماسه آلوده در شرایط اختلاط و زمان تماس 10-5 دقیقه (90 درصد تا 70 درصد) برخوردارند. همچنین با افزودن بیوسورفکتانت تهیه شده از مخمر توانستند تخریب (50 درصد) را انجام دهد. افزایش 10 تا 20 درصد بیوسورفکتانت زمان را به 45 روز کاهش داد که این نشان دهنده کار آمدی این ترکیبات در حذف بیولوژیکی و فیزیکی هیدرو کربن‌ها در سیستم‌های خاک می‌باشد. در راستای مطالعات ذکر شده در مطالعه ما نیز رامنولیپید تولیدی توسط روغن زیتون، دارای قدرت امولسیون­کنندگی با حضور ترکیبات مختلف حدود 70 درصد روغن موتور و 60 درصد گازوئیل بود که نشان دهنده توانایی بالای این بیوسورفکتانت در محلول‌سازی این آلاینده بود که با نتایج بدست آمده از تحقیق ما همخوانی دارد ]4[.
در مطالعه ای Abbasi و همکاران توانستند با استفاده از انواع مختلف میوهای فاسد و محصولات مرتبط با صنایع غذایی و فرآوری مواد غذایی به عنوان منبع کربن با استفاده از باکتری سودوموناس آئروژنوزا، بیوسورفکتانت تولید نمایند. بالاترین تولید بیوسورفکتانت در منبع روغن سویا بود. باکتری جدا شده قادر بود 12 گرم بر لیتر بیوسورفکتانت تولید نماید. در مطالعه ما نیز، سودوموناس استفاده شده توانست به کمک منبع کربن روغن زیتون، حدود ۲۵ گرم در لیتر و به کمک روغن آفتابگردان، ۲۰ گرم در لیتر بیوسورفکتانت تولید نماید که میزان بالاتری برای تولید بیوسورفکتانت نسبت به مطالعه ذکر شده در بالا دارد ]6[.
Nathália Maria و همکاران در مطالعه‌ای با استفاده از گونه‌های مختلف باکتری سودوموناس  و روغن سویا و پاپ کورن توانستند در مدت 144 ساعت 2/3 گرم در لیتر بیوسورفکتانت تولید کنند و از آن برای حذف چربی و روغن ماشین استفاده نمایند. به نظر می رسد، سودوموناس استفاده شده در مطالعه ما، توانایی بالاتری برای تولید بیوسورفکتانت نسبت به تحقیق فوق دارد [23].
در مطالعه  Al-Bahryaو همکاران، با کتری‌های هوازی از منابع مختلف جداسازی شد و بیوسورفکتانت‌ها و پلیمرهای تولید شده مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این مطالعه نشان داد که باکتری باسیلوس سوبتلیس W19 می‌تواند کشش سطحی را تا 2mN/m 27 کاهش دهد که با نتایج تحقیق ما مطابقت داشت. در نتایج این تحقیق غلظت برای تشکیل میسل حدود 65 میلی‌گرم در لیتر بدست آمد که توانست کشش سطحی را تا حدود mN/m2 9/28 کاهش دهد [24].
نتیجه‌گیری
نتایج ما نشان داد که بیشترین تولید محصول در فاز ثابت رشد باکتری بوده و این نشان­دهنده ترشحات خارج سلولی باکتری­ها به منظور استفاده بهتر از منابع کربن و محلول­سازی آن­ها با ترشح بیوسورفکتانت می‌باشد. همچنین نتایج نشان داد که استخراج بیوسورفکتانت باعث کاهش COD خروجی از تصفیه خانه نسبت به قبل از آن می­شود. با توجه به CMC پایین و امولسیون­کنندگی بالا و قدرت گسترش قطره روغن، تولید قابل توجه بیوسورفکتانت حاصل، می­توان نتیجه گرفت که باکتری جدا شده از فاضلاب می­تواند در مطالعات بعدی مرتبط با تصفیه فاضلاب­های روغنی و تولید هم­زمان بیوسورفکتانت، برداشت میکروبی و جداسازی نفت، تصفیه آلودگی‌های نفتی مورد توجه قرار گیرد. استفاده از پسماندهای صنایع با توجه به میزان مواد آلی بالا، قیمت پایین نسبت به سایر منابع کربن مانند گلوکز و ساکاروز می­تواند با کاهش هزینه تولید این محصول، علاوه بر تصفیه فاضلاب‌های صنایع به تجاری­سازی این محصول کمک نماید. در کشور ما نیز با توجه به شرایط کنونی با تولید این محصول می‌توان علاوه بر رفع وابستگی به درآمد ارزی دست یافت.
تشکر و قدردانی
نویسندگان بر خود لازم می­دانند از حمایت‌های پژوهشی و مالی دانشگاه تربیت مدرس و همچنین از مسئولین محترم آزمایشگاه تشخیص طبی ایثارگران مشهد (عبدالمطلب) که در اجرای این تحقیق کمک‌های شایان توجهی داشتند تشکر و قدردانی نمایند.
 
 
 
 
References
 
 
[1] Priya A, Usharani B. Comparative Study for Biosurfactant Production by Using Bacillus subtilis and Pseudomonas aeruginosa. Res Int 2009; 2 (4): 284-7.
[2] Jain RM, Mody K, Joshi N, Mishra A, JhaDiscipline B, Effect of unconventional carbon sources on biosurfactant productionand its application in bioremediation, Int J Biol Macromol 2013; 62: 52–8.
[3] Pérez-Armendáriz B, Mauricio-Gutiérrez A, Jiménez T, Tapia-Hernández A, Santiesteban-López A. Emulsification of Hydrocarbons Using BiosurfactantProducing Strains Isolated from Contaminated Soil inPuebla, Mexico. Biodeg Eng Technol 2013; 25-44.
[4] Chaprão MJ, Ferreira INS, Correa PF, Rufino RD, Luna JM, Silva EJ and et al. Application of bacterial and yeast biosurfactants for enhanced removal and biodegradation of motor oil from contaminated sandElectronic. J Biotechnol 2015; 18: 471–79.
[5] Mabrouk MEM, Youssif EM, Sabry SA. Biosurfactant production by a newly isolated soft coral-associated marine Bacillus sp.E34: Statistical optimization and characterization. Life Sci J 2014; 11(10):17-21.
[6] Abbasi H, Hamedi MM, Bagheri Lotfabad T, Shahbani Zahiri H, Sharafi H, Masoomi F, et al. Biosurfactant-producing bacterium, Pseudomonas aeruginosa MA01 isolated fromspoiled apples: Physicochemical and structural characteristics ofisolated biosurfactant. J Biosci Bioeng 2012; 113 (2) 211–9.
[7] Myers D. Surfactant Science and Technology. Third Edition. Drew Myers Hoboken, New Jersey. John Wiley and Sons, Inc 2006; 6-10.
[8] Thavasi R, Subramanyam N, Jayalakshmi S, Balasubramanian T, Banat IM. Biosurfactant Production by Pseudomonas aeruginosa from Renewable Resources. Indian J Microbiol 2011; 51: 30-6.
[9] Rahman KS, Rahman TJ, McClean S, Marchant R, Banat IM. Rhamnolipid Biosurfactant Production by Strains of Pseudomonas aeruginosa Using Low-Cost Raw Materials. Biotechnol Prog 2002; 18: 1277-81
[10] Mukherjee S, Das P, Sen R. Towards Commercial Production of Microbial Surfactants (Review). Trens Biotechnol 2006; 24: 509-11.
[11] Nelson K.E, Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas Putida KT2440. Environ. Microbiol 2002; 4(12): 799–808.
[12] M. Jain, Mody K, Joshi N, Avinash Mishra, Bhavanath J. Effect of unconventional carbon sources on biosurfactant productionand its application in bioremediation. International Journal of Biological Macromolecules 2013; 62: 52–8.
[13] Amani H, Optimization of Biosurfactant Production in order to clear crude and floating oil from water. Journal of Science (Kharazmi University) 2014; 14: 185-98.
 [14] França I W L, Lima AP, Lemos J M. Production of a biosurfactant by Bacillus subtilis ICA56 aiming bioremediation of impacted soils. Catalysis Today 2015; 225: 10-5
[15] Xiangsheng Z, Dejun Xu, Chunyan Z, Tserennyam L, Kerstin. S. Isolation and identification of biosurfactant producing and crude oil degrading Pseudomonas aeruginosa strains. Chem Eng J 2012; 209: 138-46.
[16] Youssef NH, Duncan K E, Nagle D P, Savage KN, Knapp RM, Mclnerney M J, “Comparison of methods to detect biosurfactant production be diverse microoraganism”. J Microbiol Methods 2004; 56: 339-47.
[17] Saharan1 B, Sahu R, Sharma1 D. A Review on Biosurfactants: Fermentation, Current Developments and Perspectives. Gen Eng Biotechnol J 2011; 29: 24-36.
[18] Darlane W, Wa T, Anne L, Vânia E. Kinetic study of biosurfactant production by Bacillus subtilis LAMI005 grown inclarified cashew apple juice. Colloids Surf B: Biointerf 2013; 101: 34-43.
[19] Rashedi H, Jamshidi, E. Assadi M, Bonakdarpour B. Isolation and production of biosurfactant from Pseudomonas aeruginosa isolated from Iranian southern wells oil. Int J Environ Sci Tech 2005; 2(2): 121-27.
[20] Ochsner UA, Reiser J, Fietcher A, Witholt B, Production of Pseudomonas aeruginosa. rhamnolipid biosurfactants in heterologous host. Appl Environ Microbiol 1995; 61: 3503-06.
 [21] Zhang G, Wu YT, Qian XP. Biodegradation of crude oil by Pseudomonas aeruginosa in the presence of rhamnolipids. J Zhejiang University Sci 2005; 6: 725-30.
[22] Jorfi S, Rezaee A, Mohebali G, Jafarzaed N, Application of biosurfactants produced by Pseudomonas aeruginosa SP4 for bioremediation of soils contaminated by pyrene, Soil Sediment Contam 2013; 22: 890-911.
[23] Nathália P. Rocha S, Raquel D. Rufin o, Juliana L, Valdemir A, Leonie A. Screeningof Pseudomonas species for biosurfactan tproduction using low-cos tsubstrates, Biocatalysi sand Agricultura Biotechnology. 2014; 3: 132-9.
[24] Al-Bahrya SN, Elshafiea AE, Al-Wahaibib YM, Al-Bemanib AS, Joshia SJ, Al-Lawatia A., Isolation and characterization of biosurfactant/biopolymer producing spore forming bacteria from oil contaminated sites and oil field of Oman. Procedia 2013; 5: 242-6.


Feasibility of Rhamnolipid Biosurfactant Production from Oily Wastewaters by Pseudomonas aeruginosa Isolated from Hospital Wastewater
 
 
B. Mohebrad[6], A. Rezaee[7], S. Dehghani[8], M. Zamanian[9], M. Hamedrahmat[10]
 
Received:22/11/2016   Sent for Revision:22/01/2017 Received Revised Manuscript:28/02/2018 Accepted: 18/03/2018
 
 
Background and Objectives: Production and use of valuable compounds such as biosurfactants from wastewater, with regard to its environmental and economic benefits, is of particular interest recently. Nowadays, biosurfactants produced by microorganisms are used in various food sources, pharmaceuticals, petrochemicals, oil extraction, and wastewater treatment plants. This study was conducted to evaluate the use of oily wastewater as a cheap substrate using Pseudomonous aeruginosa strains isolated from hospital wastewater to produce rhamnolipid biosurfactants.
Materials and Methods: The present study was an experimental study that was conducted in a laboratory scale in a batch reactor containing local bacteria isolated from hospital sewages wastewater in a mineral medium containing various oils so that the culture oil was evaluated at different times and concentrations, using hemolysis, oil spill, droplet removal, emulsifying activity, and chemical oxygen demand experiments. In this study, the statistical analyses were performed based on the assessments of the control-test groups according to student’s t-test.
Results: The obtained results showed that Pseudomonas aeruginosa bacteria had a good ability to produce biosurfactant. Reduced surface tension, more than 70% emulsification, and 85% COD (Chemical Oxygen Demand) reduction were the results of using isolated biosurfactant.
Conclusion: Based on the findings of this study, it seems that oily sewages containing high amounts of organic matters are the suitable option for producing rhamnolipid biosurfactants. Produced biosurfactants, due to the desired emulsification properties, can be used in elimination of decomposable pollutants and biodegradation processes.
Key words: Rhamnolipid Biosurfactant, Oily Wastewater, Pseudomonas aeroginosa, Emulsification
 
Funding: This research was funded by Tarbiat Modares University, Tehran, Iran.
Conflict of interest: None declared.
Ethical approval: The Ethicals Committee of Tarbiat Modares University, Tehran, Iran approved the study. The Ethical Code: 52د /8182
 
How to cite this article: Mohebrad B, Rezaee A, Dehghani S, Zamanian M, Hamedrahmat M. Feasibility of Rhamnolipid Biosurfactant Production from Oily Wastewaters by Pseudomonas aeruginosa Isolated from Hospital Wastewater. Univ Med Sci 2018; 17(2): 143-56. [Farsi]
 
 
[1]- دانشجوی دکتری گروه بهداشت محیط، دانشکده علوم پزشکی دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
[2]- (نویسنده مسئول) استاد، گروه بهداشت محیط، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
  تلفن: 82883575-021، دورنگار: 82883575-021، پست الکترونیکی: rezaee@modares.ac.ir
[3]- دانشجوی دکتری گروه بهداشت محیط، دانشکده علوم پزشکی دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
[4]- دانشجوی کارشناسی ارشد گروه بهداشت محیط، دانشکده علوم پزشکی دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
[5]- دانشجوی کارشناسی ارشد تکنولوژی میکروبی ، دانشکده علوم ، دانشگاه فردوسی مشهد ، ایران
 
[6]- PhD Student, Department of Environmental Health Engineering, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran, ORCID: 0000-0001-9967-4803
[7]- Professor, Department of Environmental Health Engineering, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran, ORCID: 0000-0001-5042-2963
(Corresponding Author) Tel: (021)82883575, Fax: (021)82883575, E-mail: rezaee@modares.ac.ir
[8]- PhD Student, Department of Environmental Health Engineering, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran, ORCID: 0000-0003-1652-3909
[9]- MSc Student, Department of Environmental Health Engineering, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran, ORCID: 0000-0001-5074-5770 
[10]- MSc Student of Microbial Technology, Faculty of Sience, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran, ORCID: 0000-0002-5930-2586

 [j1]سال انجام طرح اضافه گردد.
نوع مطالعه: پژوهشي | موضوع مقاله: بهداشت
دریافت: ۱۳۹۵/۶/۱۲ | پذیرش: ۱۳۹۶/۱۲/۲۷ | انتشار: ۱۳۹۷/۲/۲۴

ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
کد امنیتی را در کادر بنویسید

ارسال پیام به نویسنده مسئول


کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق

© 2018 All Rights Reserved | Journal of Rafsanjan University of Medical Sciences

Designed & Developed by : Yektaweb