جلد 16، شماره 9 - ( 10-1396 )                   جلد 16 شماره 9 صفحات 807-818 | برگشت به فهرست نسخه ها

XML English Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Rahmani-Piani R, Doosti A. Survey of Helicobacter Pylori lnT Gene Expression in HDF Cells by RT-PCR Method . JRUMS. 2018; 16 (9) :807-818
URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-3498-fa.html
رحمانی پیانی راضیه، دوستی عباس. بررسی بیان ژن lnT هلیکوباکتر پیلوری در سلول‌های HDF انسان به روش RT-PCR. مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان. 1396; 16 (9) :807-818

URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-3498-fa.html


دانشیار دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد
متن کامل [PDF 243 kb]   (384 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (1107 مشاهده)
متن کامل:   (240 مشاهده)
مقاله پژوهشی
مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان
دوره 16، آذر 1396، 818-807
 
بررسی بیان ژن lnT هلیکوباکتر پیلوری در سلول‌های HDF انسان به روش RT-PCR
 
راضیه رحمانی‌پیانی[1]، عباس دوستی[2]
 
دریافت مقاله: 13/2/96   ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 15/7/96    دریافت اصلاحیه از نویسنده: 20/8/96         پذیرش مقاله: 29/8/96
 
 

چکیده
زمینه و هدف: هلیکوباکتر پیلوری، باکتری مارپیچی شکل و گرم منفی است که موجب بیماری­های معده و دوازدهه در انسان می­شود. به دلیل وجود ایراداتی در درمان­های آنتی­بیوتیکی، تلاش­های رو به افزایشی در جهت تولید واکسن مؤثر برای این عفونت صورت گرفته است. هدف از این تحقیق، ساخت سازواره­ ژنی حامل قطعه ژن lnT و بررسی بیان آن در سلول­های انسانی به روش RT-PCR است.  
مواد و روش‌ها: در این مطالعه آزمایشگاهی، ژن lnT از ژنوم هلیکوباکتر پیلوری به روش واکنش زنجیره­ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction) جدا شد. همسانه‌سازی محصولات PCR به روش کلون‌سازی T/A در وکتور T مناسب، انجام شد. سپس ژن lnT در وکتور بیانی یوکاریوتی pEGFP-C2 ساب­کلون گردید. جهت بررسی بیان ژن lnT، سازواره pEGFP-C2-lnT به روش الکتروپوریشن به سلول­های فیبروبلاست پوست انسان منتقل و بیان آن به روش RT-PCR بررسی شد.
یافته­ها: انجام PCR منجر به تکثیر قطعه 1290 جفت بازی مربوط به ژن lnT گردید. این ژن با موفقیت در وکتور pTZ همسانه‌سازی شد و نتایج هضم آنزیمی و تعیین توالی نشان داد ژن lnT در وکتور بیانی ساب­کلون گردیده و سازواره نهایی pEGFP-C2-lnT ایجاد شده است. بررسی بیان این ژن به روش RT-PCR، تشکیل باند اختصاصی این ژن را نشان داد.
نتیجه­گیری: ژن lnT همسانه سازی شده در وکتور بیانی یوکاریوتی pEGFP-C2، توان تولید محصول اختصاصی این ژن در سلول­های یوکاریوتی را دارد. لذا به­نظر می‌رسد این سازواره ژنی، از پتانسیل لازم برای بررسی ایمنی­زایی در مدل حیوانی به عنوان واکسن ژنی علیه هلیکوباکتر پیلوری برخوردار باشد. 
واژه‌های کلیدی: هلیکوباکتر پیلوری،کلونینگ، ژن lnT­، RT-PCR
 
 

مقدمه
هلیکوباکتر پیلوری یک باکتری گرم منفی، مارپیچی شکل، تاژکدار و میکروآئروفیل است ]1[. این باکتری باعث بروز بیماری‌هایی نظیر گاستریت مزمن، زخم معده، زخم دوازدهه، سرطان معده و لنفوم MALT (Mucosa-associated lymphoid tissue) می‌گردد. هلیکوباکتر پیلوری از نظر ژنتیکی بسیار متنوع است و این تنوع ژنتیکی شامل چندین ژن بیماری­زا در هلیکوباکتر پیلوری، نظیر cagA و vacA می­باشد ]2[.
امروزه از روش­های مولکولی نوین برای تشخیص سریع باکتری­ها استفاده می‌شود. مثلا" جهت تشخیص میکروارگانیسم­هایی که در نمونه­های مورد آزمایش، در مقادیر کم حضور دارند یا غیرقابل کشت می­باشند، می‌توان از روش PCR، بهره جست. در همین راستا، با کمک آزمایش PCR می‌توان به صورت مستقیم و بدون نیاز به کشت، به تشخیص هلیکوباکتر پیلوری در نمونه‌های بیوپسی معده، پرداخت ]3[. با توجه به خطرات ناشی از عفونت هلیکوباکتر پیلوری، بهتر است که این عفونت در بیماران مبتلا، با مصرف آنتی‌بیوتیک­ها تحت کنترل در­آید ]4[. با وجود پیدایش هلیکوباکتر پیلوری­های مقاوم به دارو، لزوم تلاش بیشتر برای پیش­گیری از این عفونت با کمک واکسیناسیون ضروری به نظر می­رسد. ژن lnT (Apolipoprotein N-acyltransferase)، ابتدا در باکتری گرم منفی سالمونلا انتریکا کشف شد اما پس از آن، ساختار و عملکرد lnT به صورت دقیق‌تر در باکتری اشریشیا­کلی مورد مطالعه قرار گرفت ]5[
به طور کلی 3%-1% از ژنوم باکتری­ها شامل ژن­هایی است که کد‌کننده لیپوپروتئین­هایی هستند که در پوشش سلول قرار می­گیرند. این لیپوپروتئین­ها نقش­های کلیدی متعددی مثل محافظت از یکپارچگی دیواره سلولی، جذب مواد غذایی، ترشح پروتئین، فولدینگ فراسیتوپلاسمی پروتئین‌ها و بیماری‌زایی را دارا می­باشند ]8-6[. لیپوپروتئین‌های سنتز شده به عنوان پرولیپوپروتئین­هایی هستند که توسط ماشین ترشح عمومی Sec (General secretion) یا  Tat(Twin arginine translocation) به غشای سیتوپلاسمی منتقل می­گردند ]9[. توالی سیگنال خاتمه لیپو­پروتئین دارای یک موتیف لیپوباکس حفاظت شده شامل چهار اسیدآمینه ((LVI/ASTVI/GAS/C میباشد ]7 [که این پیش‌‌سازهای لیپوپروتئین (توالی لیپوباکس) پردازش شده و به اشکال بالغ تبدیل می­گردند و به سمت غشای خارجی سیتوپلاسم فرستاده می­شوند. این اعمال توسط سه آنزیم: 1-پرولیپوپروتئین دی­آسیل گلیسریل ترانسفراز (lgT) که باعث اتصال دی­آسیل گلیسریل به سیستین از طریق پیوند تیواتر می­شود] 10[، 2- پرولیپوپرتئین سیگنال پپتیداز(lspA)  که باعث شکافتن سیگنال پپتیدی می­شود و 3- آپولیپوپروتئین ان­آسیل ترانسفراز ((lnT که باعث انتقال آسیل به گروه آمین سیستئین می­شود، انجام می‌پذیرد] 11[.
هر سه آنزیم lgT،  lspAو lnT برای رشد و زنده ماندن باکتری­های گرم منفی که در غشای داخلی (سیتوپلاسمی) واقع شده­اند ضروری هستند] 12[. ژن lnT، یکی از لیپوپروتئین­های مهم پوششی هلیکوباکتر پیلوری را کد می‌کند. تا کنون مطالعه­ای در مورد کلون­سازی و بررسی بیان یوکاریوتی و یا پروکاریوتی ژن lnT هلیکوباکتر پیلوری، انجام نشده است اما کلون­سازی و بررسی ویژگی‌های آنتی­ژنیک آن در باکتری­های گرم منفی دیگری نظیر اشریشیا‌کلی و سالمونلا انتریکا مطالعه گردیده است ] 5 ، 12[. با توجه به خاصیت آنتی­ژنیک این ژن و از آنجا که تا کنون بیان ژن lnT هلیکوباکتر پیلوری مورد بررسی قرار نگرفته، برای اولین بار در این تحقیق بیان یوکاریوتی ژن lnT در سلول­های فیبروبلاست پوست انسان (HDF: Human dermal fibroblast) مورد تحقیق قرار گرفته است. به منظور کاربرد ژن lnT در تحقیقات آینده به عنوان واکسن ژنی، لازم است بیان آن در سلول­های یوکاریوتی تأیید گردد، لذا هدف از این تحقیق، کلون‌سازی و بررسی بیان اختصاصی ژن lnT هلیکوباکتر پیلوری در سلول­های یوکاریوتی HDF به روش RT-PCR می­باشد.
مواد و روش­ها
در این مطالعه آزمایشگاهی که در سال 1395 در مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد اسلامی شهرکرد انجام شد، از سویه استاندارد هلیکوباکتر پیلوری برای استخراج DNA و بدست آوردن ژن lnT استفاده شد. باکتری اشریشیا‌کلی سویه TOP10F نیز به عنوان میزبان کلونینگ برای تکثیر پلاسمید­ها مورد استفاده قرار گرفت. در این تحقیق از دو وکتور با نام­هایpTZ57R/T  (Thermo Fisher Scientific, USA) و pEGFP-C2 (Clontech Laboratory Inc., USA) بهره گرفته شد. وکتورpTZ57R/T  که برای سهولت نگارش به صورت pTZ نشان داده می‌شود، طولی برابر 2886 جفت بازدارد و نشانگر انتخابی آن، مقاومت به آنتی­بیوتیک آمپی­سیلین است. وکتور pEGFP-C2، یک وکتور بیان‌کننده ژن در سلول­های یوکاریوتی است و اندازه آن 4735 جفت باز بوده و دارای دو نشانگر انتخابی مقاومت به کانامایسین و نئومایسین به ترتیب برای توانایی رشد سلول­های پروکاریوتی و یوکاریوتی در محیط­های انتخابی است. از سلول­های انسانی HDF به عنوان میزبان یوکاریوتی برای بیان ژن در این تحقیق استفاده شده است.
به منظور استخراج DNA ژنومی از هلیکوباکتر پیلوری، از کیت استخراج DNA (سیناژن، ایران) استفاده شد و روش کار مطابق دستور­العمل کیت اجرا شد. مقدار 5 میکرولیتر از DNA استخراج شده روی ژل آگارز 1% الکتروفورز شد و علاوه بر آن، غلظت و کیفیت DNA تخلیص شده با استفاده از نانودراپ (ND-1000, PeqLab, USA) مورد ارزیابی قرار گرفت [14 - 13]. برای طراحی پرایمرها، توالی ژن lnT با شماره ثبت  FM991728از بانک جهانی ژن NCBI گرفته شد. سپس توسط نرم‌افزار Gene Runner پرایمرهای مناسب طراحی گردیدند. پرایمر­های رفت و برگشت به ترتیب واجد جایگاه برش برای آنزیم­های KpnI و SacII (نواحیی که زیر آنها خط کشیده شده است) بوده و توالی آنها به صورت زیر است: 
lnT-F: 5´-TTAGGTACCATGCGTCTTCTTCTGTTCAATC-3´
lnT-R:5-ATTCCGCGGTTATGATCGTTTCCTAAAAAG-3
تکثیر ژن lnT از طریق واکنش زنجیره­ای پلیمراز یا PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر انجام شد. مخلوط واکنش‌گرهای PCR شامل 5/2 میکرولیتر از بافرPCR 10X ، 5/1 میکرومول MgCl2، 200 میکرومول Mix dNTP، 100 نانومول از هر یک از پرایمرهای رفت و برگشت، 100 نانوگرم از DNA ژنومی تخلیص شده از هلیکوباکتر پیلوری و 1 واحد آنزیم DNA پلی‌مراز Taq (سیناژن، ایران)، در دستگاه ترموسایکلر (Mastercycler Gradient, Eppendorf, Germany) قرار گرفت [3 ، 13]. واکنش PCR در دستگاه ترموسایکلر با شرایط دمایی 5 دقیقه در 95 درجه سانتی­گراد در یک مرحله و سپس 1 دقیقه در 94 درجه سانتی­گراد، 1 دقیقه در 62 درجه سانتی­گراد، 2 دقیقه در 72 درجه سانتی­گراد برای 30 چرخه دنبال هم و جهت تکثیر قطعات نا­تمام، 10 دقیقه در 72 درجه سانتی­گراد انجام گرفت. پس از انجام واکنش، جهت الکتروفورز محصولات PCR از ژل آگارز 1% و بافر TBE 1X (Tris Borate EDTA) استفاده شد. سپس قطعات ژنی مربوط به ژن lnT، از ژل بریده شدند و توسط کیت استخراج DNA از ژل (Bioneer, South Korea)، محصولات PCR خالص شدند [15].
جهت کلون‌سازی محصولات PCR از تکنیک کلون‌سازی T/A استفاده شد. برای الحاق قطعه 1290 جفت بازی مربوط به ژن lnT به وکتور pTZ از کیت (Thermo Fisher Scientific, USA) استفاده شد که حاوی پلاسمید pTZ و آنزیم T4-لیگاز می­باشد. سپس محصول الحاق (Ligation)، به روش شیمیایی و با استفاده از کلرید کلسیم 1/0 مولار سرد و استریل به میزبان باکتریایی (E. coli Top10F)، منتقل شد. باکتری­های منتقل شده، روی پلیت محیط کشت LB-Agar حاوی 100 میکروگرم در هر میلی‌لیتر آمپی‌سیلین کشت داده شدند و به مدت 18 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، گرمخانه گذاری شدند. استخراج پلاسمید از باکتری­های رشد‌یافته با استفاده از کیت (Bioneer, South Korea)، انجام شد. صحت کلون‌سازی ژن در وکتور pTZ و بررسی تشکیل وکتور نوترکیب pTZ-lnT، با روش­های PCR و هضم آنزیمی با دو آنزیم KpnI و SacII صورت پذیرفت [15].
به منظور بیان ژن lnT، از وکتور بیانی pEGFP-C2 استفاده شد. لذا ژن lnT باید از وکتور pTZ-lnT خارج و در وکتور بیانی وارد گردد. به این منظور، وکتور نوترکیب pTZ-lnT و وکتور بیانی pEGFP-C2 توسط آنزیم­های kpnI وsacII برش خورده و محصولات حاصل روی ژل آگارز 1% الکتروفورز شدند. سپس قطعات مربوط به وکتور خطی شده pEGFP-C2 و ژن lnT، از روی ژل بریده شد و واکنش الحاق بین آنها با استفاده از آنزیم T4-لیگاز برقرار گردید. مراحل انتقال محصولات اتصال، به درون باکتری E. coli سویه TOP10F، انجام شد. به منظور تأیید صحت ساب‌کلونینگ و بررسی تشکیل سازواره نهایی pEGFP-C2-lnT، ابتدا واکنش PCR با استفاده از پرایمرهای رفت و برگشت مخصوص ژن lnT انجام گرفت. برای تأیید بیشتر و دقیق­تر سازواره نهایی، هضم آنزیمی با آنزیم‌های kpnI وsacII و تعیین توالی صورت پذیرفت [15].
به منظور بررسی بیان ژن هدف در پلاسمید نوترکیب pEGFP-C2-lnT، از سلول­های HDF انسانی استفاده گردید. برای انتقال این پلاسمید به سلول­های HDF، روش الکتروپوریشن انجام شد. در این مرحله، از دستگاه الکتروپوریشن (Gene Pulser Xcell, BioRad, USA) بهره گرفته شد. تعداد 106x2  سلول در حجم 400 میلی‌لیتر در کووت 4/0 میلی­لیتری مخصوص دستگاه الکتروپوریشن ریخته شد. سپس مقدار 600 نانوگرم در هر میکرولیتر از پلاسمید نوترکیب pEGFP-C2-lnT به این سلول­ها اضافه شد. شوک الکتریکی با شرایط تنظیم شده 240/0 کیلو ولت و 480 میکروفاراد به سلول­های HDF داده شد و نمونه­ها بلافاصله به مدت 5 دقیقه روی یخ قرار داده شدند. سپس سلول­های HDF در محیط کشت RPMI 1640 (Merck, Germany) به همراه 10% سرم جنین گاوی، کشت داده شدند و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد و در حضور 5% CO2 نگه­داری شدند. سپس به محیط­های کشت سلولی، مقدار 100 میکروگرم در هر میلی­لیتر آنتی­بیوتیک نئومایسین (نشانگر انتخابی پلاسمید pEGFP-C2) اضافه شد و سلول­ها به مدت 72 ساعت دیگر گرمخانه گذاری گردیدند. تمام مراحل بالا (الکتروپوریشن) برای گروه دیگری از سلول‌های HDF که به عنوان گروه شاهد در نظر گرفته شده بودند نیز انجام شد با این تفاوت که به سلول­های شاهد، هیچ گونه DNA خارجی اضافه نگردید [16].
برای بررسی بیان اختصاصی ژن هدف در سلول­های انسانی HDF، استخراج RNA از این دو دسته سلول (تست و شاهد) با استفاده از کیت (Qiagen, USA)، انجام شد. سپس cDNA با استفاده از کیت سنتز cDNA (Takara, Japan)، بر اساس روش کار کیت، تهیه شد. آزمایش PCR با استفاده از پرایمرهای lnT-F و lnT-R مخصوص ژن هدف روی cDNA‌های حاصل، انجام شد و نتایج روی ژل آگارز 1% ارزیابی شدند.
نتایج
بررسی غلظت DNA خالص‌سازی شده با نانودراپ نشان‌دهنده مقدار 180 نانوگرم DNA در هر میکرولیتر از محلول بود. نتیجه واکنش PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن lnT، باعث تشکیل باند 1290 جفت بازی روی ژل آگارز 1% شد (شکل 1).
 
 
 
 
 
 
 
 
 

شکل 1- نتیجه PCR برای ژن lnT
M: مارکرbp 100 ساخت شرکت فرمنتاز (شماره کاتالوگ DL007)
شماره 1: کنترل منفی (نمونه PCR بدون DNA)
شماره‌های 2و 3: محصول PCR برای ژنlnT بااندازه 1290 جفت بازی
پس از وارد کردن ژن lnT به درون وکتور pTZ، وکتور نوترکیب pTZ-lnT ایجاد شده به روش هضم آنزیمی توسط KpnI و SacII تأیید شد که نتیجه آن در شکل 2 ملاحظه می­شود. همان‌گونه که انتظار می‌رفت، قطعه 1290 جفت بازی از داخل ناقل بیرون آمده و به صورت باند جداگانه پایین­تر از باند پلاسمید خطی شده قرار گرفته است.

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

شکل 2- نتیجه هضم آنزیمی روی پلاسمید pTZ-lnT
M: مارکر 1kb ساخت شرکت فرمنتاز (شماره کاتالوگ SM0311).
شماره 1، 2: تشکیل باند 2886 جفت بازی مربوط به وکتورpTZ و باند 1290 جفت بازی مربوط به ژن lnT حاصل برش دو آنزیمی
شماره 3: کنترل پلاسمید (Un Cut)
در مرحله ساب‌کلونینگ، ژن lnT بریده شده با دو آنزیم KpnI و SacII به داخل وکتور بیانیpEGFP-C2  که توسط همان آنزیم­ها برش خورده بود، وارد شد. صحت نتایج این مرحله با روش هضم آنزیمی سنجیده شد که نتایج آن در شکل 3 آمده است.
پس از الکتروفورز محصولات هضم آنزیمی روی ژل آگارز، یک قطعه به اندازه 4735 جفت باز مربوط به وکتور pEGFP-C2 و یک قطعه به اندازه 1290 جفت باز مربوط به ژنlnT  مشاهد شد. تعیین توالی وکتور نوترکیب pEGFP-C2-lnT  نشان‌دهنده درستی کلون سازی ژنlnT  در وکتور بیانی یوکاریوتی مورد نظر بود به طوری که مقایسه توالی حاصل با توالی­های موجود از این ژن در بانک ژن جهانی (NCBI) درستی سکانس و عدم وجود هر­گونه تغییر در توالی کلون‌شده را نشان داد. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

شکل‏3- نتیجه هضم آنزیمی روی پلاسمید نوترکیب pEGFP-C2-lnT
شماره 1: کنترل پلاسمید (Un Cut)
M: مارکر 1Kb ساخت شرکت فرمنتاز (شماره کاتالوگ SM0311).
شماره‌های 2 و 3: تشکیل باند 4735جفت بازی مربوط به وکتور pEGFP-C2  و باند 1290جفت بازی مربوط به ژن lnT 
پس از الکتروپوریشن و در نتیجه دستکاری سلول­های HDF، سلول­های مقاوم به نئومایسین در محیط کشت حاصل گردید که نشان‌دهنده فعالیت موفق وکتور pEGFP-C-lnT در سلول­های انسانی HDF است. نتایج حاصل از انجام واکنش اختصاصی RT-PCR برای تأیید بیان ژن lnT هلیکوباکتر پیلوری در سلول­های یوکاریوتی مثبت بود. به طوری که پس از انجام PCR روی cDNA‌های بدست آمده از تست RT-PCR برای سلول‌های دریافت‌کننده وکتور نوترکیب حامل ژن lnT، باند 1290 جفت بازی مربوط به ژن lnT تشکیل شد. اما همین آزمایش برای سلول­های فاقد وکتور نوترکیب، مثبت نبود. نتایج این آزمایش مؤید بیان موفق ژن lnT در سلول‌های HDF می­باشد (شکل 4). شکل 5 نشان‌دهنده باند 47 کیلودالتونی مربوط به محصول پروتئینی ژن lnT، روی ژل SDS-PAGE است.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

شکل‏4- نتیجه بررسی بیان ژن lnT  در سلول‌های یوکاریوتی به روش RT-PCR
M: مارکر 1Kb ساخت شرکت فرمنتاز  (شماره کاتالوگ SM0311).
شماره 1: کنترل منفی 
شماره 2: تشکیل باند 1290جفت بازی مربوط به ژن lnT 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

شکل‏5- نتیجه بررسی بیان ژن lnT  در سلول­های یوکاریوتی به روش SDS-PAGE
شماره 1: سلول­های بیان‌کننده ژن lnT  که باند 47 کیلودالتونی مربوط به پروتئین LnT را نشان می دهد.
شماره 2: سلول ترانسفرم نشده (شاهد فاقد پلاسمید نوترکیب  pEGFP-C2-lnT )
شماره 3: مارکر پروتئینی شرکت ترموساینتیفیک (شماره کاتالوگ 26616)

بحث
از آن­جا که عفونت هلیکوباکتر پیلوری جزء شایع­ترین عفونت‌های باکتریایی است و در %75-50% درصد از جمعیت جهان نفوذ کرده و ممکن است برای چند دهه در افراد آلوده  باقی بماند ]1[،رژیم­های درمانی مختلفی برای ریشه­کن کردن هلیکوباکتر پیلوری پیشنهاد شده است ]17[. از جمله: استفاده از مهار‌کننده پمپ پروتون همراه با چند آنتی­بیوتیک مانند آموکسی­سیلین به علاوه کلاریترومایسین یا مترونیدازول به عنوان خط اول درمان برای عفونت هلیکوباکتر پیلوری در نظر گرفته شده ]18[، که در بیشتر موارد به دلایل مختلفی این نوع درمان منجر به شکست می­شود ]19[.
یکی از شاخص­ترین علل عدم موفقیت این نحوه درمان، مقاومت هلیکوباکتر پیلوری به یکی از آنتی‌بیوتیک‌ها است. یکی از انواع درمان عفونت هلیکوباکتر پیلوری که می‌تواند دارای مزایای زیادی باشد استفاده از آنتی‌بادی‌های اختصاصی است که هم قادر به شناسایی اختصاصی هلیکوباکتر پیلوری می­باشد و هم از چسبیدن آن به سطوح اپی­تلیال سیستم گوارش انسان جلوگیری می­کند ]20[.
از آن­جا که تولید آنتی­بادی­ها دارای مراحل پر‌هزینه از جمله تولید پروتئین نوترکیب و تخلیص آن می­باشد ]21[، جهت کاهش چشم­گیر چنین فرآیندهایی می­توان از DNA واکسن استفاده نمود. اخیراً مشخص شده است که استفاده از واکسن‌های اسید نوکلئیک سبب تحریک ایمنی سلولی و ایمنی هومورال می‌گردد که ایمنی هومورال میتواند میزبان را در برابر عفونت­های بعدی محافظت کند ]22[، بنابراین ضرورت دستیابی به یک روش جایگزین درمانی یا پیش­گیری مانند واکسیناسون مفید به نظر می­رسد. Farjadi و همکاران ناحیه­ای از ژن cagA را انتخاب نمودند و بعد از انجام PCR، در پلاسمید pET32 کلون و در باکتری اشریشیا‌کلی بیان شد. سپس پروتئین بیان شده تخلیص و آنتی‌ژنیسیته آن بررسی گردید. نتایج نشان‌دهنده­ کلونینگ و بیان موفقیت‌آمیز ژن بود و بدین معنی این است که می­توان از آن به عنوان واکسن ژنی استفاده نمود ]23[.
Hasanzadeh و همکاران در مطالعه­ای، بیان و آنتی‌ژنیسیته ژن vacA در هلیکوباکتر پیلوری را بررسی کردند. در این مطالعه نیز بعد از استخراج DNA ژنومی هلیکوباکتر پیلوری، PCR جهت تکثیر انجام شد. جهت کلونینگ ژن وارد وکتور pET32 شد و بعد از مستعد کردن باکتری اشریشیا‌کلی با کلسیم کلرید، وکتور نوترکیب vacA-pET32 را وارد اشریشیا‌کلی کرده و از باکتری E.coli BL21 به عنوان میزبان بیانی برای تولید پروتئین نوترکیب استفاده شد. سپس با روش SDS-PAGE بیان پروتئین نوترکیب تأیید گردید. از آن­جا که نتایج توالی­یابی نشان داد ژن مورد نظر به درستی انتخاب شده و نتایج SDS-PAGE نیز نشان‌دهنده بیان پروتئین نوترکیب بود، این پروتئین را می­توان به عنوان یک واکسن در نظر گرفت ]24[.
 Ghasemi و همکاران مطالعه­ای روی کلونینگ و بیان ناحیه بیماری­زایی babA2 برای تولید واکسن علیه هلیکوباکتر پیلوری انجام دادند. بعد از تخلیص DNA باکتری و تکثیر ژن babA2، جهت کلونینگ، ژن مورد نظر وارد وکتور pTZ شد. سپس وکتور نوترکیب babA2 - pTZ وارد باکتری اشریشیا‌کلی گردید. ژن مورد نظر با استفاده از روش هضم آنزیمی جداسازی شد و آزادی ژن با الکتروفورز روی ژل آگارز 1% بررسی گردید. جهت بیان از سیستم بیانی پروکاریوتی استفاد شد. بیان پروتئین نوترکیب نیز به روش SDS-PAGE تأیید شد و نتایج توالی­یابی نشان‌دهنده­ این بود که ژن babA2 به درستی انتخاب شده و می­توان از آن به عنوان کاندیدی برای واکسن ژنی علیه هلیکوباکتر پیلوری استفاده کرد ]25[ .
Maleki و همکاران ناحیه­ای از ژن cagA را براساس برنامه بیو‌انفورماتیکی شناسایی کردند و بعد از انجام PCR و کلون کردن در ناقل pET32 و بیان ژن در باکتری اشریشیا‌کلی، سپس صحت بیان پروتئین به روش SDS-PAGE تأیید شد. از آن­جا که نتایج نشان‌دهنده­ کلونینگ موفقت‌آمیز این ژن بود، گزارش شد که احتمالاً می­توان پروتئین نوترکیب بدست آمده را به عنوان کاندیدای مناسب برای واکسن ژنی معرفی کرد ]26[. Doosti و همکاران دو ژن P39 و stX2 به ترتیب مربوط به بروسلا ملیتنسیس و اشریشیا‌کلی را درون وکتور pcDNA3.1 کلون نمودند و سازواره ژنی  pcDNA3.1- stX2-p39 را به عنوان واکسن ژنی دوگانه بر علیه اشریشیا کلی و بروسلا ملیتنسیس معرفی نمودند ]27[.
Soleimani و همکاران بر روی ژن hpaA هلیکوباکتر پیلوری مطالعه­ای انجام دادند. بعد از استخراج DNA از هلیکوباکتر پیلوری، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن hpaA، PCR انجام شد. جهت انجام کلونینگ ژن وارد وکتور  pET28a و سپس وکتور نوترکیب وارد باکتری اشریشیا‌کلی شد. برای تأیید کلونینگ از روش هضم آنزیمی روی پلاسمید­های استخراج شده استفاده گردید. جهت بیان ژن از پروکاریوت (اشریشیا کلی سویه BL21) استفاده شد. از روش SDS-PAGE نیز برای تایید بیان پروتئین نوترکیب استفاده شد. از آن­جا که تمام نتایج این تحقیق برای ژن hpaA موفقیت آمیز بود در نتیجه می­توان گفت این مطالعه می­تواند جهت تولید واکسن ژنی علیه هلیکوباکتر پیلوری کمک کننده باشد ]28[.
مطالعات صورت گرفته توسط محققین ذکر شده از لحاظ همسانه سازی ژن هلیکوباکتر پیلوری و بررسی بیان پروتئین تولید شده توسط سازواره ساخته شده با مطالعه حاضر همخوانی دارد، با این تفاوت که در این مطالعه از وکتور pTZ57R/T جهت کلونینگ و از وکتور بیانی pEGFP-C2 جهت بیان ژن در سلول­های یوکاریوتی استفاده شد. وکتور بیانی pEGFP-C2 دارای یک ناحیه­ شروع همانندسازی SV40 در سلول­های پستانداران می­باشد، بنابراین این وکتور در سلول جانوری بیان دارد.
ممکن است محدودیت جذب پلاسمیدهای نوترکیب به درون سلول‌های نوترکیب و کاهش بیان محصول ژن هدف از محدودیت­های تحقیق در زمینه واکسن­های ژنی باشد که البته با کاربرد انواع نانوذرات یا استفاده از الکتروپوریشن بافتی این مساله حل شود.
نتیجه‌گیری
نتایج به­دست آمده در این مطالعه، کلون­سازی موفقیت آمیز ژن lnT را نشان داد. هم­چنین در این تحقیق مشخص شد که پلاسمید بیانی pEGFP-C2 وکتور مناسبی برای بیان ژن lnT می­باشد و مشاهده باند 47 کیلودالتونی به روش SDS-PAGE دلالت بر بیان این ژن در سلول­های یوکاریوتی دارد. بنابراین به نظر می­رسد می­توان از سازواره ژنی pEGFP-C2-lnT به عنوان یک پلاسمید دی ان ای واکسن برای تحقیقات آینده استفاده نمود.
تشکر و قدردانی
بدین وسیله از مسئولین بخش بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد به دلیل ارائه امکانات و تجهیزات آزمایشگاهی جهت انجام این پژوهش در قالب پایان­نامه کارشناسی ارشد و هم­چنین از جناب آقای دکتر حسین انصاری و آقای حمید­رضا کبیری به دلیل حمایت­های علمی تشکر و قدردانی می­گردد..
 
 
 
References
 
 
[1] Lv ZF, Wang FC, Zheng HL, Wang B, Xie Y, Zhou XJ, et al. Meta-analysis: is combination of tetracycline and amoxicillin suitable for Helicobacter pylori infection? World J Gastroenterol 2015; 21(8): 2522-33.
[2] Diaconu S, Predescu A, Moldoveanu A, Pop CS, Fierbințeanu-Braticevici C. Helicobacter pylori infection: old and new. J Med Life. 2017; 10(2): 112-7.
[3] Smith SI, Oyedeji KS, Arigbabu AO, Cantet F, Megraud F, Ojo OO, et al. Comparison of three PCR method for detection of Helicobacter pylori DNA and detection of cagA gene in gastric biopsy specimens. World J Gastroenterol 2004; 10(13): 1958-60. 
[4] Thorell K, Bengtsson-Palme J, Liu OH, Palacios Gonzales RV, Nookaew I, Rabeneck L, et al. In Vivo Analysis of the Viable Microbiota and Helicobacter pylori Transcriptome in Gastric Infection and Early Stages of Carcinogenesis. Infect Immun 2017; 85(10). pii: e00031-17.
[5] Vidal-Ingigliardi D, Lewenza S, Buddelmeijer N. Identification of essential residues in apolipoprotein N-acyl transferase, a member of the CN hydrolase family. J Bacteriol 2007; 189(12): 4456-64.
[6] Sutcliffe IC, Harrington DJ. Lipoproteins of Mycobacterium tuberculosis: an abundant and functionally diverse class of cell envelope components. FEMS Microbiol Rev 2004; 28(5): 645-59.
[7] Babu MM, Priya ML, Selvan AT, Madera M, Gough J, Aravind L, et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol 2006; 188(8): 2761-73.
[8] Kovacs-Simon A, Titball RW, Michell SL. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun 2011; 79(2): 548-61.
[9] McDonough JA, Hacker KE, Flores AR, Pavelka MS Jr, Braunstein M. The twin-arginine translocation pathway of Mycobacterium smegmatis is functional and required for the export of mycobacterial beta-lactamases. J Bacteriol 2005; 187(22): 7667-79.
[10] Sankaran K, Wu HC. Lipid modification of bacterial prolipoprotein. Transfer of diacylglyceryl moiety from phosphatidylglycerol. J Biol Chem 1994; 269(31): 19701-6.
[11] Okuda S, Tokuda H. Lipoprotein sorting in bacteria. Annu Rev Microbiol 2011; 65: 239-59.
[12] Robichon C, Vidal-Ingigliardi D, Pugsley AP. Depletion of apolipoprotein N-acyltransferase causes mislocalization of outer membrane lipoproteins in Escherichia coli. J Biol Chem 2005; 280(2): 974-83.
[13] Kargar M, Ghorbani-Dalini S, Doosti A, Baghernejad M. Molecular assessment of clarithromycin resistant Helicobacter pylori strains using rapid and accurate PCR-RFLP method in gastric specimens in Iran. Afr J Biotechnol 2011; 10(39): 7675-8.
[14] Lee JH, Park Y, Choi JR, Lee EK, Kim HS. Comparisons of three automated systems for genomic DNA extraction in a clinical diagnostic laboratory. Yonsei Med J 2010; 51(1): 104-10.
[15] Fathpour H, Doosti A, A Ghasemi-Dehkordi P, Shirazi G. Generation of pcDNA3.1-GH as a recombinant expression vector of ostrich growth hormone cDNA in Saccharomyces cerevisiae. Bulg J Vet Med 2015; 18(2): 99–104.
[16] Hashemzehi R, Doosti A, Kargar M, Jaafarinia M. Gene cloning and evaluation of the Acinetobacter baumannii nlpD gene expression in human dermal fibroblast cells using RT-PCR. Feyz 2017; 21(4): 359-66.
[17] Ben Chaabane N, Al-Adhba HS. Ciprofloxacin-containing versus clarithromycin-containing sequential therapy for Helicobacter pylori eradication: A randomized trial. Indian J Gastroenterol 2015; 34(1): 68-72.
[18] Olokoba AB, Obateru OA, Bojuwoye MO. Helicobacter pylori eradication therapy: A review of current trends. Niger Med J 2013; 54(1): 1-4.
[19] Megraud F, Lamouliatte H. The treatment of refractory Helicobacter pylori infection. Aliment Pharmacol Ther 2003; 17(11): 1333-43.
[20] Suzuki H, Masaoka T, Miyazawa M, Suzuki M, Miura S, Ishii H. Gastric mucosal response to Helicobacter pylori. Keio J Med 2002; 51(2): 40-4.
[21] Kaparakis M, Walduck AK, Price JD, Pedersen JS, Van Rooijen N, Pearse MJ, et al. Macrophages are mediators of gastritis in acute Helicobacter pylori infection in C57BL/6 mice. Infect Immun 2008; 76(5): 2235-9.
[22] Silva DG, Stevens RH, Macedo JM, Albano RM, Falabella ME, Fischer RG, et al. Presence of Helicobacter pylori in supragingival dental plaque of individuals with periodontal disease and upper gastric diseases. Arch Oral Biol 2010; 55(11): 896-901.
[23] Farjadi V, Abtahi H, Zolfaghari MR, Soufian S, Hasanzadeh L. Production of recombinant CagA protein of Helicobacter pylori. AMUJ 2013; 16(7): 35-44. [Farsi]
[24] Hasanzadeh L, Ghaznavi-Rad E, Soufian S, Farjadi V, Abtahi H. Expression and antigenic evaluation of  VacA antigenic fragment of Helicobacter pylori. Iran J Basic Med Sci 2013; 16(7): 835-40.
[25] Ghasemi SA, Arjunan S, Senthilkumar R. Clonning and expression of bab-Pathogenicity island antigens for the production of vaccine against Helicobacter pylori, the risk factor for gastric cancer. Asian J Pharm Clin Res 2014; 7(3): 88-92.
[26] Maleki M, Nassiri MR, Tahmoores pour M, Qazvini K. Cloning and Expression of Helicobacter Pylori CagA Gene Antigenic Regions in E. coli. J Fasa Univ Med Sci 2016; 6(1): 113-9. [Farsi]
[27] Doosti A, Ghasemi-Dehkordi P, Kargar M, Sharifi A. Generation of divalent DNA vaccine based on p39 and  shiga-like toxin2 (stx2) genes. Genetika 2015; 47(2): 499-507.
[28] Soleimani N, Mohabati Mobarez A, Farhangi B. Cloning, expression and purification flagellar sheath adhesion of Helicobacter pylori in Escherichia coli host as a vaccination target. Clin Exp Vaccine Res 2016; 5(1): 19-25.


Survey of Helicobacter Pylori lnT Gene Expression in HDF Cells by RT-PCR Method
 
 
R. Rahmani-Piani[3], A. Doosti[4]
 
Received: 03/05/2017  Sent for Revision: 07/10/2017    Received Revised Manuscript: 11/11/2017              Accepted: 20/11/2017
 
Background and Objectives: Helicobacter pylori is a gram-negative and spiral bacterium that causes stomach and duodenal disease in humans. Because of the presence of disadvantages in antibiotic therapies, increasing efforts  have been made to produce effective vaccine for this infection. The aim of this study was to generate a construct   carrying the lnT gene and to survey its expression in human cells with RT-PCR method. 
Materials and Methods: In this laboratory study, lnT gene from the genome of Helicobacter pylori bacterial was isolated via polymerase chain reaction (PCR). Cloning of the PCR products was done by T/A cloning method in the appropriate T vector. Then, the lnT gene was subcloned into a pEGFP-C2 eukaryotic expression vector. To study the lnT gene expression, the final pEGFP-C2-lnT construct was transformed into human dermal fibroblasts (HDF) cells by electroporation and its expression was analyzed by RT-PCR.
Results: The performance of the PCR resulted  in amplification of 1290 bp segment as to lnT gene. This gene was successfully cloned in pTZ vector and enzyme digestion and sequencing results showed lnT gene was subcloned in the expression vector and final construction of the pEGFP-C2-lnT was created. Gene expression analysis by RT-PCR showed the relevant band.
Conclusion: Based on the obtained results, lnT gene cloned in the pEGFP-C2 eukaryotic expression vector has the ability to produce  the specific product of this gene in eukaryotic cells. Therefore, this gene construction has the required potential to evaluate the immunogenicity in an animal model as a gene vaccine against Helicobacter pylori.
Key words: Helicobacter pylori, Cloning, lnT gene, RT-PCR
 
Funding: This research was funded by Shahrekord Branch, Islamic Azad University.
Conflict of interest: None declared.
Ethical approval: The Ethics Committee of Department of Biology, Shahrekord Branch, Islamic Azad University approved the study (IR.IAUSHK.1395.5213).
 
How to cite this article: Rahmani-Piani R, Doosti A. Survey of Helicobacter Pylori lnT Gene Expression in HDF Cells by RT-PCR Method. J Rafsanjan Univ Med Sci 2017; 16(9): 807-18. [Farsi]
 
 
[1]- کارشناس ارشد ژنتیک، گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران
[2]- (نویسنده مسئول) دانشیار ژنتیک مولکولی، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران
تلفن: 3361046-0383، دورنگار: 3361046-0383، پست الکترونیکی:abbasdoosti@yahoo.com  
 
[3]- MSc in  Genetics, Dept. of Biology, Faculty of Basic Science, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran
[4]Associate Prof.  of Molecular Genetics, Biotechnology Research Center, Dept. of Biology, Faculty of Basic Science, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran
(Corresponding Author): Tel: (0383) 3361046, Fax:(0383)3361046, Email: abbasdoosti@yahoo.com
نوع مطالعه: كاربردي | موضوع مقاله: زيست شناسي
دریافت: ۱۳۹۵/۷/۱۷ | پذیرش: ۱۳۹۶/۱۰/۱۸ | انتشار: ۱۳۹۶/۱۰/۱۸

ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
CAPTCHA code

ارسال پیام به نویسنده مسئول


کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق

© 2018 All Rights Reserved | Journal of Rafsanjan University of Medical Sciences

Designed & Developed by : Yektaweb