مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

مقاله پژوهشی

مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان
دوره 17، مهر 1397، 610-597
 
نقش گیرنده­های استروژنی هسته پاراژیگانتوسلولاریس جانبی در تعدیل درد القاء شده با فرمالین در موش­های صحرایی ماده
 
رقیه خاکپای[1]، زهرا حیدرزاده[2]، فاطمه خاکپای[3]
 
دریافت مقاله: 20/3/96   ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 6/8/96      دریافت اصلاحیه از نویسنده: 11/2/97         پذیرش مقاله: 30/3/97
 
 

چکیده
زمینه و هدف: از آنجایی­که تزریق 17 بتا-استرادیول به هسته پاراژیگانتوسلولاریس جانبی (LPGi) موجب بی­دردی می­شود و احتمال دارد که این بی­دردی به وسیله گیرنده­های استروژنی وساطت شود، لذا در این پژوهش نقش گیرنده­های استروژنی (هنگام تحریک توسط داروی 17بتا-استرادیول) این هسته در تعدیل درد القاء شده توسط فرمالین، در طی فاز استروس در موش­های صحرایی­ ماده بررسی شده است.
مواد و روش­ها:  در این مطالعه تجربی، 48 سر موش­های صحرایی ماده نژاد ویستار (270-200 گرم) به طور تصادفی به 8 گروه تقسیم شدند که شامل گروه کنترل، Sham، نرمال سالین (حلال 17 بتا-استرادیول)، DMSO (حلال ICI182,780)، 17 بتا-استرادیول، آنتاگونیست گیرنده­های استروژنی (ICI182,780, 15&50 nmol) و ICI182,780/17 بتا-استرادیول بود. با ورود حیوان به فاز استروس، داروها به هسته پاراژیگانتوسلولاریس جانبی (LPGi) تزریق ­شد؛ پس از 15 دقیقه، 50 میکرولیتر از محلول فرمالین %5 به پنجه پای چپ حیوان تزریق شد و سپس رفتار تکان دادن پای ملتهب ناشی از تزریق فرمالین به مدت یک­ساعت بررسی ­شد. داده­ها با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه و آزمون تعقیبی Tukey تجزیه و تحلیل تحلیل شدند.
یافته­ها: نتایج نشان داد که طی فاز استروس، تیمار هسته­ LPGi با 17بتا-استرادیول، رفتار تکان دادن پای ملتهب را در هر دو فاز آزمون فرمالین به طور معنی­داری کاهش می­دهد (001/0p<). پیش­تیمار هسته­LPGi  با ICI182,780 از اثر ضد­دردی ناشی از 17بتا-استرادیول جلوگیری کرد (001/0p<).
نتیجه­گیری: بر اساس نتایج این مطالعه، می­توان پیشنهاد کرد که تزریق 17بتا-استرادیول به هسته­ LPGi در فاز استروس بی­دردی قوی در موش­های ماده القاء می­کند که ممکن است به وسیله گیرنده­های استروژنی میانجی­گری ­شود.
واژه­های کلیدی: 17بتا-استرادیول، فاز استروس، ICI182,780، تعدیل درد، هسته پاراژیگانتوسلولاریس جانبی، موش صحرایی ماده

مقدمه
درد فرآیندی حفاظتی است که از واکنش بدن به آسیب بافتی بالفعل، بالقوه و/یا تخریب بافتی ناشی می‌شود [1]. چندین سیستم تعدیل درد در سیستم اعصاب مرکزی (Central Nervous system, CNS) پاسخ به تحریک دردزا را تعدیل می‎کنند. یکی از سیستم­های درگیر در تعدیل درد، مسیر پایین­روی نورآدرنرژیک است که هسته­ پاراژیگانتوسلولاریس ­جانبی (Paragigantocellularis lateralis; LPGi) یکی از ساختارهای مهم این مسیر می­باشد [2].
هسته ­ LPGiیکی از  هسته­های مهم درگیر در تعدیل درد می­باشد که در ناحیه‌ی سری-شکمی-کناری بصل‌النخاع (RVLM) قرار گرفته است. این هسته ورودی‌های خود را از مناطق مختلف درگیر در درک درد هم­چون هسته­ لوکوس سرولئوس، ماده خاکستری دورقناتی و هسته رافه دریافت می­کند. نورون­های LPGi فیبرهای خروجی خود را به هسته­های مهمی هم­چون هسته­ رافه دمی و لوکوس­سرولئوس ارسال می­کنند [3]. نورون­های هسته­  LPGiبه محرک­های دردناک پاسخ می‌دهند و در پردازش اطلاعات درد، ارسال سیگنال های درد و نیز تعدیل درد اهمیت زیادی دارند [4].
از آغاز بلوغ جنسی تا دوازده ماهگی، چرخه­ فحلی موش­های صحرایی ماده چهار روز طول می­کشد. این چرخه دارای چهار فاز می­باشد که به ترتیب زمانی عبارتند از: فازهای پرواستروس، استروس، مت­استروس و دی‌استروس. سطح سرمی هورمون­های جنسی موش­های صحرایی در هر فاز با بقیه فازها تفاوت دارد [5]. افزایش سطح سرمی هورمون استرادیول از فاز مت­استروس شروع می­شود و طی فاز پرواستروس به بالاترین سطح خود ی‌رسد. سطح سرمی استرادیول طی فاز استروس دوباره به سطح پایه­ای خود برمی­گردد [6].
در حیوانات ماده، چرخه­ تولید مثلی و تغییرات ترشح هورمون­های جنسی طی فازهای مختلف این چرخه عملکردهای مختلف سیستم عصبی از جمله درک درد را تحت تأثیر قرار می­دهند. مکانیسم­های مرکزی و محیطی روندهای پایه­ای احساس و تعدیل درد در جنس نر و ماده متفاوت می­باشد [7]، که ممکن است به دلیل تفاوت هورمون­های جنسی در حیوانات نر و ماده ­باشد [8].
در مغز، 17بتا-استرادیول از  تستوسترون موجود در گردش خون سنتز می­شود و ممکن است در تعدیل درد نقش داشته باشد [9]. تفاوت­­های جنسی در پاسخ­های رفتاری به فرمالین در موش­های ­صحرایی [10] و موش سوری [11]­ نشان داده ­شده­ است و مشاهدات نشان داده‌اند که موش­های ماده به تزریق فرمالین به درون پنجه پای عقبی، پاسخ شدیدتری نسبت به موش­های نر نشان می­دهند [11]. مطالعاتی که آستانه درد را در مدل­های درد حاد در موش­های صحرایی بررسی کرده­اند، نشان داده است که آستانه درد در فازهای پرواستروس و استروس نسبت به فازهای مت­استروس و دی­استروس پایین­تر است [13-12]. هم­چنین مشاهده شده است که آستانه درد موش­های صحرایی نر با آستانه درد موش­های صحرایی ماده طی فازهای مختلف چرخه فحلی تفاوتی ندارد، اما در موش­های صحرایی ماده، آستانه درد در طی فازهای پرواستروس و دی­استروس به صورت معنی­داری از آستانه درد در طی فاز استروس پایین­تر است [14].
طی مطالعات پیشین مشخص شده­ است که تزریق 17بتا-استرادیول به ­داخل هسته­ LPGi موش­های صحرایی نر و موش­های صحرایی ماده اوارکتومی شده، در مدل دردالتهابی آزمون فرمالین سبب القاء بی­دردی می‌شود و ممکن است این اثر بی­دردی از طریق گیرنده‌های استروژنی میانجی­گری شود [16-15]. بنابراین پژوهش حاضر به­منظور بررسی نقش گیرنده­­های استروژنی هسته LPGi در اثر تعدیل­کنندگی 17بتا-استرادیول بر روی درد التهابی در موش­های صحرایی ماده­ طی فاز استروس چرخه فحلی حیوانات ماده، انجام گرفته است.
مواد و رو‌ش‌ها
حیوانات
در این مطالعه تجربی همه آزمایشات طی سال­های 1396-1395 در آزمایشگاه فیزیولوژی جانوری گروه علوم جانوری دانشگاه تبریز انجام شده است. در این پژوهش تجربی از موش­های صحرایی ماده نژاد Wistar، در محدوده­ وزنی 200 تا 270 گرم استفاده ­شد که از دانشکده دامپزشکی دانشگاه ارومیه خریداری ­شدند. آب و غذا به طور کامل و آزادنه در دسترس حیوانات قرار داشت. هم­چنین حیوانات در دمای استاندارد 1±23 درجه سانتی­گراد، رطوبت نسبی  15±50 درصد و سیکل روشنایی/تاریکی 12 ساعته نگه­داری می­شدند. کلیه­ آزمایشات براساس دستورالعمل‌های اخلاقی انجمن بین‌المللی مطالعه درد در مورد حیوانات آزمایشگاهی انجام شد [17]. هم­چنین این مطالعه دارای کد اخلاق به شماره 30352 از دانشگاه علوم پزشکی تبریز می­باشد.
در این مطالعه، 42 موش صحرایی ماده که در فاز استروس قرار داشتند به طور تصادفی به 7 گروه آزمایشی تقسیم شدند که شامل گروه کنترل (آزمون فرمالین در حیوانات دست نخورده)، گروه Sham (فقط کانول‌گذاری هسته­ LPGi)، گروه سالین (تزریق نرمال­سالین به عنوان حلال 17بتا‌استرادیول به هسته­LPGi موش صحرایی ماده­)، گروه DMSO (تزریق DMSO به­­عنوان حلال آنتاگونیست گیرنده­های استروژنی (ICI 182,780 15) به هسته­ LPGi موش صحرایی ماده­)، گروه 17بتا-استرادیول (تزریق 8/0 میکرومول 17بتا-استرادیول به هسته­ LPGi موش صحرایی ماده­)، گروه ICI 50 nmol (تزریق 50 نانومول 15 182,780 ICI به هسته­ LPGi موش صحرایی ماده)، گروه  ICI 15 nmol (تزریق 15 نانومول 15 182,780 ICI به هسته­ LPGi موش صحرایی ماده) و گروه ICI /17بتا-استرادیول (15 دقیقه قبل از تیمار هسته­ LPGi با 8/0 میکرومول 17بتا‌استرادیول، نانومول  15 182,780 ICI به داخل هسته LPGi، موش صحرایی ماده­ تزریق شد) بود [16]. پیش از شروع آزمایشات مربوط به این پژوهش، هم­سیکل کردن موش­های صحرایی ماده انجام ­شد.
برای بررسی پاسخ­های رفتاری القاء­ شده با فرمالین طی فاز استروس چرخه فحلی، بایستی تمامی موش­های صحرایی مورد آزمایش در فاز استروس قرار داشته باشند. مطالعات نشان داده است که اگر حیوانات ماده به مدت دو هفته در کنار هم و در یک قفس نگه­داری شوند، چرخه فحلی آن‌ها باهم هم­زمان می­شود [18]. پس از گذشت دو هفته، از واژن آن‌ها اسمیرگیری واژنی انجام شده و نمونه­ به‌دست‌آمده به لام منتقل شده و فاز استروس چرخه فحلی براساس وجود تعداد زیاد سلول­های شاخی­شده تشخیص داده ­شد [6]. پس از تأیید هم سیکل بودن موش­های صحرایی مورد مطالعه در هر گروه، آزمون فرمالین در  فاز استروس انجام­ شد. برای تزریق داروها، ابتدا کانو­ل­گذاری هسته LPGi انجام ­شد. بدین منظور ابتدا حیوان با مخلوطی از کتامین (80 میلی­گرم بر کیلوگرم) و زایلازین (10 میلی­گرم بر کیلوگرم بی­هوش شد.
سپس حیوان در دستگاه استرئوتاکسی (Stoelting, USA) مستقر شده و پوست سر در حدود 2 سانتی­متر برش داده ­­شد. پس از زدودن بافت‌های پوششی سطح جمجه، نواحی برگما و لامبدا شناسایی شده و براساس مختصات هستهLPGi  در اطلس پاکسینوس، سطح جمجمه علامت­گذاری­ شد به طوری­که مختصات جلویی-  عقبی:(AP)  2/12- میلی‌متر؛ طرفی (L): 6/1± میلی‌متر و پشتی-  شکمی (DV): 5/10 میلی‌متر بود [19] .
محل مشخص شده بر روی جمجمه براساس مختصات هسته LPGi  به وسیله مته دندانپزشکی به اندازه قطر کانول راهنما، سرسرنگ شماره 23، سوراخ ­شد و کانول راهنما براساس عمق ذکر شده در اطلس پاکسینوس برای این هسته، در درون مغز قرار ­گرفت و انتهای خارجی کانول راهنما روی جمجمه به­وسیله سیمان دندانپزشکی ثابت ­گردید. پیچ کوچکی نیز به صورت وارونه در استخوان جمجمه قرار داده شده و در درون سیمان دندانپزشکی ثابت گردید. این پیچ به منظور استحکام سیمان استفاده شده است تا از جدا شدن آن از سطح جمجمه جلوگیری کند. از استایلت برای بستن منفذ کانول راهنما استفاده شد که فقط در زمان­ تزریق دارو برداشته ­شد [20].
کانول تزریق از سرسوزن شماره­ 30 و حدود دو میلی‌متر بلندتر [20 ،3] از کانول راهنما تهیه شد. در هنگام تزریق دارو، قسمت خارجی کانول تزریق به یک لوله­ نازک پلی­اتیلن وصل ­شد و سر دیگر لوله­ پلی­اتیلن نیز به سرنگ هامیلتون وصل شد و 500 نانولیتر از داروی مورد نظر به هسته LPGi تزریق ­شد. یک هفته بعد از اتمام جراحی، آزمون رفتاری روی موش­ها انجام شد [20].
داروهای مورد نیاز این مطالعه 17بتا-استرادیول، اگونیست گیرنده­های استروژن و 182,780 ICI به آنتاگونیست اختصاصی گیرنده­های استروژن از شرکت سیگما خریداری شدند که به ترتیب در نرمال سالین و DMSO  حل شدند. در روز  آزمایش 500 نانولیتر از داروهای مورد مطالعه  به وسیله سرنگ هامیلتون به صورت یک طرفه به هسته LPGi راست تزریق شدند و 15 دقیقه بعد از تزریق دارو آزمون فرمالین انجام شد [20].
برای بررسی اثر استرادیول بر روی تعدیل درد از آزمون فرمالین استفاده شد. در آزمون فرمالین به منظور مشاهده و بررسی رفتارهای حیوان، از یک محفظه شفاف با کف مسطح، به ابعاد 30×30×30 سانتی­متر مکعب و از جنس پلکسی­گلس استفاده ­شد. برای مشاهده پنجه پای حیوان، در زیر این محفظه شفاف، آینه­ای با زاویه 45 درجه تعبیه شده است.
در این آزمون، 50 میکرولیتر محلول فرمالین 5 درصد به کمک سرنگ انسولین به زیر پوست پنجه پای چپ حیوان تزریق شد. پس از  تزریق فرمالین حیوان رفتارهای دردی ناشی از التهاب القاء شده با فرمالین را نشان می­داد که در این مطالعه  رفتار تکان دادن پای ملتهب (Paw Jerking Frequency) به مدت یک ساعت ثبت شد. فرکانس تکان دادن پای ملتهب ثبت شده از زمان تزریق تا دقیقه­ 7 به عنوان فاز اول و فرکانس ثبت شده از دقیقه 16 تا دقیقه­ 60 به عنوان فاز دوم در نظر گرفته شد [20].
پس از خاتمه­ آزمون، رنگ Pontamine sky blue به هسته LPGi تزریق ­شد تا از تزریق صحیح دارو به این هسته­ اطمینان حاصل شود. سپس حیوان با دوز بالای اتر کشته ­شده مغز حیوان خارج شده و ساقه مغز برش‌گیری شده و محل تزریق رنگ با مختصات هسته LPGi در اطلس پاکسینوس تطبیق داده شد [19]، فقط داده‌های مربوط به حیواناتی که برش مغزی آنها مطابق با مختصات هسته LPGi در اطلس پاکسینوس بود برای آنالیز داده‌ها مورد استفاده قرار گرفت [20].
آنالیز آماری داده­ها با استفاده از نسخه 16 نرم‌افزار SPSS و ترسیم نمودارها با کمک نسخه 2016 نرافزارExcel  انجام شد. نرمال بودن توزیع داده‌ها به وسیله آزمون آماری Shapiro-Wilk بررسی شد (05/0p>). همگن بودن واریانس داده­ها با کمک آزمون Levene انجام شد (05/0p>). نتایج آزمایشگاهی به صورت انحراف معیار±میانگین (برای 6 سر موش صحرایی) گزارش شد. از آزمون آنالیز واریانس یک­طرفه در سطح معنی­داری (05/0p<) و آزمون تعقیبی Tukey برای تجزیه و تحلیل داده­ها استفاده شد.
نتایج
فازهای اول و دوم فرکانس تکان دادن پای ملتهب، گروه­های کنترل، جراحی و کانول­گذاری هسته­ LPGi (گروه Sham)، تزریق 500 نانولیتر سالین به‌­عنوان حلال 17بتا-استرادیول و تزریق DMSO به­­عنوان حلال 182,780 ICI به­ داخل هسته­ LPGi تغییر معنی­داری را نسبت به یکدیگر نشان ندادند ](نمودار 1)، فاز اول (316/0p=) و فاز اول (164/0p=)[.

 
نمودار 1. اثر ضددردی ناشی از تزریق 8/0 میکرومول 17بتا-استرادیول به­ داخل هسته­ی LPGi روی فرکانس تکان­­دادن پای ملتهب طی آزمون فرمالین. ***(001/0p<) نشان­دهنده­ اختلاف معنی­دار با گروه کنترل، †††(001/0p<) با گروه نرمال­سالین، ### (001/0p<) با گروه Sham و $$$(001/0p<) با گروه DMSO می‌باشد. میانگین پاسخ­ رفتاری دقیقه اول تا دقیقه 7 آزمون به عنوان فاز اول و میانگین پاسخ رفتاری بین دقیقه­های 16 تا 60 به عنوان فاز دوم در نظر گرفته شد. 6 سر موش صحرایی به صورت تصادفی در هر گروه قرار گرفت و داده­ها به­صورت Mean±SEM نشان داده شده­اند. :Control حیوانات دست­نخورده، :Sham فقط کانول­گذاری هسته­ی LPGi، :Saline تزریق نرمال­سالین به هسته‌ی LPGi، :DMSO تزریق DMSO به هسته­ی LPGi و :E2 تزریق 8/0 میکرومول 17بتا-استرادیول به هسته­ی LPGi.
تزریق 8/0 میکرومول 17بتا-استرادیول به داخل هسته LPGi تعداد دفعات تکان دادن پای ملتهب را در طی فاز اول آزمون فرمالین نسبت به گروه­های کنترل (001/0p<)، Sham (001/0p<)، سالین (001/0p<) و DMSO (05/0p<) به طور معنی­داری کاهش داد (نمودار 1). هم­چنین، تزریق 8/0 میکرومول 17بتا-استرادیول در طی فاز دوم تعداد دفعات تکان دادن پای ملتهب را نسبت به گروهای کنترل، سالین، Sham و DMSO (001/0p<) به طور معنی­داری کاهش داد (نمودار 1).
تزریق 50 نانومول 182,780 ICI فاز اول رفتار تکان دادن پای ملتهب را نسبت به گروه­های کنترل (01/0p<)، DMSO (05/0p<) و دوز 15 نانومول 182,780 ICI (001/0p<) به طور معنی­داری افزایش داد (نمودار 2). ولی تزریق 15 نانومول 182,780 ICI اثر معنی­داری روی رفتار تکان دادن پای ملتهب طی فاز اول و دوم آزمون فرمالین نداشت ](نمودار 2) فاز اول (218/0p=) و فاز اول (473/0p=)[.
از آن­جایی که برای ادامه مطالعه دوزی از آنتاگونیست مورد نیاز بود که علی رغم داشتن اثر آنتاگونیستی تعدیل درد را تحت تأثیر قرار ندهد. براساس نتایج به دست آمده از همین مطالعه و براساس نتایج نمودار 2 غلظت 15 نانومول 182,780 ICI برای ادامه مطالعه انتخاب شد.
پیش­تیمار هسته­ LPGi با 15 نانومول 182,780 ICI ، بی­دردی استرادیولی مربوط به فاز اول و دوم رفتار تکان دادن پای ملتهب را خنثی نمود ](001/0p<) و (نمودار 3)[؛ ولی به طور کامل به شرایط کنترل برنگشت و هنوز تفاوت معنی­داری با گروهای کنترل، سالین و استرادیول داشت ](001/0p<) و (نمودار 3) [.
 

نمودار 2. تعدیل درد ناشی از تزریق 15 و 50 نانومول 182,780 ICI (آنتاگونیست­ اختصاصی گیرنده­های استروژنی) به ­داخل هسته­ی LPGi روی فاز اول و دوم فرکانس تکان­دادن پای ملتهب در آزمون فرمالین. **(01/0p<) نشان­دهنده­ی اختلاف معنی­دار با گروه کنترل، $(05/0p<) با گروه DMSO و ‡‡(01/0p<) با گروه ICI 15nmol می­باشد. میانگین پاسخ­ رفتاری دقیقه اول تا دقیقه 7 آزمون به عنوان فاز اول و میانگین پاسخ رفتاری بین دقیقه­های 16 تا 60 به عنوان فاز دوم در نظر گرفته شد. 6 سر موش صحرایی به صورت تصادفی در هر گروه قرار گرفت و داده­ها به­صورت Mean±SEM نشان داده شده­اند. Control حیوانات دست­نخورده، :DMSO تزریق DMSO به هسته­ LPGi، :ICI 50 nmol تزریق 50 نانومول 15 182,780 ICI به هسته­ LPGi و  :ICI 15 nmol تزریق 15 نانومول 15 182,780 ICI به هسته­ LPGi.

نمودار 3. اثر پیش­تیمار هسته­ی LPGi با 15 نانومول ICI 182,780 روی تعدیل دردر ناشی از تزریق 17بتا-استرادیول به­ داخل هسته­ی LPGi در آزمون درد التهابی ناشی از فرمالین. میانگین پاسخ­ رفتاری دقیقه اول تا دقیقه 7 آزمون به عنوان فاز اول و میانگین پاسخ رفتاری بین دقیقه­های 16 تا 60 به عنوان فاز دوم در نظر گرفته شد. 6 سر موش صحرایی به صورت تصادفی در هر گروه قرار گرفت و داده­ها به­صورت Mean±SEM نشان داده شده­اند. ***(001/0p<) نشان­دهنده­ی اختلاف معنی­دار با گروه کنترل، †††(001/0p<) با گروه سالین و §§§(001/0p<) با گروه 8/0 میکرومول 17بتا-استرادیول می­باشد. Control: حیوانات دست­نخورده، :Saline تزریق نرمال­سالین به هسته­ی LPGi، :E2 تزریق 8/0 میکرومول 17بتا-استرادیول به هسته­ی LPGi و ICI/E2: تزریق 15 نانومول 182,780 ICI به داخل هسته­ LPGi، 15 دقیقه پیش از تزریق 8/0 میکرومول 17بتا-استرادیول.
بحث
نتایج به دست آمده از پژوهش حاضر نشان داد که تزریق دوز 8/0 میکرومول 17 بتا-استرادیول طی فاز استروس چرخه فحلی به هسته LPGi موش­های صحرایی ماده سبب القاء بی­دردی شده است، به طوری­که رفتار تکان دادن پای ملتهب ناشی از تزریق فرمالین را در مقایسه با گروه کنترل کاهش داده است. پیش­تیمار این هسته با آنتاگونیست اختصاصی گیرنده­های استروژن (182,780ICI ) از القاء اثر بی­دردی جلوگیری کرده است ولی احساس درد هنوز به شرایط پایه­ برنگشته است. بنابراین احتمال دارد که گیرنده­های استروژنی در القاء بخشی از اثر بی­دردی ناشی از 17بتا-استرادیول درگیر باشند. استرادیول در تعدیل درد نقش دارد [13] و تزریق آن پاسخ­های رفتاری به دردزاهای حاد و پایدار را هم در حیوانات ماده [22] و هم در حیوانات نر [23] تغییر می‌دهد. بسیاری از مطالعات اخیر نیز نقش استروئیدهای جنسی را در پاسخ به درد زا حاد بررسی کرده‌اند ولی نتایج گزارش شده بحث برانگیز هستند. به عنوان مثال هم افزایش و هم کاهش آستانه پاسخ به آزمون صفحه داغ و مدت زمان تأخیر آزمون پس کشیدن دم به وسیله استرادیول گزارش شده است ]25-24[. در پژوهش اخیر نیز 17 بتا-استرادیول به داخل هسته LPGi موش‌های صحرایی ماده طی فاز استروس چرخه فحلی تزریق شد تا اثرات مرکزی این نورواستروئید در پردازش پاسخ‌های رفتاری به درد التهابی ناشی از تزریق  فرمالین طی فاز اول (فاز حاد درد) و فاز دوم (فاز درد مداوم) آزمون فرمالین بررسی شود. در این پژوهش نیز در ادامه مطالعات پیشین، غلظت 8/0 میکرومول 17 بتا-استرادیول که در مطالعات پیشین اثر ضددردی مو^ءثرتری را بر  روی رفتار تکان دادن پای ملتهب اعمال می­کرد، برای ادامه آزمایشات انتخاب شد. تزریق 8/0 میکرومول 17 بتا-استرادیول به داخل هسته LPGi موش­های صحرایی ماده در طی فاز استروس، فرکانس رفتار تکان دادن پای ملتهب را در هر دو فاز اول و دوم آزمون فرمالین کاهش داد که نشان دهنده­ اثر ضددردی آن روی درد حاد و پایدار می­باشد. به دلیل آن که رفتار تکان دادن پای ملتهب یک رفلکس فازیک است، بنابراین کاهش فرکانس این رفتار نشان­دهنده افزایش آستانه درد است. چرخه فحلی حیوانات ماده و چرخه ترشح هورمون­های جنسی، اعمال مختلف سیستم عصبی از جمله درک درد را تحت تأثیر قرار می­دهد [5]. آستانه درد در موش­های صحرایی ماده در فازهای مختلف چرخه فحلی متفاوت می‌باشد به گونه­ای که در مدل دردی تحریک دردزا پای عقبی، آستانه درد در فاز پرواستروس و استروس نسبت به سایر فازهای چرخه فحلی پایین­تر است [26، 6]، که نتایج این مطالعه مغایرت دارد. با این حال نشان داده شده است که  در مدل درد حرارتی آزمون پس کشیدن دم، موش­های صحرایی ماده طی  فاز استروس دارای بالاترین قدرت تحمل هستند که فقط یک درجه پایین­تر از جنس نر می­باشد [27، 13]، که با نتایج این پژوهش هم­خوانی دارد. نتایج مطالعه حاضر نشان داد که تزریق ۱۷ بتا-استرادیول به هسته LPGi، طی هر دو فاز اول و دوم آزمون فرمالین دارای اثر ضد دردی بوده است. Kuba و همکاران نشان دادند که در موش­های صحرایی اوارکتومی شده، استرادیول اثری روی فاز حاد آزمون فرمالین ندارد [27]، که با نتایج ما مغایرت دارد. Mannino و همکاران نیز نشان دادند که تزریق دوزهای مختلف 17بتا-استرادیول به موش‌های صحرایی ماده پاسخ­های رفتاری ناشی از تزریق فرمالین را طی فاز حاد آزمون فرمالین تغییر نمی‌دهد و این رفتارها فقط طی فاز مزمن آزمون کاهش می‌یابد [28]. Khakpay و همکاران نیز نشان دادند که تزریق 17بتا-استرادیول به داخل هسته لوکوس سرلئوس اثری بر فاز حاد رفتارهای القاء شده با فرمالین ندارد، ولی فاز دوم این رفتارها را کاهش می­دهد [20].
اما غلظت و نحوه تزریق استرادیول، روش­های سنجش درد و جنس حیوانات مورد استفاده در مطالعات ذکر شده متفاوت بوده است. استرادیول فاز دوم آزمون فرمالین را در موش­های صحرایی اوارکتومی شده، از طریق تغییر سطوح پروستاگلاندین E2 و کورتیزول تعدیل می‌نماید [27]، که در پژوهش حاضر نیز استرادیول در پاسخ به درد التهابی القاء شده با فرمالین نقش داشته و باعث کاهش احساس درد ­گردید. تزریق داخل بطنی استرادیول به موش­های صحرایی نر رفتارهای تکان دادن، لیسیدن و خم کردن پای ملتهب را کاهش می­دهد [23]، که با نتایج حاصل از مطالعه حاضر هم­خوانی دارد. هم­چنین Khakpay و همکاران گزارش دادند که  تزریق ۱۷ بتا-استرادیول به هسته LPGi، رفتارهای ناشی از فرمالین را در فاز دوم آزمون فرمالین کاهش می­دهد [29].
در موش­های صحرایی ماده در مقایسه با موش­های صحرایی نر تحریک‌پذیری فیبرهای آوران اولیه در فاز دوم آزمون فرمالین بالاتر است که توسط استرادیول القاء می­گردد [30]، که با یافته­های این پژوهش مطابقت دارد. استرادیول در مدل درد التهابی ناشی از فرمالین سبب کاهش رفتارهای ناشی از درد می­شود [28]، که با یافته‌های مطالعه حاضر سازگار است. برخلاف یافته­های این مطالعه، Gaumond و همکارانش نشان دادند که در طی اینترفاز آزمون فرمالین، هورمون‌های تخمدانی نقش بارزتری را در کنترل و تعدیل درد ایفاء می­کنند و اثر تعدیلی 17بتا-استرادیول نسبت به سایر مشتقات هورمون‌های جنسی ماده بیشتر می­باشد [31]. با این حال، کارایی هورمون­های جنسی مردانه، و به طور عمده تستوسترون، در کاهش احساس درد در فاز حاد و مزمن آزمون فرمالین بسیار بیشتر است بدون آن­که اثری بر فاز میانی داشته باشند [31]، ولی غلظت و نحوه تزریق استرادیول در مطالعات ذکر شده متفاوت بوده است. برخلاف این یافته­ها و مطابق با نتایج پژوهش حاضر، Ceccarelli و همکارانش نشان دادند که انجام عمل گنادکتومی در حیوانات نر اثری بر نتایج آزمون فرمالین ندارد و در این حیوانات نتایج آزمون فرمالین مشابه حیوانات سالم می­باشد [32]، که این امر نشان دهنده اثرات متفاوت هورمون­های جنسی در تعدیل فازهای مختلف درد می­باشد [33]. تزریق دوز بالاتر آنتاگونیست گیرنده 17بتا-استرادیول (182,780ICI ) به داخل هسته  LPGiسبب ایجاد پر دردی شد که با اثر آنتاگونیستی این دارو بر روی گیرنده­های استروژنی قابل توجیه است، ولی دوز 15 نانومول 182,780 ICI تعدیل درد را تحت تأثیر قرار نداد، و به همین دلیل برای ادامه مطالعه انتخاب شد.
در این مطالعه پیش­تیمار هسته LPGi با 182,780 ICI  اثر ضددردی 17بتا-استرادیول روی رفتار تکان دادن پای ملتهب طی فاز استروس چرخه فحلی را خنثی نمود ولی این اثر چندان قوی نبود و نتوانست آن را به شرایط پایه­ای و کنترل برگرداند. مطابق با این مطالعه Khakpay و همکاران گزارش کردند که بخشی از بی­دردی ناشی از 17 بتا-استرادیول روی رفتار تکان دادن پای ملتهب در موش­های صحرایی نر به وسیله گیرنده­های استروژنی وساطت می­شود [29].
تزریق آنتاکونیست گیرنده 17 بتا‌استرادیول به داخل هسته  لوکوس سرلئوس نتوانست اثرات ضد دردی 17بتا-استرادیول روی رفتارهای التهابی ناشی از فرمالین را در موش­های صحرایی نر خنثی نماید [20، 3]، که با نتایج حاضر مغایرت دارد، اما غلظت و محل تزریق استرادیول و جنس حیوانات مورد استفاده در مطالعات ذکر شده متفاوت بوده است. با این‌حال، به دلیل عوارض جانبی هورمون­درمانی، مطالعات تکمیلی درباره مکانیسم اثر 17بتا-استرادیول و نقش گیرنده­های غشایی سایر نوروترانسمیترها مانند گیرنده­های NMDA،  AMPA/Kainate و GABAA پیشنهاد می‌شود.

نتیجه‌گیری
نتایج پژوهش حاضر نشان داد که تزریق 17 بتا‌-استرادیول به داخل هسته­ LPGi طی فاز استروس چرخه فحلی باعث القاء بی­دردی قوی می­شود. از آن­جایی که کاهش فرکانس رفتار تکان دادن پای ملتهب نشان­دهنده افزایش آستانه درد است، بنابراین می­توان نتیجه گرفت که در سطح رفتاری، ممکن است گیرنده­های استروژنی هسته LPGi  در اثر ضددردی استرادیول درگیر باشند. اثر ضددردی 17بتا-استرادیول احتمالا″ با فعال‌سازی گیرنده‌های استروژنی هسته­ LPGi، هسته لوکوس سرولئوس و مسیر پایین­روی نورآدرنرژیک تعدیل درد را فعال نموده و فعالیت نورونی مدارهای نخاعی تحریک شده با محرک­های دردی را تحت تأثیر قرار داده و سبب القاء بی­دردی می­گردد. بنابراین جایگزینی استرادیول در بانوان و به ویژه بانوان یائسه ممکن است به عنوان یکی از راه­کارهای درمانی احتمالی برای تسکین دردهای پایدار و مداوم تا حدودی مفید واقع شود.
تشکر و قدردانی
این مطالعه با حمایت مالی و تامین بودجه اجرای پروژه توسط دانشگاه تبریز به انجام رسیده است. بدین وسیله از این دانشگاه تشکر و قدردانی می‌شود.
.

 
 
 

References
 

1. Tracey I, Mantyh PW. The cerebral signature for pain perception and its modulation. Neuron 2007; 55(3): 377-91.
2. Aston-Jones G, Shipley MT, Chouvet G, Ennis M, van Bockstaele E, Pieribone V, et al. Afferent regulation of locus coeruleus neurons: anatomy, physiology and pharmacology. Prog brain res 1991; 88: 47-75.
3. Andrezik JA, Chan-Palay V, Palay SL. The nucleus paragigantocellularis lateralis in the rat. Conformation and cytology. Anat Embryol 1981; 161(4): 355-71.
4. Shen F, Yu W. Study of cytochemical properties in the nucleus paragigantocellularis lateralis of rats. J West China Uni Med Sci 1994; 25(3): 271-4.
5. Long JA, Evans HM. The oestrous cycle in the rat and its associated phenomena. University of California Press; 1922.
6. Marcondes FK, Bianchi FJ, Tanno AP. Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations. Brazil J Biol 2002; 62(4A): 609-14.
7. Normandin JJ, Murphy AZ. Nucleus paragigantocellularis afferents in male and female rats: organization, gonadal steroid receptor expression, and activation during sexual behavior. J Comp Neurol 2008; 508(5): 771-94.
8. Fillingim RB, Ness T. Sex-related hormonal influences on pain and analgesic responses. Neurosci Biobehav Rev 2000; 24(4): 485-501.
9. Chen Y, Cui Y, Lin JW, Xiang QL, Liu WF, Wang TH. Modulatory role of estradiol in nicotinic antinociception in adult female rats. Life Sci 2009; 85(1-2): 91-6.
10. Gaumond I, Arsenault P, Marchand S. The role of sex hormones on formalin-induced nociceptive responses. Brain res 2002; 958(1): 139-45.
11. Chanda ML, Mogil JS. Sex differences in the effects of amiloride on formalin test nociception in mice. American J Physiol-Regul 2006; 291(2): R335-R42.
12. Gulinello M, Smith SS. Anxiogenic effects of neurosteroid exposure: sex differences and altered GABAA receptor pharmacology in adult rats. J pharmacol Exper Ther  2003; 305(2): 541-8.
13. Craft RM, Mogil JS, Aloisi AM. Sex differences in pain and analgesia: the role of gonadal hormones. Eur J Pain 2004; 8(5): 397-411.
14. Jahangiri L, Kesmati M, Najafzadeh H. Evaluation of analgesic and anti-inflammatory effect of nanoparticles of magnesium oxide in mice with and without ketamine. Eur Rev Med Pharmacol Sci 2013; 17(20): 2706-10.
15. Khakpay R, Ansari S, Khakpai F. The antinociceptive effect of 17 β-estradiol in the paragigantocellularis lateralis nucleus of ovariectomized female rats mediated by estrogen Receptors. Arak Med Uni J 2017; 20(125): 29-38.
16. Khakpay R, Barani S, Hatami Nemati H. Assessing the effect of intra-paragigantocellularis lateralis injection of 17β-estradiol on the acute and persistent pain in the male rat. Physiol Pharmacol 2015; 18(4): 455-65.
17. Zimmermann M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain 1983; 16(2): 109-10.
18. Heidarifar R, Mehran N, Heidari A, Tehran HA, Koohbor M, Mansourabad MK. Effect of Dill (Anethum graveolens) on the severity of primary dysmenorrhea in compared with mefenamic acid: A randomized, double-blind trial. J Res Med Sci 2014; 19(4): 326-30.
19. Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates (6rd ed.). Academic PressLondonUK 2007.
20. Khakpay R, Semnanian S, Javan M, Janahmadi M. The effect of intra-locus coeruleus injection of 17beta-estradiol on inflammatory pain modulation in male rat. Behav Brain Res 2010; 214(2): 409-16.
21.  Khakpay R, Azaddar M, Khakpay F, Hatami Nemati H. Analgesic Effect of 17beta-Estradiol on Nucleus Paragigantocellularis Lateralis of Male Rats Mediated Via GABAA Receptors. Basic Clin Neurosci 2017; 8(1): 51-60.
22. Stoffel EC, Ulibarri CM, Craft RM. Gonadal steroid hormone modulation of nociception, morphine antinociception and reproductive indices in male and female rats. Pain 2003; 103(3): 285-302.
23. Aloisi AM, Ceccarelli I. Role of gonadal hormones in formalin-induced pain responses of male rats: modulation by estradiol and naloxone administration. Neurosci 2000; 95(2): 559-66.
24. McEwen BS, Coirini H, Westlind-Danielsson A, Frankfurt M, Gould E, Schumacher M, et al. Steroid hormones as mediators of neural plasticity. J Steroid Biochem Molecul Biol 1991; 39(2): 223-32.
25. Tsuruoka M, Willis WD, JR. Bilateral lesions in the area of the nucleus locus coeruleus affect the development of hyperalgesia during carrageenan-induced inflammation. Brain Res 1996; 726(1-2): 233-6.
26. Longhurst PA, Levendusky M. Influence of gender and the oestrous cycle on in vitro contractile responses of the rat urinary bladder to cholinergic stimulation. Br J Pharmacol 2000; 131(2): 177-84.
27. Kuba T, Kemen LM, Quinones-Jenab V. Estradiol administration mediates the inflammatory response to formalin in female rats. Brain Res 2005; 1047(1): 119-22.
28. Mannino CA, South SM, Quinones-Jenab V, Inturrisi CE. Estradiol replacement in ovariectomized rats is antihyperalgesic in the formalin test. J Pain 2007; 8(4): 334-42.
29. Khakpay R, Barani S, Hatami Nemati H. Assessing the effect of intra-paragigantocellularis lateralis injection of 17β-estradiol on the acute and persistent pain in the male rat. Physiol Pharmacol 2015; 18(4): 455-65.
30. Zhang H, Xie M, Schools GP, Feustel PF, Wang W, Lei T, et al. Tamoxifen mediated estrogen receptor activation protects against early impairment of hippocampal neuron excitability in an oxygen/glucose deprivation brain slice ischemia model. Brain Res 2009;1247: 196-211.
31. Gaumond I, Spooner MF, Marchand S. Sex differences in opioid-mediated pain inhibitory mechanisms during the interphase in the formalin test. Neurosci 2007; 146(1): 366-74.
32. Ceccarelli I, Scaramuzzino A, Massafra C, Aloisi AM. The behavioral and neuronal effects induced by repetitive nociceptive stimulation are affected by gonadal hormones in male rats. Pain 2003; 104(1-2): 35-47.

[32] Kelly MJ, Lagrange AH, Wagner EJ, Ronnekleiv OK. Rapid effects of estrogen to modulate G protein-coupled receptors via activation of protein kinase A and protein kinase C pathways. Steroids 1999; 64(1-2): 64-75.

 

---

---