جلد 17، شماره 7 - ( 8-1397 )                   جلد 17 شماره 7 صفحات 625-638 | برگشت به فهرست نسخه ها

XML English Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Shakibaie M, Jafari M, Ameri A, Rahimi H, Forootanfar H. Biosynthesis and Physicochemical Characterization, and Cytotoxic Evaluation of Selenium Nanoparticles Produced by Streptomyces Lavendulae FSHJ9 Against MCF-7 Cell Line . JRUMS. 2018; 17 (7) :625-638
URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-4075-fa.html
شکیبایی مجتبی، جعفری ماندانا، عامری عالیه، رحیمی حمیدرضا، فروتن فر حمید. بیوسنتز و تعیین خصوصیات فیزیکوشیمیایی و سمیت سلولی نانوذرات سلنیوم تولید شده توسط استرپتومایسس لاواندوله FSHJ9 علیه رده سلولی MCF-7. مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان. 1397; 17 (7) :625-638

URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-4075-fa.html


دانشگاه علوم پزشکی کرمان، ایران
متن کامل [PDF 254 kb]   (27 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (27 مشاهده)
متن کامل:   (5 مشاهده)
مقاله پژوهشی
مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان
دوره 17، مهر 1397، 638-625
 
بیوسنتز و تعیین خصوصیات فیزیکوشیمیایی و سمیت سلولی نانوذرات سلنیوم تولید شده توسط استرپتومایسس لاواندوله FSHJ9 علیه رده سلولی MCF-7
 
 
مجتبی شکیبایی[1]، ماندانا جعفری[2]، عالیه عامری[3]، حمید رضا رحیمی[4]، حمید فروتن فر[5]
 
دریافت مقاله: 25/9/96   ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 30/2/97    دریافت اصلاحیه از نویسنده: 28/3/97         پذیرش مقاله: 12/4/97
 
 
 

چکیده
زمینه و هدف: خصوصیات ویژه فیزیکوشیمیایی نانوذرات سلنیوم باعث شده است که اخیراً توجه ویژه­ای به معرفی سویه­های میکروبی مولد نانوذرات سلنیوم صورت ­گیرد. هدف از مطالعه حاضر معرفی سویه اکتینومیست مولد نانوذرات سلنیوم، تعیین خصوصیات نانوذرات و بررسی اثر سمیت سلولی آن بر رده سلولی سرطان سینه (MCF-7) می­باشد.
مواد و روش­ها: در این مطالعه آزمایشگاهی ابتدا سویه مولد نانوذرات سلنیوم از نمونه­های خاک جداسازی گردید. سویه منتخب سپس به کمک تست­های بیوشیمیایی، مورفولوژیک و تعیین توالی ژن 16S rDNA شناسایی شد. سپس طیف UV-Visible، عکس میکروسکوپ الکترونی(Transmission electron microscope) TEM ، الگوی پراکنش اندازه ذره­ای، طیف EDX (Energy-dispersive X-ray) و FTIR (Fourier-transform infrared) نانوذرات سلنیوم تعیین گردید. جهت بررسی اثر سمیت سلولی نانوذرات سلنیوم از روش رنگ سنجی بر پایه MTT (Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide) استفاده گردید که در این روش ابتدا درصد زنده­مانی محاسبه و سپس میزان IC50 (Half inhibitory concentration) مربوطه محاسبه گردید.
یافته­ها: باکتری منتخب به عنوان استرپتومایسس لاواندوله FSHJ9 شناسایی گردید. عکس­های TEM نشان دادند که نانوذرات کروی اندازه ذره­ای 123-28 نانومتر دارند. طیف FTIR آنها نشان داد که گروه عاملی خاصی بر روی سطح نانوذرات حضور ندارد. نتایج سمیت سلولی نانوذرات نشان داد که IC50 نانودرات سلنیوم )23/42±1/77 میکروگرم در میلی‌لیتر( در مقایسه با IC50 سدیم سلنیت )53/41±0/3 میکروگرم در میلی‌لیتر( بیشتر است.
نتیجه­گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که استرپتومایسس لاواندوله FSHJ9 قادر است نانوذرات سلنیوم را تولید کند. این نانوذرات احتمالاً پس از انجام مطالعات تکمیلی‌می­توانند کاربردهایی از جمله به عنوان مکمل در رژیم غذایی انسان و دام پیدا کند.
واژه­های کلیدی: نانوذرات سلنیوم، بیوسنتز، استرپتومایسس، سمیت سلولی، رده سلولی MCF-7
 

مقدمه
خواص فیزیکوشیمیایی منحصر به فردی که نانو مواد نسبت به مواد غیر نانو از خود بروز می­دهند در دهه­های اخیر باعث انجام مطالعات فراوانی در این حوزه شده است ]5-1[. نانوذرات فلزی مانند طلا و نقره در زمینه­های مختلف علوم شیمی، فیزیک و پزشکی مورد استفاده قرار گرفته­اند ]5-2[. بعضی از خواص عنصر سلنیوم مانند هدایت گرمایی و نوری بالا و آنیزوتروپی باعث استفاده بسیار این شبه فلز در سلول­های خورشیدی شده است ]7-4 ،6-3[. علاوه بر این وجود سلنیوم در ساختار سلنوآنزیم­ها و گلوتاتیون پراکسیداز که لیپیدها، لیپوپروتئین­ها و (Deoxyribonucleic acid) DNA را در سلول­های حیوانی از آسیب حفظ می­کنند، باعث معرفی سلنیوم به عنوان یک عنصر ضروری تغذیه­ای شده است ]9-8[. به هر حال نوع ساختار ترکیبات حاوی سلنیوم نقش بسیار مهمی در فراهمی زیستی و فعالیت زیستی این عناصر ایفاء می­کنند ]4-3[. مطالعات درون تنی و برون تنی نشان دادند که نانوذرات سلنیوم  (Se0)نه تنها سمیت کمتری دارند، بلکه فعالیت بیولوژیکی بهتری را نسبت به یون­های Se4+ و Se6+ که فراوان‌ترین اشکال سلنیوم موجود هستند از خود نشان می­دهند ]11-10[.
روش­های فیزیکوشیمیایی که برای سنتز نانوذرات استفاده می­شوند اغلب پرهزینه و وقت‌گیر بوده و دوست‌دار محیط زیست نیستند، بنابراین محققین به سنتز نانوساختارها با استفاده از روش­های بیولوژیک روی آورده‌‌اند ]13-12[. میکروارگانیسم­ها، آنزیم­ها، سلول­ها و عصاره‌های گیاهی از جمله منابع بیولوژیکی هستند که برای ساخت نانوذرات سلنیوم مورد استفاده قرار گرفته اند ]14-12[. برای مثال Shakibaie و همکاران سویه باکتریایی Bacillus sp. Msh1 را از نمونه‌های آب دریای خزر جداسازی نمودند که این سویه قادر به سنتز نانوذرات سلنیوم کروی بود ]3[. در مطالعه دیگری مشخص گردید سویه باکتریایی هالوفیل باسیلوس مگاتریوم قادر بود بعد از 40 ساعت انکوباسیون در غلظت­های بالاتر از 25/0 میلی‌مولار سدیم سلنیت را به نانوذرات سلنیوم تبدیل نماید ]12[. Zare و همکاران گزارش نمودند که مایع رویی محیط کشت آسپرژیلوس ترئوس قادر است که نانوذرات سلنیوم با متوسط اندازه ذره­ای 47 نانومتر را سنتز نماید ]13[. علاوه بر این، مشخص شده است که اکتینومایست­ها و به ویژه جنس استرپتومایسس توانایی ویژه­ای در تولید متابولیت­های ثانویه (مثل آنتی بیوتیک­ها، ضد ویروس­ها و آنزیم­های مختلف) دارند ]15[. توانایی اکتینومایست­ها برای بیوسنتز نانوذرات فلزی نقره و طلا پیش از این گزارش شده است ]17-16[.
مطالعه حاضر سعی بر این دارد که یک سویه اکتینومیست مولد نانوذرات سلنیوم را از نمونه­های خاک جداسازی و شناسایی نماید تا بعد از خالص­سازی و تعیین خصوصیات نانوذرات سلنیوم بیوژنیک به مطالعه سمیت سلولی آن­ها بپردازد. لازم به­ذکر است که مطالعات اندکی در این خصوص صورت گرفته ]3[ و همان­طور که ذکر شد استفاده از میکروارگانیسم­ها به منظور بیوسنتز نانوذرات یک رویکرد جدید است که در سال­های اخیر توجه زیادی به آن شده است ]1[.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه آزمایشگاهی که در آزمایشگاه بیوتکنولوژی دارویی دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی کرمان و در فاصله زمانی مهر 1394 تا شهریور 1395 صورت گرفت. علاوه بر این، این مطالعه دارای کد اخلاق از دانشگاه علوم پزشکی کرمان به شماره 930160 می باشد. به منظور جداسازی سویه اکتینومیست احیاء کننده یون­های Se4+، تعداد 30 نمونه خاک کشاورزی از نقاط مختلف شهرستان کرمان (باغ‌های منطقه سرآسیاب، زنگی آباد، کاظم آباد، چترود و لاله زار) جمع‌آوری و به آزمایشگاه منتقل شدند. یک گرم از نمونه‌های خاک با 20 میلی‌لیتر محلول سدیم کلراید 9/0 درصد حاوی توئین 80 )5/0 درصد( مخلوط شد و توسط کاغذ صافی )شماره 1 واتمن( صاف گردید. 500 میکرولیتر از عصاره خاکی به دست آمده به روش رقیق سازی سریالی رقیق گردید و 100 میکرولیتر از آن به محیط کشت CGA (Casein glycerol agar) شامل )گرم بر لیتر(: کازئین )3/0(، گلیسرول )10(، سدیم کلراید )2(، پتاسیم نیترات )2(، دی پتاسیم هیدروژن فسفات )2(، منیزیم سولفات هفت آبه )05/0(، کلسیم کربنات )02/0(، فروس سولفات 7 آبه )01/0( و آگار )15 (حاوی سدیم سلنیت )26/1 میلی‌مولار( منتقل و پخش گردید. پلیت­ها تا زمانی که اکتینومیست­ها رشد کنند، در دمای 30 درجه گرم خانه‌گذاری شدند )ژال تجهیز، مدل JTSL20، ایران(. کلونی­های قرمز رنگ واجد قدرت احیاء کنندگی یون‌های Se+4 جداسازی شده و تا رسیدن به کلونی خالص روی محیط‌های CGA دارای سدیم سلنیت واکشت داده شدند. هم­چنین برای اطمینان از عدم تولید رنگ­دانه قرمز هر کدام از کلونی­های جداسازی شده روی محیط­های CGA فاقد سدیم سلنیت نیز واکشت داده شدند. به منظور انتخاب سویه اکتینومایست واجد بیشترین مقاومت به سدیم سلنیت، حداقل غلظت مهار کنندگی (Minimum inhibitory concentration; MIC) سدیم سلنیت برای سویه­های جداشده مرحله قبل به روش رقیق سازی در آگار تعیین گردید ]3[. سویه اکتینومیست انتخابی سپس در دمای 80- درجه New Brunswick)، مدل U535، آمریکا( و در محیط نوترینت براث حاوی گلیسرول )15 درصد( ذخیره گردید.
در مرحله بعد شناسایی مورفولوژیک و بیوشیمیایی سویه اکتینومایست انتخابی بر اساس رفرنس
 
Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology انجام گرفت ]18[. هم­چنین شناسایی مولکولی بر مبنای تعیین توالی ژن 16S rDNA به شرح زیر انجام شد. ابتدا برای به­دست آوردن DNA ژنومی، سویه انتخابی در محیط کشت مایع Luria-Bertani )گرم بر لیتر: تریپتون 10، عصاره مخمر 5، سدیم کلراید 10( به مدت شش روز )30 درجه، rpm150( کشت داده شد و سپس توده زیستی تولیدی با سانتریفیوژEppendorf) ، مدل 5810R، آلمان( جدا گردید rpm) 10000، 5 دقیقه(. سپس DNA ژنومی با استفاده از روش فنول-کلروفرم استخراج گردید ]19[. برای تکثیر قطعه bp 1422 از ژن 16S rDNA از زوج پرایمر 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') و rp2 (5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3') با برنامه PCR (Polymerase chain reaction) سه دقیقه واسرشته شدن ابتدایی در 94 درجه سانتی‌گراد، 30 چرخه شامل واسرشته شدن در 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه، اتصال در دمای 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 45 ثانیه، گسترش در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 90 ثانیه و نهایتاً گسترش پایانی در دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت 90 ثانیه انجام گرفت )دستگاه ترمال سایکلر PeqLab، مدل PeqStar 96، آلمان(. بعد از تعیین توالی قطعه تکثیر شده )ﺷﺮﮐﺖ Bionir، ﮐﺮه ﺟﻨﻮﺑﯽ(، توالی ژن 16S rDNA سویه جدا شده با سایر توالی­های موجود در بانک ژنی با استفاده از نرم‌افزار BLAST (Basic local alignment search tools)  نسخه 2.8.0-alpha مورد مقایسه قرار گرفت ]20[.
به منظور تولید نانوذرات سلنیوم سویه اکتینومیست انتخابی در محیط کشت مایع CG حاوی 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر از یون‌های Se+4 به مدت 5 روز کشت داده شد rpm) 150، 30 درجه سانتی‌گراد(. بعد از جداسازی سلول‌ها با استفاده از سانتریفیوژ rpm) 10000، 5 دقیقه(، توده سلولی تولیدی با افزودن نیتروژن مایع فریز گردید و بعد از ساییدن به کمک هاون چینی لیز شد. بعد از این که مخلوط حاصله تحت اولتراسونیک )100 وات، 5 دقیقه( )پروب سونیکاتور ProScientific، مدل VCX 750، آمریکا( قرار گرفت و سه بار با استفاده از بافر تریس هیدروکلراید )5/1 میلی‌مولار، 3/8=(pH حاوی سدیم دودسیل سولفات ) درصد1( و آب دیونیزه شسته شد. پلت حاصله در آب دیونیزه پخش گردید. دو میلی‌لیتر از سوسپانسیون حاصله به 4 میلی‌لیتر از n-اکتانول اضافه و به شدت تکان داده شد. سپس مخلوط حاصله سانتریفیوژ شد rpm) 5000، دقیقه( و در یخچال به مدت 24 ساعت نگه­داری شد. بعد از مرحله فوق نانوذرات سلنیوم تولیدی در فاز آبی و در انتهای لوله­ها جمع شده و باقی­مانده­های سلولی نیز در بین دو فاز آبی-آلی تجمع پیدا می­کنند. نانوذرات تولیدی به ترتیب با استفاده از کلروفرم، اتیل الکل و آب مقطر شستشو داده شده و در دمای 4 درجه سانتی گراد نگه­داری شدند ]3[.
در مرحله بعد خصوصیات مختلف نانوذرات تولید شده و خالص شده با استفاده از روش­های مختلف مورد ارزیابی قرار گرفت. طیف UV-Visible نانوذرات سلنیوم خالص شده با استفاده از اسپکتروفتومتر )شیمادزو، مدل UV-1800، آمریکا( رسم گردید. تصاویر نانوذرات با قرار دادن آن‌ها بر روی گرید مسی و با استفاده از میکروسکوپ الکترونی گذاره (Zeiss، مدل Supra 55 VP، آلمان( در ولتاز 100 کیلو ولت تهیه شدند و طیف EDX  (Energy-dispersive X-ray) نانوذرات نیز با همین دستگاه رسم گردید. نمودار توزیع اندازه ذره­ای نانوذرات با استفاده از نانوسایزر )کمپانی تجهیزات مالورن، مدل MS2000، انگلستان( اندازه گیری شد و طیف FTIR (Fourier-transform infrared) با تشکیل قرص پتاسیم بروماید حاوی نانوذرات خشک شده با درجه تفکیک cm-1 4 تهیه گردیدBruker) ، مدل آلفا، آمریکا(. الگوی XRD (X-ray diffraction) کریستالی پودر خشک نانوذرات سلنیوم با استفاده از دستگاه پراش اشعه ایکس Bruker)، مدل D8 Advance، آمریکا) مشخصه یابی شد ]3[.
اثرات سمیت سلولی نانوذرات سلنیوم بیوژنیک در مرحله بعد مورد بررسی قرار گرفتند. رده سلولی سرطان پستان (MCF-7)، مورد استفاده در این مطالعه از بانک سلولی جهاد دانشگاهی (Iranian biological resource center; IBRC) تهیه شد. برای کشت سلول­ها از محیط کشت DMEM (Dulbecco's modified eagle medium) حاویFBS  (Fetal bovine serum) (١٠ درصد) که دارای آنتی­بیوتیک پنی­سیلین )١٠٠ واحد در میلی‌لیتر( و استرپتومایسین )100 میکروگرم در میلی‌لیتر( بود در انکوباتور CO2 )دی­اکسیدکربن 5 درصد با رطوبت نسبی 95 درصد و دمای 37 درجه سانتی­گراد( استفاده شد Brunswick) New، مدل Galaxy170 S، آمریکا(. تعداد بیست ­هزار سلول در چاهک­های پلیت­های 96 خانه کشت سلولی وارد شد و به مدت 24 ساعت جهت اتصال سلول­ها به کف میکروپلیت گرم­ خانه­گذاری شدند. سلول­ها سپس جداگانه با غلظت­های مختلف نانوذرات سلنیوم و سدیم سلنیت (0 تا 120 میکروگرم در میلی‌لیتر) تیمار شدند. بعد از 24 ساعت محیط کشت سلول­ها با 20 میکرولیتر محیط کشت DMEM حاوی MTT (Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide) (5 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) جایگزین شدند و بعد از 4 ساعت انکوباسیون 100 میکرولیتر از DMSO (Dimethyl sulfoxide) به چاهک­ها اضافه شد و میزان جذب در 570 نانومتر قرائت گردید. کلیه مراحل فوق سه بار و در سه روز مختلف انجام گرفت و میانگین جذب­ها برای محاسبه میزان درصد زنده‌مانی (Viability%) و هم­چنین IC50 (Half inhibitory concentration) به کمک نرم‌افزار SPSS نسخه 15 و ابزار آنالیز Probit  استفاده شدند ]21[.
نتایج
از میان 36 کلونی اکتینومیست جداشده از خاک فقط پنج کلونی دارای توانایی احیاء یون­های Se+4 به Se0 قرمز رنگ بودند. محاسبه میزان MIC سدیم سلنیت برای سویه­های منتخب نشان داد که ایزوله J9 بیشترین قدرت تحمل یون­های سلنیوم )200 میکروگرم در میلی‌لیتر( با تبدیل آن­ها به Se0 را دارا بود. با کشت ایزوله منتخب روی پلیت­های حاوی محیط CGA )شکل 1-الف( و محیط مایع CG )شکل 1-د( حاوی یون­های Se+4 پیدایش رنگ قرمز ناشی از نانوذرات Se0 قابل مشاهده است و فقدان رنگ قرمز در کلونی­های رشد کرده روی محیط­های فاقد سلنیوم )شکل 1-ب و 1-ج( عدم ارتباط رنگ مشاهده شده با تولید رنگدانه توسط این ایزوله را نشان می­دهد.
مشاهدات مورفولوژیک ایزوله J9 را یک باکتری رشته­ای و گرم مثبت نشان داد و نتایج تست­های بیوشیمیایی در جدول 1 آورده شده است. هر دو این نتایج نشان داد که ایزوله J9 متعلق به خانواده استرپتومایست­ها است. نتایج BLAST توالی 16S rDNA ایزوله J9 نشان داد که این توالی 99 درصد با توالی ژن 16S rDNA استرپتومایسس لاواندوله مشابهت دارد و بنابراین توالی 1434 نوکلئوتیدی به­دست آمده در بانک ژنی با شماره پذیرش KC626003 ثبت گردید.
 
 

شکل 1- کشت ایزوله باکتریایی استرپتومایسس لاواندوله FSHJ9 روی محیط کشت کازیین-گلیسرول آگار
 الف) حاوی سدیم سلنیت و ب) فاقد سدیم سلنیت. فلاسک کشت مایع استرپتومایسس لاواندوله FSHJ9 در عدم حضور و حضور سدیم سلنیت بعد از 5 روز کشت در دمای 30 درجه سانتی گراد.
 
 
در مرحله بعد و پس از رشد سویه استرپتومایسس لاواندوله در محیط کشت حاوی یون سلنیوم، نانوذرات سلنیوم تولید شدند که در ادامه و به کمک سیستم حلال آب-اکتانول این نانوذرات خالص شدند و برای مراحل بعدی یعنی تعیین خصوصیات و بررسی سمیت سلولی مورد استفاده قرار گرفتند. طیف UV-vis نانوذرات سلنیوم خالص شده در شکل 2 نشان داده شده است. همان­طور که مشاهده می­شود یک ناحیه جذبی در محدوده طول موج 400 تا 600 نانومتر دیده می­شود. گسترده بودن محدوده اندازه ذره­ای نانوذرات سلنیوم می­تواند به علت ایجاد اتصالات بین نانوذرات باشد که پیش از این به عنوان دلیل پهن شدن طیف UV-vis مورد بحث قرار گرفته است ]3[. همان­طور ­که در تصویر میکروسکوپ الکترونی گذاره )شکل 3( مشخص است نانوذرات سلنیوم تولید شده در این تحقیق کروی شکل هستند.

شکل 2- طیف UV-visible نانوذرات سلنیوم بیوژنیک
 
 
 

شکل 3- تصویر میکروسکوپ الکترونی TEM نانوذرات سلنیوم بیوژنیک
نتایج به­دست آمده از روش تفرق اشعه لیزر برای محاسبه اندازه ذره­ای نانوذرات در شکل 4 آورده شده است. سایز نانوذرات تولیدی در محدوده اندازه ذره­ای 28 تا 123 نانومتر قرار داشت و نانوذرات با اندازه ذره­ای 48 نانومتر بیشترین فراوانی را داشتند.

شکل 4- الگوی توزیع اندازه ذره­ای نانوذرات سلنیوم بیوژنیک
به طور کلی نانوذرات سلنیوم که با روش­های شیمیایی تولید می­شوند نسبت به نانوذرات بیوژنیک اندازه ذره­ای کمتری از خود نشان می‌دهند ]5 ،3[. طیف EDX (Energy-dispersive X-ray) نانوذرات سلنیوم خالص شده پیک­های جذبی SeLα، SeKα و SeKβ را به ترتیب در 37/1، 22/11 و 49/12 کیلوالکترون ولت نمایش می‌دهد )شکل 5(.

شکل5- طیف EDX نانوذرات سلنیوم بیوژنیک
علاوه بر این آنالیز عنصری سیگنال­های قوی برابر با 100 درصد بدون حضور سایر عناصر را نشان داد (شکل 5) که می­توان نتیجه گرفت سیستم دوفازی آب/اکتانول به خوبی توانسته ناخالصی­های سلولی را از نانوذرات سلنیوم جداسازی نماید. بر اساس نمودار به­دست آمده از مطالعه طیف XRD نانوذرات سلنیوم بیوژنیک )شکل 6( این نانوذرات شکل کریستالی خاصی ندارند و به شکل آمورف دیده می­شوند. طیف FTIR (Fourier-transform infrared) نانوذرات سلنیوم )شکل 7( هیچ باند جذبی مشخصی را نشان نداد که این امر به معنای عدم حضور گروه عاملی خاص بر سطح نانوذرات بیوژنیک تولید شده می­باشد.

شکل 6- آنالیز XRD نانوذرات سلنیوم بیوژنیک

شکل 7- طیف FTIR نانوذرات سلنیوم بیوژنیک
آنالیز سمیت سلولی نانوذرات سلنیوم بیوژنیک علیه رده سلولی سرطان پستان (MCF-7) یک رابطه مستقیم دوز-پاسخ را نشان داد که با افزایش غلظت نانوذرات میزان سلول­های زنده MCF-7 کاهش پیدا می­کند )شکل 8(. نتایج مطالعه حاصل هم­چنین نشان داد که نانوذرات سلنیوم بیوژنیک IC50) برابر با 23/1±42/77 میکروگرم در میلی‌لیتر( سمیت کمتری را در مقایسه با سدیم سلنیت IC50) برابر با 53/0±41/3 میکروگرم در میلی‌لیتر( روی رده سلولیMCF-7  از خود نشان داد.

شکل 8- مقایسه سمیت سلولی نانوذرات سلنیوم بیوژنیک با سدیم سلنیت روی رده سلولی MCF-7
بحث
نانوذرات سلنیوم به دلیل خصوصیات منحصر به فرد فیزیکوشیمیایی و الکتریکی خود در سال­های اخیر مورد توجه بسیاری از محققین قرار گرفته است ]4-3[ این نانوذره شبه فلزی هم­چنین به واسطه خواص بیولوژیک مختلف خود همچون خاصیت آنتی‌اکسیدانی، ضدمیکروبی، ضد بیوفیلمی و تقویت کنندگی سیستم ایمنی امروزه به­عنوان یکی از نانوذرات مهم در علوم پزشکی مورد توجه محققان این رشته نیز قرار گرفته است ]6-4[. این نکته نیز قابل توجه است که در مطالعاتی که در سال­های اخیر صورت گرفته اثربخشی بالاتر و سمیت کمتری از نانوذرات سلنیوم در مقایسه با اشکال دیگر سلنیوم از جمله سلنیت، سلنومتیونین و سلنوسیسئین گزارش شده است ]10[. روش­های مختلفی برای سنتز نانوذرات فلزی و شبه فلزی وجود دارد که در این بین بیوسنتز نانوذرات فلزی با استفاده از باکتری­ها به عنوان یک روش جایگزین برای روش­های فیزیکوشیمیایی مورد توجه قرار گرفته است ]6-3[. برای مثال Zhang و همکاران نشان دادند که باکتری سودوموناس آلکالیفیلا قادر است که نانوذرات سلنیوم کروی شکلی را با قطر 50 تا 500 نانومتر تولید نماید ]6[. باکتری هالوفیل باسیلوس مگاتریوم قادر بود غلظت­های بالاتر از 25/0 میلی‌مولار سدیم سلنیت را بعد از 40 ساعت انکوباسیون به نانوذرات سلنیوم تبدیل نماید ]12[. با استفاده از سوپرناتانت محیط کشت آسپرژیلوس ترئوس نانوذرات سلنیوم با متوسط اندازه ذره ای 47 نانومتر تهیه شدند ]13[. هم­چنین Yazdi و همکاران نشان دادند که سویه پروبیوتیکی لاکتوباسیلوس پلانتاروم قادر بود نانوذرات سلنیوم با اندازه ذره­ای کمتر از 250 نانومتر را بعد از 72 ساعت انکوباسیون تولید نماید ]22[.
سیستم دوفازی آلی-مائی استفاده شده در این مطالعه به خوبی قادر بود نانوذرات سلنیوم تولیدی را از توده زیستی اکتینومیست جداسازی نماید. در مطالعه مشابهی که توسط Forootanfar و همکاران صورت گرفت نیز از این سیستم حلال به صورت موفقیت آمیز برای جداسازی نانوذرات سلنیوم تولیدی توسط سویه باسیلوس بود استفاده گردید. هم­چنین نانوذرات تلوریوم بیوژنیک (تولید شده توسط سویه باکتریایی سودوموناس سودو الکالی ژنز) نیز به کمک همین سیستم حلال جداسازی و تعیین خصوصیات گردید ]23[. طیف UV-vis نانوذرات سلنیوم خالص شده در این مطالعه در شکل 2 آورده شده است. پیش از این طیف مشابهی توسط Zhang برای نانوذرات سلنیوم تولید شده توسط سودوموناس آلکالیفیلا نیز گزارش شده بود ]6[. Oremland و همکاران ]24 [نیز برای نانوذرات سلنیوم تولید شده توسط باکتری­های تنفس کننده سلنیوم طیف UV-vis با پهن شدگی در طول موج­های بزرگ­تر از 500 نانومتر گزارش کرده­اند که با نانوذرات سلنیوم سنتز شده با روش­های شیمیایی تفاوت دارد. Yang و همکاران گزارش کردند که پهن شدگی طیف UV-vis می­تواند به علت ایجاد اتصالات بین نانوذرات سلنیوم باشند ]25[. بررسی طیف XRD نانوذرات سلنیوم بیوژنیک سنتز شده در این تحقیق (شکل 6) نشان داد که این نانوذرات شکل کریستالی خاصی ندارند و آمورف می­باشند. نتایج مشابه این مطالعه قبلاً توسط Shakibaie  و همکاران ]3[ گزارش شده بود که در آن مقاله سویه باکتریایی Bacillus sp. Msh1 قادر بود نانوذرات سلنیوم تولید نماید که از لحاظ شکل کریستالی بدون شکل و آمورف تشخیص داده شدند. معمولاً هنگام تولید نانوذرات توسط میکروارگانیسم­ها قرارگیری ترکیبات مختلف روی سطح نانوذرات باعث ایجاد گروه­های عاملی بر روی سطح نانوذره می­شود که در طیف FTIR قابل نمایش هستند ]3-2[. پیش از این وجود گروه­های هیدروکسیل و کربونیل بر روی سطح نانوذرات سلنیوم بیوسنتز شده توسط باکتری Bacillus sp. MSh-1 نشان داده شده بود ]3[. با این­حال در مطالعه حاضر بر روی سطح نانوذرات سلنیوم تولیدی توسط استرپتومایسس لاواندوله FSHJ9 گروه عاملی خاصی روی سطح نانوذرات مشاهده نشد که دلیل آن مشخص نیست و مستلزم انجام مطالعات بیشتری است. بررسی خاصیت سمیت سلولی نانوذرات سلنیوم بیوژنیک در این مطالعه علیه رده سلولی MCF-7 نشان داد که نانوذرات سلنیوم سمیت کمتری در مقایسه با سدیم سلنیت روی این رده سلولی از خود نشان می­دهند. چنین الگویی پیش از این در مورد رده سلولی HT-1080 که در مجاورت نانوذرات سلنیوم قرار گرفته بودند نیز مشاهده شده بود ]4[ که کاملاً متفاوت از نتایج به­دست آمده توسط Chen و همکارانش ]26 [است که نشان دادند سمیت سلولی نانوذرات سلنیوم تولید شده توسط محلول حاوی پلی ساکاریدهای گیاه Undaria pinnatifida بر روی رده­های سلولی MCF-7 و HepG2 در مقایسه با یون­های Se+4 بیشتر است و بر روی سلول­های طبیعی Hs68 نانوذرات سلنیوم سمیت کمتری دارند. البته پیش از این نیز سمیت سلولی کمتر نانوذرات سلنیوم در مقایسه با سدیم سلنیت نیز گزارش شده بود ]25[. به نظر می­رسد روش ساخت نانوذرات سلنیوم و اندازه ذره­ای آن­ها تأثیر به­سزایی بر میزان سمیت سلولی آن­ها دارد. مقایسه میزانIC50  سدیم سلنیت با نانوذرات سلنیوم نشان می‌دهد که باکتری خاکزی استرپتومایسس لاواندوله FSHJ9 توانسته است ترکیب محلول سدیم سلنیت را به نانوذرات نامحلول سلنیوم تبدیل نماید که تقریباً 22 برابر سمیت کمتری روی رده سلولیMCF-7  از خود نشان داد.
ازجمله محدودیت­های موجود در این طرح می­توان به محدودیت­های منابع مالی و عدم تأمین به­موقع آن­ها اشاره­کرد. هم­چنین در دسترس نبودن برخی دستگاه­ها جهت آنالیز بیشتر خصوصیات فیزیکوشیمیایی نانوذرات سلنیوم بیوژنیک نیز یکی دیگر از این محدودیت­ها بود. در نهایت پیشنهاد می­شود که در ادامه این مطالعه روند و مکانیسم(های) مولکولی درگیر در مسیر سنتز بیولوژیک نانوذرات سلنیوم توسط سویه اکتینومیست معرفی­شده در این طرح تحقیقاتی بررسی گردد تا بتوان با شناسایی این مسیرهای بیولوژیک و احتمالاً با دستکاری آن­ها به مقدار تولید بیشتر نانوذرات سلنیوم واجد ویژگی­های متفاوت پرداخت. هم­چنین پیشنهاد می­گردد مطالعات حیوانی برای تعیین سمیت این نانوذرات و میزان کارآیی و خواص بیولوژیک این نانوذرات ارزشمند صورت گیرد.
نتیجه‌گیری
در مجموع به نظر می­رسد که اکتینومیست جداسازی شده در این تحقیق توانایی مناسبی جهت تولید نانوذرات سلنیوم کروی شکل را دارد. بررسی­ها نشان داد که این ذرات اثر سمیت سلولی مناسبی از خود نشان دادند. در ادامه باید مطالعات بیشتری در خصوص مکانیسم و نحوه اثر این نانوذرات بر رده سلولی مورد نظر و سایر رده­های سلول سرطانی انجام شود.
تشکر و قدردانی
این تحقیق به واسطه گرنت پژوهشی ارائه شده از طرف معاونت پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی کرمان صورت گرفته است و نویسندگان لازم می­دانند که از این معاونت کمال قدردانی و تشکر را به عمل بیاورند. هم­چنین از حمایت ستاد نانو فناوری ایران به دلیل تأمین هزینه برخی آنالیزهای دستگاهی نانوذرات سلنیوم نیز تشکر می­گردد.
 
References
 
 
[1] Faramarzi MA, Sadighi A. Insights into biogenic and chemical production of inorganic nanomaterials and nanostructures. Adv Colloid Interface Sci 2013; 189–90 (2): 1–20.
[2] Soflaei S, Dalimi A, Abdoli A, Kamali M, Nasiri V, Shakibaie M, et al. Anti-leishmanial activities of selenium nanoparticles and selenium dioxide on Leishmania infantum. Comp Clin Pathol 2014; 23(1): 15–20.
[3] Shakibaie M, Mohazab NS, Mousavi SAA. Antifungal activity of selenium nanoparticles synthesized by Bacillus species MSH-1 against Aspergillus fumigatus and Candida albicans. Jundishapur J Microbiol 2015; 8(9) e26381.
[4] Soflaei S, Dalimi A, Ghaffarifar F, Shakibaie M, Shahverdi AR, Shafiepour M. In vitro antiparasitic and apoptotic effects of antimony sulfide nanoparticles on Leishmania infantum. J Parasitol Res 2012; 2012: 7 Pages.
[5] Faramarzi MA, Forootanfar H. Biosynthesis and characterization of gold nanoparticles produced by laccase from Paraconiothyrium variabile. Colloid Surface B 2011; 87(1): 23–7.
[6] Zhang W, Zhijuan Chen Z, Liu H, Zhang L, Gao P, Li D. Biosynthesis and structural characteristics of selenium nanoparticles by Pseudomonas alcaliphila. Colloid Surface B 2011; 88(1): 196–201.
[7] Huang Z, Guo BJ, Wong RNS, Jiang Y. Characterization and antioxidant activity of selenium-containing phycocyanin isolated from Spirulina platensis. Food Chem 2007; 100(3): 1137–43.
[8] Messarah M, Klibet F, Boumendjel A, Abdennour C, Bouzerna N, Boulakoud MS, et al. Hepatoprotective role and antioxidant capacity of selenium on arsenic induced liver injury in rats. Exp Toxicol Pathol 2012; 64(3): 167–74.
[9] Shi L, Xun W, Yue W, Zhang C, Ren Y, Shi L, et al. Effect of sodium selenite, Se yeast and nano-elemental selenium on growth performance, Se concentration and antioxidant status in growing male goats. Small Rumin Res 2011; 96(1): 49–52.
[10] Kojouri GA, Jahanabadi S, Shakibaie M, Ahadi AM, Shahverdi AR. Effect of selenium supplementation with sodium selenite and selenium nanoparticles on iron homeostasis and transferrin gene expression in sheep: A preliminary study. Res Vet Sci 2012; 93(1): 275–8.
[11] Shakibaie M, Shahverdi AR, Faramarzi MA, Hassanzadeh GR, Rahimi HR, Sabzevari O. Acute and subacute toxicity of novel biogenic selenium nanoparticles in mice. Pharm Biol 2013; 51(1): 58–63.
[12] Rashmi Ranjan Mishra RR, Prajapati S, Das J, Dangar TK, Das N, Thatoi H. Reduction of selenite to red elemental selenium by moderately halotolerant Bacillus megaterium strains isolated from Bhitarkanika mangrove soil and characterization of reduced product. Chemosphere 2011; 84(9): 1231–7.
[13] Zare B, Babaie S, Setayesh N, Shahverdi AR. Isolation and characterization of a fungus for extracellular synthesis of small selenium nanoparticles. Nanomed J 2013; 1(1): 13–9.
[14] Ramamurthy CH, Sampath KS, Arunkumar P, Kumar MS, Sujatha V, Premkumar K, et al. Green synthesis and characterization of selenium nanoparticles and its augmented cytotoxicity with doxorubicin on cancer cells. Bioprocess Biosyst Eng 2013; 36(8): 1131–9.
[15] Atta HM, El-Sayed AS, El-Desoukey MA, Hassan M, El-Gazar M. Biochemical studies on the Natamycin antibiotic produced by Streptomyces lydicus: Fermentation, extraction and biological activities. J Saudi Chem Soc 2015; 19(4): 360–71.
[16] Sastry M, Ahmad A, Islam Khan M, Kumar R. Biosynthesis of metal nanoparticles using fungi and actinomycete. Curr Sci 2003; 85(2): 162–70.
[17] Balagurunathan R, Radhakrishnan M, Rajendran RB, Velmurugan D. Biosynthesis of gold nanoparticles by actinomycete Streptomyces viridogens strain HM10. Ind J Biochem Biophys 2011; 48(5): 331–5.
[18] Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th ed., Baltimore: Williams and Wilkins; 1994. pp. 1805–936.
[19] Sambrook J , Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. New York. pp. 4.67–4.69.
[20] Moshafi MH, Forootanfar H, Ameri A, Shakibaie M, Dehghan-Noudeh G, Razavi M. Antimicrobial activity of Bacillus sp. strain FAS1 isolated from soil. Pak J Pharm Sci 2011; 24(3): 269–75.
[21] Freshney RI. Culture of animal cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6th Ed. John Wiley & Sons Inc. 2010. Hoboken, NewJersey. pp. 365–81.
[22] Yazdi MH, Mahdavi M, Varastehmoradi B, Faramarzi MA, Shahverdi AR. The immunostimulatory effect of biogenic selenium nanoparticles on the 4T1 breast cancer model: an in vivo study. Biol Trace Elem Res 2012; 149(1): 22–8.
[23] Forootanfar H, Amirpour-Rostami S, Jafari M, Forootanfar A, Yousefizadeh Z, Shakibaie M. Microbial-assisted synthesis and evaluation the cytotoxic effect of tellurium nanorods. Mater Sci Eng C 2015; 49(1): 183–9.
[24] Oremland RS, Herbel MJ, Blum JS, Langley S, Beveridge TJ, Ajayan PM, et al. Structural and spectral features of selenium nanospheres produced by se-respiring bacteria. Appl Environ Microbiol 2004; 70(1): 52–60.
[25] Yang LB, Shen YH, Xie AJ, Liang JJ, Zhang BC. Synthesis of Se nanoparticles by using TSA ion and its photocatalytic application for decolorization of Congo red under UV irradiation. Mat Res Bull 2008; 43(3): 572–82.
[26] Chen T, Wong YS, Zheng W, Bai Y, Huang L. Selenium nanoparticles fabricated in Undaria pinnatifida polysaccharide solutions induce mitochondria-mediated apoptosis in A375 human melanoma cells. Colloids Surf B 2008; 67(1): 26–31.


Biosynthesis and Physicochemical Characterization, and Cytotoxic Evaluation of Selenium Nanoparticles Produced by Streptomyces Lavendulae FSHJ9 Against MCF-7 Cell Line
 
M. Shakibaie[6], M. Jafari[7], A. Ameri[8], H.R. Rahimi[9], H. Forootanfar[10]
 
 
 
 
 
Received: 16/12/2017  Sent for Revision: 20/05/2018    Received Revised Manuscript: 18/06/2018              Accepted: 03/07/2018
 
 
 
 
Background and Objectives: Due to the unique physicochemical properties of selenium nanoparticles (Se NPs), identification of microbial strains capable to biosynthesize Se NPs has recently attracted attention. The current study aimed at introducing Se NPs producing actinomycete strain, characterizing Se NPs as well as evaluating its cytotoxic effect against breast cancer cell line (MCF-7).
Materials and Methods: In the present laboratory investigation, first, the Se NPs producing strain was isolated from soil samples. The selected isolate was then identified using morphological and biochemical examinations as well as 16S rDNA sequencing protocol. The UV-visible spectrum, particle-size distribution (PSD) pattern, Fourier-transform infrared (FTIR), and energy-dispersive X-ray (EDX) profiles of the nanostructures as well as transmission electron microscope (TEM) image of Se NPs were determined. In order to evaluate the cytotoxicity of the Se NPs, the MTT (Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide) based colorimetric protocol was applied where the viability percent was firstly determined and then the related IC50 (Half inhibitory concentration) was calculated.
Results: The selected bacterial isolate was identified as Streptomyces lavendulae FSHJ9. TEM micrographs of the biogenic Se NPs exhibited spherical nanostructures with the size range of 28–123 nm. The FTIR pattern showed no functional group present on the surface of Se NPs. The obtained results of cytotoxicity revealed that IC50 of Se NPs (77.1±42.23 µg/mL) was more than IC50 of sodium selenite (3.0±41.53 µg/mL).
Conclusion: The results of the present study showed that Streptomyces lavendulae FSHJ9 was able to produce Se NPs. The produced biogenic Se NPs, after performing complementary studies, might be applied as supplement in human food and animal feeding.
Key words: Selenium nanoparticles, Biosynthesis, Streptomyces, Cytotoxicity, MCF-7 cell line
 
Funding: This study was funded by Kerman University of Medical Sciences.
Conflict of interest: None declared.
Ethical approval: The Ethics Committee of Kerman University of Medical Sciences approved the study (930160).
 
How to cite this article: Shakibaie M, Jafari M, Ameri A, Rahimi H.R, Forootanfar H. Biosynthesis and Physicochemical Characterization, and Cytotoxic Evaluation of Selenium Nanoparticles Produced by Streptomyces Lavendulae FSHJ9 Against MCF-7 Cell Line. J Rafsanjan Univ Med Sci 2018; 17 (7): 625-38. [Farsi]
 
 
  1. - دانشیار گروه آموزشی بیوتکنولوژی دارویی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی کرمان، کرمان، ایران
[2]- کارشناس ارشد میکروبیولوژی، مرکز تحقیقات فارماسیوتیکس، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی کرمان، کرمان، ایران
[3]- استادیار گروه آموزشی شیمی دارویی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی کرمان، کرمان، ایران
[4]- استادیار گروه آموزشی فارماکولوژی و سم شناسی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی کرمان، کرمان، ایران
[5]- (نویسنده مسئول) دانشیار گروه آموزشی بیوتکنولوژی دارویی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی کرمان، کرمان، ایران
تلفن: 31325238-034، دورنگار: 31325003-034، پست الکترونیک: h_forootanfar@kmu.ac.ir
 
[6]- Associate Prof., Dept. of Pharmaceutical Biotechnology, Faculty of Pharmacy, Kerman University of Medical Sciences, Kerman, Iran, ORCID: 0000-0001-8544-6551
[7]- MSc in Microbiology, Pharmaceutics Research Center, Institute of Neuropharmacology, Kerman University of Medical Sciences, Kerman, Iran, ORCID: 0000-0003-4907-269X
[8]- Assistant Prof., Dept. of Medicinal Chemistry, Faculty of Pharmacy, Kerman University of Medical Sciences, Kerman, Iran, ORCID: 0000-0002-0910-1516
[9]- Assistant Prof., Dept. of Pharmacology and Toxicology, Faculty of Pharmacy, Kerman University of Medical Sciences, Kerman, Iran, ORCID: 0000-0002-9014-802X
[10]- Associate Prof., Dept. of Pharmaceutical Biotechnology, Faculty of Pharmacy, Kerman University of Medical Sciences, Kerman, Iran, ORCID: 0000-0003-2072-421X
(Corresponding Author) Tel: (034) 31325238, Fax: (034) 31325003, E-mail: h_forootanfar@kmu.ac.ir
نوع مطالعه: پژوهشي | موضوع مقاله: ميكروبيولوژي
دریافت: ۱۳۹۶/۹/۱۵ | پذیرش: ۱۳۹۷/۴/۱۲

ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
CAPTCHA code

ارسال پیام به نویسنده مسئول


کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق

© 2018 All Rights Reserved | Journal of Rafsanjan University of Medical Sciences

Designed & Developed by : Yektaweb