جلد 17، شماره 9 - ( 9-1397 )                   جلد 17 شماره 9 صفحات 815-828 | برگشت به فهرست نسخه ها

XML English Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Edalatmanesh M A, Shahsavan S, Rafiei S, Khodabandeh H. The Effect of Gallic Acid on Depression Symptoms, Oxidative Stress Markers and Inflammatory Cytokines in Rats’ Hippocampus After TMT Intoxication: An Experimental Study . JRUMS. 2018; 17 (9) :815-828
URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-4278-fa.html
عدالت منش محمد امین، شاهسون سولماز، رفیعی سمانه، خدابنده حبیب الله. اثر اسید گالیک بر سطح افسردگی، شاخص‌‌های استرس اکسیداتیو و سایتوکاین‌‌های التهابی در هیپوکامپ موش‌های صحرایی به دنبال مسمومیت با تری‌متیل‌تین: یک مطالعه تجربی . مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان. 1397; 17 (9) :815-828

URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-4278-fa.html


دانشگاه آزاد اسلامی واحد شیراز
متن کامل [PDF 238 kb]   (113 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (441 مشاهده)
متن کامل:   (35 مشاهده)
مقاله پژوهشی
مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان
دوره 17، آبان 1397، 828-815
 
اثر اسید گالیک بر سطح افسردگی، شاخص‌‌های استرس اکسیداتیو و سایتوکاین‌‌های التهابی در هیپوکامپ موش‌های صحرایی به دنبال مسمومیت با تری‌متیل‌تین: یک مطالعه تجربی
 
محمد‌امین عدالت‌منش[1]، سولماز شاهسون[2]، سمانه رفیعی[3]، حبیب‌الله خدابنده[4]
دریافت مقاله: 13/3/97   ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 6/4/97      دریافت اصلاحیه از نویسنده: 4/7/97           پذیرش مقاله: 10/7/97
 
 

چکیده
زمینه و هدف: تری­متیل­تین (Trimethyltin; TMT)، اورگانوتینی است که سبب دژنراسیون انتخابی هیپوکامپ و بروز نشانه­‌های افسردگی در انسان و جوندگان می­گردد. مطالعه حاضر، اثر اسید گالیک (Gallic Acid; GA) را بر نشانه­‌های افسردگی، شاخص­‌های استرس اکسیداتیو و فعالیت سایتوکاین­‌های التهابی در هیپوکامپ موش­‌های صحرایی به دنبال مسمومیت با TMT بررسی می­کند.
مواد و روش­‌ها: در این مطالعه تجربی، 50 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار به صورت تصادفی در 5 گروه شامل کنترل، TMT+Saline، 50TMT+GA،100TMT+GA و 200TMT+GA قرار گرفتند. 48 ساعت پس از مسمومیت با TMT، گروه‌‌های دریافت کننده GA، دوز‌های 50، 100 و 200 میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن و گروه TMT+Saline، نرمال سالین را به مدت 14 روز دریافت کردند. پس از بررسی علائم افسردگی، سطوح هیپوکامپی سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، گلوتاتیون پراکسیداز (GPX)، مالون­دی­آلدئید (MDA)، فاکتور نکروزدهنده توموری آلفا (TNF-α) و اینترلوکین 1 بتا (IL-1β) به روش الایزا سنجیده شد.  جهت بررسی اختلاف بین گروه‌ها از آنالیز واریانس یک­طرفه با آزمون تعقیبی Tukey استفاده شد.
یافته­‌ها: نتایج نشان ­دهنده افزایش مدت زمان بی حرکتی در گروه­ TMT+Saline نسبت به گروه کنترل و کاهش معنی­دار این زمان در گروه­‌های دریافت کننده اسید گالیک در دوز‌های بالا بود (001/0>p). اسید گالیک سبب افزایش فعالیت آنزیم‌‌های آنتی‌اکسیدانی (SOD، CAT و GPX) و کاهش میزان MDA، TNF-α و IL-1β نسبت به گروه TMT+Saline گردید (05/0˂P).
نتیجه گیری: تجویز اسید گالیک با تعدیل فاکتور‌های التهابی و کاهش استرس اکسیداتیو سبب بهبود علائم افسردگی ایجاد شده توسط TMT گردید.
واژه ‌های کلیدی: تری‌متیل‌تین ، افسردگی، اسید گالیک، استرس اکسیداتیو، سایتوکین­‌های التهابی، موش صحرایی
 

مقدمه
تری‌متیل‌تین­ (Trimethyltin; TMT) ارگانوتینی است که در پلی وینیل کلراید (Poly Vinyl Chloride; PVC) و محصولات سیلیکونی مانند ظروف آشپزخانه، بسته‌بندی‌های مواد غذایی و آفت­کش­‌ها به فراوانی یافت می‌شود ]1[. این ترکیب در سیستم آب آشامیدنی منازل، محیط‌های آبی و دریایی نیز دیده شده است ]2[. از آنجایی که این ماده به عنوان یک فرآورده جانبی جهت تثبیت پلاستیک کاربرد دارد، غالباً مسمومیت حاد آن در کارخانه­جات پلاستیک یا صنایعی که نیاز به حرارت دادن پلاستیک دارند، مشاهده شده است ]3[.
مسمومیت با TMT سبب ایجاد اختلالات رفتاری- شناختی در انسان و حیوانات آزمایشگاهی می­شود ]4[. عوارض نوروتوکسیک این ترکیب در انسان باعث ایجاد سندرم لیمبیک-مخچه می‌گردد که با اختلال حافظه، گیجی، صرع، فراموشی، بی خوابی و افسردگی همراه است ]5[. در جوندگان، TMT سبب القاء ضایعاتی در هیپوکامپ و سیستم لیمبیک می‌گردد ]6[. به عنوان یک مدل حیوانی، مکانیزم­‌های مولکولی نظیر التهاب عصبی، سمیت تحریکی، افزایش درون سلولی کلسیم، اختلالات میتوکندریایی و استرس اکسیداتیو به دنبال مسمومیت با TMT قابل بررسی هستند، منجر به دژنراسیون هیپوکامپ می‌گردند ]7[. استرس اکسیداتیو با تولید گونه­های اکسیژن و نیتروژن واکنشی و لیپو پراکسیداسیون مشخص می‌گردد. در حالی که آسیب میتوکندریایی احتمالاً نتیجه بر هم کنش TMT با پروتئین استانین (SNN) است که منجر به آزادسازی سیتوکروم C و فعالیت کاسپاز‌ها می‌شود. افزایش کلسیم با آزاد سازی کلسیم از ذخایر درون سلولی (میتوکندری و شبکه اندوپلاسمی) نتیجه فعالیت کالپین و کاتپسین D است که به دنبال مسمومیت با TMT در سلول­‌های مغزی رخ می­دهد ]8[. مطالعات اخیر التهاب عصبی را به دنبال مسمومیت با TMT در سلول‌های میکروگلیال نشان داده است ]9[. فاکتور نکروز دهنده توموری آلفا (Tumor Necrosis Factor; TNF-α) قوی­ترین تنظیم کننده التهابی است که می‌تواند تولید سایتوکین­‌های دیگری را که مسئول شروع مرگ نورونی هستند، القاء نماید ]10[. این عامل به عنوان فاکتور اصلی القاء کننده مرگ سلولی ناحیه ژیروس دندانه‌ای به دنبال تجویز TMT شناخته شده است ]11[ که احتمالاً با SNN نیز مرتبط است ]7[. فعالیت میکروگلیالی به موازات افزایش بیان TNF-α، تولید سایتوکاین­‌های دیگر نظیر اینترلوکین 1-آلفا و بتا را نیز در هیپوکامپ افزایش می‌‌دهد ]11[. در واقع، بین عمل­کرد سایتوکاین­‌ها در مغز و فعالیت عصبی در بیماران مبتلا به اختلالات عصبی- روانی ارتباط وجود دارد ]12[. مطالعات نشان داده‌اند که بیمارانی مبتلا به افسردگی و اختلال دو قطبی سطوح افزایش یافت‌های از سایتوکاین­‌های پیش التهابی را در سرم خون دارند ]13[.
اسید گالیک (3 و 4 و 5- تری هیدروکسی بنزوئیک اسید) یکی از مهم‌ترین ترکیبات پلی‌فنولی در گیا‌هان و محصول هیدرولیز تانن‌‌ها می‌باشد ]14[. این ترکیب اثرات ضد دیابتی، ضد سرطان‌ و جهش‌زایی و ضد ویروسی و آپوپتوز و آنتی‌اکسیدان را نشان می‌دهد ]15[ و از آسیب اکسایشی به کبد و کلیه جلوگیری می‌کند ]16[. هم‌چنین، سلول‌‌های عصبی را در برابر مرگ القاء شده توسط پپتید‌های آمیلوئیدی β () حفاظت می‌کند ]17[. هر چند، مطالعات نشان داده اند که TMT بدون آسیب به سد خونی سبب ایجاد ضایعات نورونی می­گردد ]18[، با این حال اسید گالیک می‌تواند به راحتی از طریق سد خونی مغزی عبور کند و عملکرد نورونی را در نواحی بحرانی مغز بهبود بخشد ]19[.
بنابراین، با توجه به توزیع گسترده ارگانوتین­‌ها و امکان مسمومیت با آن و از طرفی یافتن یک ترکیب آنتی‌اکسیدان با خصوصیت محافظت کننده عصبی و تعدیل کننده خلق، پژوهش حاضر به ارزیابی اثر اسید گالیک بر سطح افسردگی، شاخص­‌های استرس اکسیداتیو و سایتوکین­‌های التهابی در هیپوکامپ موش­‌های صحرایی به دنبال مسمومیت با TMT می­پردازد.
مواد و روش‌‌ها
در این تحقیق تجربی، از 50 سر موش صحرایی نر نژاد اسپراگ داولی با وزن 10±220 گرم و سن تقریبی دو ماه استفاده شد. موش­‌های صحرایی در طول مدت آزمایش در شرایط استاندارد با چرخه‌ی ۱۲ساعت روشنایی و ۱۲ساعت تاریکی و دمای ۲±24 درجه سانتی‌گراد و رطوبت 10±50 درصد در حیوان­خانه آزمایشگاه تحقیقاتی علوم جانوری دانشگاه آزاد اسلامی‌شیراز نگهداری شدند. در این پژوهش از غذای مخصوص موش با فرمولاسیون استاندارد (شرکت تولیدی غذای دام و طیور فارس) استفاده شد و به همراه آب آشامیدنی به صورت نامحدود در اختیار حیوانات قرارگرفت. به­ منظور حصول سازش با محیط، آزمایش‌‌ها پس از گذشت حداقل 10 روز بعد از استقرار حیوانات به انجام رسید. تمام آزمایش‌‌ها مطابق با قوانین بین‌المللی نگهداری (شامل استفاده از حداقل تعداد نمونه آزمایشگاهی) و مراقبت از حیوانات و با نظارت کمیته اخلاقی دانشگاه آزاد اسلامی‌ واحد شیراز و با کد اخلاق 4512-2136-95 انجام شد.
حیوانات به صورت تصادفی در 5 گروه ( هر گروه شامل 10 سر) تقسیم شدند: گروه کنترل: در حیوانات این گروه هیچ نوع ماد‌ه­ای تزریق نشده و به منظور بررسی با سایر گروه­‌های مورد مطالعه، مورد استفاده قرار گرفت. گروه TMT+Saline: حیوانات این گروه دوز 8 میلی­گرم بر کیلوگرم تری متیل تین (TMT; Sigma, Germany) را به صورت درون صفاقی دریافت نمودند ]20[ و سپس حلال اسید گالیک یعنی نرمال سالین را به مدت 14 روز به صورت خوراکی دریافت کردند. گروه­‌های 50TMT+GA، 100TMT+GA و 200TMT+GA: حیوانات این سه گروه 48 ساعت پس از دریافت تری‌متیل‌تین، به مدت 14 روز به ترتیب دوز‌های 50، 100 و 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن  اسید گالیک (Sigma, Germany)  را به صورت گاواژ دریافت نمودند.
آزمون‌‌های رفتاری سنجش افسردگی پس از پایان دوره تیمار با نرمال سالین و یا اسید گالیک انجام شد. به منظور اطمینان از داده‌‌های به دست آمده فیلم­‌های به دست آمده توسط شخص دیگری به جز محققین بازبینی شدند. کلیه آزمایشات در زمان غروب آفتاب که تحرک موش‌‌های صحرایی بالاتر است، انجام شد. هر آزمایش حداقل برای هر حیوان سه بار در فواصل زمانی 24 ساعته تکرار شد.
آزمون شنا کردن اجباری، بازتاب دهنده یک مرحله از یأس رفتاری در افسردگی می‌باشد. در این آزمون موش‌‌های صحرایی در استوانه‌ای به ارتفاع 60 سانتی‌متر و قطر 18 سانتی‌متر که 30 سانتی‌متر از آن توسط آب آشامیدنی با دمای 22 درجه سانتی‌گراد پر شده است، قرار داده شدند. حیوانات پس از تجربه 15 دقیقه‌ای شنا در روز اول، 24 ساعت بعد به مدت 5 دقیقه مورد آزمایش قرار گرفتند. دوره زمانی عدم تحرک (بی‌حرکتی)، مدت زمان شنا، مدت زمانی که موش صحرایی در زیر آب قرار دارد (شیرجه زدن) و مدت زمانی که صرف بالا رفتن از دیواره می‌کند توسط دوربین مدار بسته  ثبت و سپس بر حسب ثانیه اندازه‌گیری شد. عدم تحرک مدت زمان بی‌حرکتی برای حداقل 2 ثانیه یا تنها آن دسته از حرکاتی که الزاماً برای نگهداری بینی بالای آب انجام می‌شود، در نظر گرفته شد ]21[. به منظور بررسی اعتبار مدل ایجاد شده و سنجش میزان افسردگی در گروه‌‌های مختلف از آزمون آویزان کردن از دم استفاده شد. هر حیوان از سقف یک محفظه مکعب شکل با اضلاعی به طول 25 سانتی متر از دم آویزان می‌شود به طوری که دو دست حیوان روی کف محفظه قرار دارد ]21[. دم حیوان به کمک نوار چسب پلاستیکی نرم به قلابی که درست در مرکز سقف این محفظه قرار دارد بسته می‌شود. سعی می‌شود تا هیچ نوع آسیبی در این وضعیت به حیوان وارد نشود. دیواره‌ای که رو به روی آزمایش‌گر قرار دارد به منظور ایجاد ثبت حرکات حیوان، از جنس پلاستیک شفاف و متحرک می‌باشد. مدت زمان مورد محاسبه در این آزمون 5 دقیقه می‌باشد. در این بازه زمانی، مدت زمان عدم تحرک حیوان به وسیله آزمایش­گر ثبت شد.
پس از انجام آزمون­‌های رفتاری، حیوانات هر گروه با دوز کشنده کلروفورم بیهوش و بلافاصله سر حیوان با دستگاه گیوتین مخصوص جوندگان جدا گردید. مغز به طور کامل از جمجمه خارج شد و به سرعت بر روی یخ قرار گرفت. هیپوکامپ موش‌‌های صحرایی با دقت در زیر استریوسکوپ (Olympus, Japan) از بقیه قسمت­‌های مغز جدا شد. پس از شستشو با محلول سالین به همراه بافر تریس (Sigma, Germany) به مدت 5 دقیقه با دستگاه هموژنایزر (IKA, Germany) با 5000 دور در دقیقه هموژنیزه شد. محلول هموژنیزه شده توسط سانتریفیوژ یخچال­دار (Hermle, Germany) سانتریفیوژ و از محلول 5/0میلی­مولار فنیل­متیل­سولفونیل­فلوراید (Sigma-Aldrich, Germany) به­عنوان مهارکننده پروتئاز‌ها استفاده شد. پس از سانتریفیوژ، رو شناور به کمک سمپلر برداشته شد و سپس میزان بافتی فاکتور‌های استرس اکسیداتیو و سایتوکین‌‌های التهابی مورد سنجش قرار گرفت ]22[.
توسط روش ELISA و کیت‌‌های شرکت فاین تست سطح آنزیم‌‌های سوپر اکسید دیسموتاز (Superoxide Dismutase; SOD) با حساسیت >375/9 پیکوگرم بر میلی‌لیتر و محدوده 1000-6/15 پیکوگرم بر میلی‌لیتر، کاتالاز (Catalase; CAT) با حساسیت >75/18 میلی‌واحد بین الملل بر میلی‌لیتر و محدوده 2000-2/31 میلی واحد بین الملل بر میلی‌لیتر، گلوتاتیون پراکسیداز (Glutathione Peroxidase; GPX) با حساسیت >75/18 پیکوگرم بر میلی­لیتر و محدوده 2000-25/31 پیکوگرم بر میلی­لیتر و مالون دی­آلدئید (Malondealdehyde; MDA) با حساسیت >688/4 نانوگرم بر میلی‌لیتر و محدوده 500-813/7 نانوگرم بر میلی­لیتر در هیپوکامپ سنجش شد. هم­چنین، سطح هیپوکامپی TNF-α با حساسیت >875/46 پیکوگرم بر میلی­لیتر و محدوده 5000-125/78 پیکوگرم بر میلی­لیتر و اینترلوکین-1بتا (Interleukin-1β; IL-1β) با حساسیت >75/18 پیکوگرم بر میلی­لیتر و محدوده 2000-25/31 پیکوگرم بر میلی‌لیتر نیز مورد سنجش قرار گرفت ]22[. تجزیه و تحلیل آماری بین گروه­‌های مختلف با استفاده از نرم افزار SPSS ویرایش 22 انجام شد. جهت تعیین اختلاف معنی‌دار بین گروه­‌های مورد نظر در آزمون­‌های رفتاری از آزمون آنالیز واریانس یک­طرفه و آزمون تعقیبی  Tukey استفاده گردید. از نظر آماری مقادیر 05/0> p معنی‌دار در نظر گرفته شد.
نتایج
نتایج حاصل از آنالیز واریانس وجود اختلاف معنی‌داری در مدت زمان بی‌حرکتی بین گروه­‌های کنترل و TMT+Saline نشان داد (شکل 1). در این آزمون مدت زمان بی‌حرکتی حیوان در گروه TMT+Saline به مراتب بیشتر از گروه کنترل می‌باشد (7/31±4/252 ثانیه در مقابل 4/13±8/153 ثانیه، 001/0>P). هم­چنین، در بین گروه‌‌های دریافت کننده اسید گالیک، گروه 200TMT+GA با گروه TMT+Saline اختلاف معنی‌دار در میانگین مدت زمان بی‌حرکتی نشان داد (شکل 1. 001/0 >P). بین گروه­‌های دریافت کننده دوز 50 (9/24±2/242 ثانیه) و 100 (5/30±6/237) اسید گالیک با گروه کنترل نیز اختلاف معنی­دار بود (001/0>P).

شکل 1- مقایسه میانگین  (آنالیز واریانس یک طرفه) مدت زمان بی‌تحرکی طی تست معلق شدن از دم. 001/0> **P مقایسه گروه‌های مختلف با گروه TMT+Saline. 001/0>++P مقایسه گروه‌های دریافت کننده اسید گالیک با گروه TMT+Saline.
علاوه بر این، نتایج نشان دادند که حیوانات گروه TMT+Saline که تری‌متیل‌تین و نرمال سالین دریافت نموده‌اند، اختلاف معنی‌داری در مدت زمان شنا نسبت به گروه کنترل نشان نمی‌دهند (جدول 1). هر چند مدت زمان شنا کردن در گروه‌‌های تست نسبت به گروه TMT+Saline افزایش یافته است با این حال، این افزایش در هیچ یک از گروه‌‌های مورد مطالعه معنی‌دار نیست (05/0<p). تیمار با TMT به طور قابل توجهی مدت زمان بی‌حرکتی را در حیوانات گروه TMT+Saline نسبت به گروه کنترل افزایش داد (001/0>P). از طرفی، تیمار با دوز‌های مختلف اسید گالیک سبب کاهش معنی‌دار مدت زمان بی­حرکتی در گروه­‌های 50TMT+GA، 100TMT+GA و 200TMT+GA نسبت به گروه TMT+Saline گردید (001/0>P). هم­چنین، بین گروه‌‌های 50TMT+GA و 100TMT+GA با گروه کنترل اختلاف معنی­دار وجود دارد (05/0>p). مدت زمان بالا رفتن از دیواره در آزمون شنای اجباری کاهش معنی‌داری را در گروه TMT+Saline نسبت گروه کنترل نشان داد (001/0>P). هم‌چنین، در بین گروه‌های دریافت کننده اسید گالیک تنها گروه 50TMT+GA با گروه کنترل اختلاف معنی‌دار نشان داد (001/0>P). تیمار با اسید گالیک، سبب افزایش معنی­داری در مدت زمان بالارفتن از دیواره استوانه نسبت به گروه TMT+Saline گردید (جدول 1، 001/0>P). در شاخص مدت زمان شیرجه زده در آب، بین گروه کنترل و گروه TMT+Saline اختلاف معنی­داری دیده شد. در واقع این میزان در گروه TMT+Saline کاهش قابل توجهی را نسبت به گروه کنترل نشان داد (جدول 1، 01/0>P). بین گروه‌‌های تیمار با اسید گالیک و گروه کنترل نیز اختلاف معنی‌دار دیده شد (01/0>P). اما بین گروه  TMT+Salineبا گروه‌‌های دریافت کننده اسید گالیک اختلاف معنی‌داری وجود نداشت.
 
 
جدول 1- میانگین و انحراف معیار پارامترهای سنجیده شده بر حسب ثانیه در آزمون شنا کردن اجباری به تفکیک گروه (10=n)
 
گروه/ پارامتر مدت زمان شنا کردن مدت زمان بی حرکتی مدت زمان بالارفتن از دیواره مدت زمان شیرجه زدن
کنترل 42/17 ± 11/227 34/6 ± 36/43 17/6 ± 10/34 66/0 ± 40/4
TMT+Saline 36/25 ± 82/200 57/8 ± 25/89a 49/2 ± 82/10a 5/0 ± 06/1a
TMT+GA50 71/44 ± 75/215 04/6 ± 96/51 a,b 65/7 ± 50/22a,b 24/0 ± 59/1a
TMT+GA100 26/37 ± 08/212 27/8 ± 81/50 a,b 87/5 ± 47/29 a,b,c 70/0 ± 31/1a
TMT+GA200 12/30 ± 21/224 15/5 ± 36/48b 45/4 ± 86/37 b,c,d 35/0 ± 61/1 a
سطح معنی­داری 064/0 001/0 001/0 018/0
 
آنالیز واریانس یک­طرفه و آزمون تعقیبی Tukey، a : 05/0>p در مقایسه با گروه کنترل، b: 05/0>p در مقایسه با گروه TMT+Saline، c: 05/0>p در مقایسه با گروه TMT+GA50 و d: 05/0>p در مقایسه با گروه TMT+GA100.
 
 
هم­چنین، نتایج حاصل از تحلیل داده­‌های این مطالعه نشان داد که فعالیت آنزیم­‌های SOD، CAT و GPX در نمونه­‌های هیپوکامپ موش­‌های صحرایی دریافت کننده TMT که تنها نرمال سالین دریافت نمودند در مقایسه با گروه کنترل به­طور معنی­داری کاهش و میزان MDA، TNF-α و IL-1β به­طور معنی­داری افزایش یافت (05/0>P). در مقایسه با گروه TMT+Saline، فعالیت آنزیم­‌های آنتی­اکسیدانی SOD، CAT و GPX هیپوکامپ در گروه­‌های تیمار شده با دوز‌های مختلف اسید گالیک وابسته به میزان دوز تزریقی به­طور معنی­داری افزایش و میزان MDA، TNF-α  و IL-1β به­طور معنی­داری کاهش یافت (جدول2، 05/0>P).
 
 
جدول 2- میانگین فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی،  میزان MDA و سایتوکین­های التهابی هیپوکامپ به تفکیک گروه (10=n)
 
گروه/ پارامتر SOD
(پیکوگرم بر میلی‌لیتر)
CAT
(میلی واحد بین الملل بر میلی‌لیتر)
GPX
(پیکوگرم بر میلی‌لیتر)
MDA
(نانوگرم بر میلی‌لیتر)
TNF-α
(پیکوگرم بر میلی‌لیتر)
IL-1β
(پیکوگرم بر میلی‌لیتر)
کنترل 45/11 ± 39/60 97/17 ± 23/114 42/7 ± 37/90 26/5 ± 44/37 42/8 ± 43/95 21/5 ± 30/49
TMT+Saline 15/7 ± 20/35 a 18/9 ± 67/45a 86/4 ± 08/38a 43/9 ± 17/90a 41/15 ± 11/188 a 08/9 ± 78/103a
TMT+GA50 96/7 ± 05/46a,b 75/10 ± 11/53a,b 89/ 7± 27/42a 05/7 ± 83/67 a,b 74/11 ± 63/157 a 35/7 ± 53/94 a
TMT+GA100 63/4 ± 11/49 a,b 86/7 ± 35/82a,b,c 23/5 ± 40/59 a,b,c 22/8 ± 11/59 a,b 53/10 ± 33/118 a,b,c 10/8 ± 18/71 a,b,c
TMT+GA200 83/8 ± 72/52 a,b,c 57/12 ± 36/92b,c,d 71/6 ± 37/62 a,b,c 35/6 ± 71/44 b,c,d 02/14 ± 84/106 b,c 37/5 ± 43/62a,b,c,d
سطح معنی‌داری 005/0 004/0 011/0 006/0 001/0 013/0
 
آنالیز واریانس یک­طرفه و آزمون تعقیبی Tukey، a : 05/0>p در مقایسه با گروه کنترل، b: 05/0>p در مقایسه با گروه TMT+Saline، c: 05/0>p در مقایسه با گروه TMT+GA50 و d: 05/0>p در مقایسه با گروه TMT+GA100
 
 
بحث
طی این پژوهش به بررسی اثر سمیت تری‌متیل‌تین و ارتباط آن با افسردگی در موش­‌های صحرایی پرداخته شد. سپس، اثر آنتی‌اکسیدانی اسید گالیک در مهار التهاب مغزی و بهبود افسردگی ناشی از این مسمومیت مورد بررسی قرار گرفت. نتایج مطالعه حاضر نشان داد که متعاقب مسمومیت با TMT و افزایش رفتار‌های شبه اضطرابی و افسردگی، سطح سایتوکاین‌های التهابی نظیر TNF-α و IL-1β در هیپوکامپ موش­‌های صحرایی به شدت افزایش می­یابد. هم­چنین، علیرغم کاهش قابل توجه فعالیت آنزیم­‌های آنتی­اکسیدانی (SOD، CAT و GPX)، میزان پراکسیداسیون لیپیدی و سطح MDA افزایش معنی­داری پیدا می­کند. این در حالی است که تیمار با گالیک اسید به عنوان یک آنتی‌اکسیدان بالقوه ضمن کاهش سطح سایتوکاین­‌های التهابی و پراکسیداسیون لیپیدی و با افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی بافت هیپوکامپ، اثرات ضد افسردگی و اضطراب قابل توجهی به ویژه در دوز‌های بالا نشان می­دهد. از آنجایی که در بسیاری از مطالعات اثرات سمیت عصبی TMT به اثبات رسیده است ]4-3[ و مطالعات متعددی به بیان عملکرد‌های شناختی و رفتاری مرتبط با این نوع سمیت عصبی پرداخته اند ]8[. با این حال، هنوز مکانیزم دقیق پاتولوژی این اختلالات و نشانه­های خلقی مرتبط با آن مشخص نشده است.
مطالعات آزمایشگاهی نشان داده­اند که به دنبال مسمومیت با TMT و به دلیل مرگ انتخابی نورون­ها در سیستم لیمبیک و به ویژه هیپوکامپ، نقصان حافظه و یادگیری رخ می‌دهد ]9[. علیرغم اینکه اطلاعات اندکی درباره اثر TMT بر بروز رفتار‌های شبه افسردگی وجود دارد، مطالعه Moghadas و Edalatmanesh در سال 2015 نشان داد که تجویز این ماده در موش­‌های صحرایی سبب بروز علائم افسردگی همراه با اختلالات شناختی می‌گردد ]23[. پاتوژنز مشترکی بین اختلالات سایکولوژیک و نورودژنراتیو دیده می‌شود و در واقع بین اختلالاتی نظیر افسردگی و استرس با مرگ نورونی در هیپوکامپ رابطه مستقیمی‌ وجود دارد ]24[. آسیب سلولی هیپوکامپ به همراه افزایش سطح سایتوکاین‌‌های التهابی مانند TNF-α و IL-1β در هیپوکامپ و بروز رفتار‌های شبه افسردگی، نشانه افسردگی با التهاب هیپوکامپ است که در این مطالعه دیده شد.
علاوه بر این، اثر تعدیل کنندگی خلق اسید گالیک بر کاهش شدت رفتار‌های شبه افسردگی ناشی از TMT، فرضیه­ التهاب عصبی درگیر در اختلالات خلقی را با بررسی اثرات اسید گالیک بر سطح بیان سایتوکاین‌‌های التهابی در مطالعه حاضر مورد بررسی قرار داد. تیمار با اسید گالیک سطح سایتوکاین‌‌های التهابی مانند TNF-α و IL-1β را در نمونه­‌های هیپوکامپ موش‌‌های صحرایی مسموم شده با TMT به طور معنی­داری کاهش داد. مطالعات قبلی نشان داده اند که سمیت TMT با فعالیت میکروگلیا‌ها وابسته است] 27-25[ و فعالیت میکروگلیایی سبب تولید سایتوکاین­‌های التهابی می‌گردد ]27[. میکروگلیا‌ها در نخستین روز مسمومیت با TMT فعال شده و در یک بازه زمانی نسبتاً طولانی فعالیت­شان حفظ می‌شود ]28[. شواهدی مبنی بر فعالیت سلول­‌های میکروگلیایی و تنظیم افزایشی سایتوکاین­‌های پیش التهابی نظیر TNF-α، IL-1α و 6IL- در هیپوکامپ نیز وجود دارد ]11[.  هم­چنین، در سلول­های هیپوکامپی کشت داده شده از ناحیه ی ژیروس دندانه ای بیان TNF-α و گیرنده‌ی TNFR1 در حضور TMT افزایش یافته است ]29[. این ملکول­‌ها نقش تعدیل کنند‌های در مراحل آغازین سمیت عصبی با واسطه TMT دارند ]26[.
افزایش سطوح سایتوکاین­‌های التهابی در افسردگی و کاهش سطح آن‌ها به دنبال مصرف دارو‌های ضد افسردگی وجود دارد ]30[. با شدت گرفتن سطح افسردگی میزان TNF-α در سرم بیماران افزایش می‌یابد و احتمال وجود رابطه ی مثبت بین سایتوکاین­‌های پیش التهابی و رفتار خودکشی در میان بیماران افسرده وجود دارد ]31[. لذا در این مطالعه احتمالاً مسمومیت TMT با افزایش سطح سایتوکاین­‌های التهابی سبب بروز افسردگی می‌گردد. Himmerich و همکاران سطوح افزایش یافت‌های از TNF-α، 4IL-، 6IL- و 10IL- در موش­‌های صحرایی به دنبال استرس بی حرکتی یا شنای اجباری مشاهده نمودند ]32[.
اسید گالیک و مشتقات آن به فرم‌‌های متیله شده (مانند سیرنژیک اسید) یا فرم­‌های گالوئیلی در بسیاری از عمل­کرد‌های بیولوژیکی و فارماکولوژیکی مانند اثرات ضد التهابی و حفاظت نورونی دخالت دارند ]33[. این عملکرد‌ها احتمالأ ناشی از پتانسیل ضداکسیدانی این ترکیبات است که به قابلیت آن ‌ها در جلوگیری از آسیب ناشی از رادیکال­‌های آزاد و نیز جلوگیری از تولید رادیکال­‌های آزاد اشاره دارد ]34[. اسید گالیک قادر است سلول­های عصبی را از مرگ ناشی از رسوب بتا آمیلوئیدی حفظ نماید ]35[. تجویز مزمن استر‌های تری متیل اسید گالیک اختلالات رفتاری ناشی از استرس مزمن نظیر اختلال در فعالیت­های لوکوموتور، اضطراب و کاهش ظرفیت حافظه و یادگیری را بهبود می­بخشد. هم‌چنین، تجویز این ترکیب سبب افزایش سطح گلوتاتیون و کاهش پراکسیداسیون چربی و سطح نیتریت می­گردد ]36[. Mansouri و همکاران نشان دادند که احتمالاً اسید گالیک از طریق تأثیر بر گیرنده سروتونینی 5HT-1A و نه گیرنده­‌های بنزودیازپینی دارای اثرات ضد اضطرابی می‌باشد ]37[.  هر چند نیاز به مطالعه بیشتر درباره اثرات ضد افسردگی اسید گالیک احساس می‌شود، Can و همکاران به نقش دوگانه گیرنده­‌های سروتونینی و کولینرژیک در بیان اثرات ضد افسردگی اسید گالیک اشاره می­کنند ]38[. در مطالعه حاضر، علیرغم کاهش سطح SOD، CAT و GPX در گروه TMT+Saline، در گروه‌‌های تیمار با اسید گالیک افزایش سطح این آنزیم­‌های آنتی‌اکسیداتیو با افزایش دوز تجویزی دیده شد. در واقع TMT با القاء استرس اکسیداتیو سبب کاهش فعالیت آنزیم­‌های آنتی‌اکسیدانی و افزایش فعالیت MDA می‌گردد.
نتیجه‌گیری
از آنجایی که طی این مطالعه مشخص گردید، تجویز
TMT سبب بروز رفتار‌های شبه افسردگی در موش‌‌های صحرایی می­گردد و این رفتار‌ها نه تنها به مرور زمان کاهش نمی‌یابند، بلکه تثبیت شده و به طور پیشروند‌های ادامه پیدا خواهند کرد. لذا، مدل دژنراسیون عصبی القاء شده با TMT می‌تواند به عنوان یک مدل پایدار در مطالعه رفتار افسردگی مورد بررسی قرار گیرد  و مدل معتبری برای بررسی فرضیات افسردگی باشد. هم­چنین، مطالعه حاضر با بررسی اثر آنتی‌اکسیدانی، ضد التهابی و ضد افسردگی اسید گالیک نشان داد که این ترکیب قابلیت تعدیل خلق را در مدل حاضر دارد و می‌تواند به عنوان یک داروی کارآمد مورد مصرف انسانی نیز قرار گیرد و با توجه به این اثرات جانبی بسیار کم، نوید داروی مؤثر و مفیدی در تعدیل رفتار‌های اضطرابی و افسردگی را بدهد.
تشکر و قدردانی
از زحمات معاونت و مدیریت محترم پژوهش دانشگاه آزاد اسلامی‌شیراز در اعطای تسهیلات لازم جهت اجرای این پروژه صمیمانه قدردانی می‌شود. بخشی از منابع مالی این پژوهش از محل پژو‌هانه سال 1396 نویسنده مسئول تامین شده است.
.
 
 
 
 
 
 
 
References
 
 
[1] Ferraz da Silva I, Freitas-Lima LC, Graceli JB, Rodrigues LCM. Organotins in Neuronal Damage, Brain Function, and Behavior: A Short Review. Front Endocrinol (Lausanne) 2018;8: 366.
[2] Gomez FD, Apodaca P, Holloway LN, Pannell KH, Whalen MM. Effect of a series of triorganotins on the immune function of human natural killer cells. Environ Toxicol Pharmacol 2007; 23(1): 18–24.
[3] Shintani N, Ogita K, Hashimoto H, Baba A. Recent studies on the trimethyltin actions in central nervous systems. Yakugaku Zasshi 2007; 127(3): 451-61.
[4] Lee S, Yang M, Kim J, Kang S, Kim J, Kim JC, et al. Trimethyltin-induced hippocampal neurodegeneration: A mechanism-based review. Brain Res Bull 2016; 125: 187-99.
[5] Saary MJ, House RA. Preventable exposure to trimethyltin chloride: a case report. Occup Med 2002; 52(4): 227–30.
[6] Baciak L, Gasparova Z, Liptaj T, Juranek I. In vivo magnetic resonance approach to trimethyltin induced neurodegeneration in rats. Brain Res 2017; 1673: 111-6.
[7] Billingsley ML, Yun J, Reese BE, Davidson CE, Buck-Koehntop BA, Veglia G. Functional and structural properties of stannin: roles in cellular growth, selective toxicity, and mitochondrial responses to injury. J Cell Biochem 2006; 98(2): 243-50.
[8] Geloso MC, Corvino V, Michetti F. Trimethyltin-induced hippocampal degeneration as a tool to investigate neurodegenerative processes. Neurochemistry Int 2011; 58(7): 729-38.
[9] Kaur S, Sharma N, Nehru B. Anti-inflammatory effects of Ginkgo biloba extract against trimethyltin-induced hippocampal neuronal injury. Inflammopharmacology 2018; 26(1): 87-104.
[10] Harry GJ, Kraft AD.Microglia in the developing brain: a potential target with lifetime effects. Neurotoxicology 2012; 33(2): 191-206.
[11] Harry GJ, Funk JA, Lefebvre d’ Harry GJ, Funk JA, Lefebvre d’Hellencourt C, McPherson CA, et al. The type 1 interleukin 1 receptor is not required for the death of murine hippocampal dentate granule cells and microglia activation. Brain Res 2008; 1194: 8–20.
[12] Felger JC, Lotrich FE. Inflammatory cytokines in depression: neurobiological mechanisms and therapeutic implications. Neuroscience 2013; 246: 199-229.
[13] Barbosa IG, Bauer ME, Machado-Vieira R, Teixeira AL. Cytokines in bipolar disorder: paving the way for neuroprogression. Neural Plast 2014; 2014: 360481.
[14] Kosuru RY, Roy A, Das SK, Bera S. Gallic Acid and Gallates in Human Health and Disease: Do Mitochondria Hold the Key to Success? Mol Nutr Food Res 2018; 62(1).
[15] Choubey S, Goyal S, Varughese LR, Kumar V. Probing Gallic Acid for Its Broad Spectrum Applications. Mini Rev Med Chem 2018; 18(15): 1283-93.
[16] Reckziegel P, Dias VT, Benvegnú DM, Boufleur N, Barcelos RCS, Segat HJ, et al. Antioxidant protection of gallic acid against toxicity induced by Pb in blood, liver and kidney of rats. Toxicol Rep 2016; 3: 351-36.
[17] Omar SH, Scott CJ, Hamlin AS, Obied HK. The protective role of plant biophenols in mechanisms of Alzheimer's disease. J Nutr Biochem 2017; 47: 1-20.
[18] Little AR, Miller DB, Li S, Kashon ML, O'Callaghan JP. Trimethyltin-induced neurotoxicity: gene expression pathway analysis, q-RT-PCR and immunoblotting reveal early effects associated with hippocampal damage and gliosis. Neurotoxicol Teratol 2012; 34(1): 72-82.
[19] Farbood Y, Sarkaki A, Hashemi S, Mansouri MT, Dianat M. The effects of gallic acid on pain and memory following transient global ischemia/reperfusion in Wistar rats. Avicenna J Phytomed 2013; 3(4): 329-40.
[20] Rafiei S, Bazyar Y, Edalatmanesh MA. Effect of Gallic Acid and Endurance Exercise Training on BDNF in a Model of Hippocampal Degeneration. Shefaye Khatam 2016; 4(1):1-6. [Farsi]
[21] Moghadas M, Edalatmanesh MA, Hosseini M. Effect of Lithium Chloride on Serum Levels of BDNF, TNF-α, and Wet Weight of Brain in an Animal Model of Depression. Shefaye Khatam 2014; 2(4): 9-19. [Farsi]
[22] Sadoughi SD, Edalatmanesh MA, Rahbarian R. The Effect of Curcumin on Pituitary-Gonadal Axis, DNA Oxidative Damage and Antioxidant Enzymes Activity of Testicular Tissue in Male Diabetic Rats. J Fasa Univ Med Sci 2018; 7(4): 511-20 [Farsi].

1. [23] Moghadas M, Edalatmanesh, MA. Protective effect of Lithium Chloride against Trimethyltin-induced hippocampal degeneration and comorbid depression in rats. Comp Clin Pathol 2015; 24: 1165.

[24] Lee AL, Ogle WO, Sapolsky RM. Stress and depression: possible links to neuron death in the hippocampus. Bipolar Disord 2002; 4(2): 117-28.
[25] Fabrizi C, Pompili E, Somma F, De Vito S, Ciraci V, Artico M, et al. Lithium limits trimethyltin-induced cytotoxicity and proinflammatory response in microglia without affecting the concurrent autophagy impairment. J Appl Toxicol 2017; 37(2): 207-13.
[26] Kraft AD, McPherson CA, Harry GJ. Association Between Microglia, Inflammatory Factors, and Complement with Loss of Hippocampal Mossy Fiber Synapses Induced by Trimethyltin. Neurotox Res 2016; 30(1): 53-66.
[27] Kim J, Yang M, Son Y, Jang H, Kim D, Kim JC, et al. Glial activation with concurrent up-regulation of inflammatory mediators in trimethyltin-induced neurotoxicity in mice. Acta Histochem 2014; 116(8): 1490-500.
[28] Kim DJ, Kim YS. Trimethyltin-Induced Microglial Activation via NADPH Oxidase and MAPKs Pathway in BV-2 Microglial Cells. Mediators Inflamm 2015; 2015: 729509.
[29] Figiel I, Dzwonek K. TNF alpha and TNF receptor 1 expression in the mixed neuronal-glial cultures of hippocampal dentate gyrus exposed to glutamate or trimethyltin. Brain Res 2007; 1131: 17-28.
[30] Rushaniya A K, Rodrigo MV, Jing D, Husseini KM. A potential role for pro-inflammatory cytokines in regulating synaptic plasticity in major depressive disorder. Int J Neuropsychopharmacol 2009; 12: 561–78.
[31] Serafini G, Pompili M, Innamorati M, Dwivedi Y, Brahmachari G, Girardi P. Pharmacological properties of glutamatergic drugs targeting NMDA receptors and their application in major depression. Curr Pharm Des 2013; 19(10): 1898-922.
[32] Himmerich H, Fischer J, Bauer K, Kirkby KC, Sack U, Krügel U. Stress-induced cytokine changes in rats. Eur Cytokine Netw 2013; 24(2): 97-103.
[33] Choubey S, Varughese LR, Kumar V, Beniwal V. Medicinal importance of gallic acid and its ester derivatives: a patent review. Pharm Pat Anal 2015; 4(4): 305-15.
[34] Daglia M, Di Lorenzo A, Nabavi SF, Talas ZS, Nabavi SM. Polyphenols: well beyond the antioxidant capacity: gallic acid and related compounds as neuroprotective agents: you are what you eat! Curr Pharm Biotechnol 2014; 15(4): 362-72.
[35] Omar SH, Scott CJ, Hamlin AS, Obied HK. The protective role of plant biophenols in mechanisms of Alzheimer's disease. J Nutr Biochem 2017; 47:1-20.
[36] Chhillar R, Dhingra D. Antidepressant-like
activity of gallic acid
in mice subjected to unpredictable chronic mild stress. Fundam Clin Pharmacol 2013; 27(4): 409-18.
[37] Mansouri MT, Soltani M, Naghizadeh B, Farbood Y, Mashak A, Sarkaki A. A possible mechanism for the anxiolytic-like effect of gallic acid in the rat elevated plus maze. Pharmacol Biochem Behav 2014; 117: 40-6.
[38] Can ÖD, Turan N, Demir Özkay Ü, Öztürk Y. Antidepressant-like effect of gallic acid in mice: Dual involvement of serotonergic and catecholaminergic systems. Life Sci 2017; 190: 110-7.  


The Effect of Gallic Acid on Depression Symptoms, Oxidative Stress Markers and Inflammatory Cytokines in Rats’ Hippocampus After TMT Intoxication: An Experimental Study
 
 
M. A. Edalatmanesh[5], S. Shahsavan[6], S. Rafiei[7], H. Khodabandeh[8]
 
Received: 03/06/2018  Sent for Revision: 27/06/2018    Received Revised Manuscript: 26/09/2018              Accepted: 02/10/2018
 
Background and Objectives: Trimethyltin (TMT) is an organotin which causes selective degeneration in hippocampus and leads to the appearance of depression in humans and rodents. The present study investigated the effect of Gallic acid (GA) on depression symptoms, oxidative stress markers and inflammatory cytokines functions in rats’ hippocampus after TMT intoxication.
Materials and Methods: In this experimental study, 50 adult Wistar rats were randomly devided into 5 groups: Control, TMT+Saline, TMT+GA50, TMT+GA100, and TMT+GA200. 48 h after TMT intoxication, GA-treated groups received 50, 100 and 200 mg/kg of GA, and TMT+saline group received saline for 14 days. After evaluation of depression symptoms, the hippocampal levels of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPX), malondealdehyde (MDA), Tumor necrosis factor (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) were measured by ELISA technique. Differences between the groups were analyzed by ANOVA with Tukey’s post hoc test.
Results: The results indicated an increase in the immobility time in the TMT+Saline group compared with the controls and a significant decrease in immobility time in the groups treated with high doses of GA (p˂0.001). GA treatment increased the function of antioxidant enzymes (SOD, CAT and GPX) and decreased MDA, TNF-α and IL-1β in comparison with the TMT+Saline group (p˂0.05).
Conclusion: Administration of GA led to amelioration of depression symptoms caused by TMT intoxication through adjustment of inflammatory factors and reduction of oxidative stress.
Key words: Trimethyltin, Depression, Gallic acid, Oxidative stress, Inflammatory cytokine, Rat
 
Funding: This research was funded partially by Islamic Azad University of Shiraz .
Conflict of interest: None declared.
Ethical approval: The Ethics Committee of Islamic Azad University of Shiraz approved the study with approval number of 96-4512-3754.
 
 
How to cite this article: Edalatmanesh MA, Shahsavan S, Rafiei S, Khodabandeh H. The Effect of Gallic Acid on Depression Symptoms, Oxidative Stress Markers and Inflammatory Cytokines in Rats’ Hippocampus After TMT Intoxication: An Experimental Study. J Rafsanjan Univ Med Sci 2018; 17 (9): 815-28. [Farsi]
 
 
  1. - (نویسنده مسئول) استادیار فیزیولوژی، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، واحد شیراز، دانشگاه آزاد اسلامی، شیراز، ایران
تلفن: 36410041-071، دورنگار: 36410059-071، پست الکترونیکی: amin.edalatmanesh@gmail.com
[2]- دانشجوی دکتری فیزیولوژی جانوری، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، واحد شیراز، دانشگاه آزاد اسلامی، شیراز، ایران
[3]- دانشجوی دکتری بیوشیمی‌و متابولیسم ورزشی، گروه فیزیولوژی ورزشی، پردیس بین المللی کیش، دانشگاه تهران، کیش، ایران
[4]- کارشناس ارشد زیست شناسی سلولی- تکوینی، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، واحد شیراز، دانشگاه آزاد اسلامی، شیراز، ایران
 
[5]- Assistant Prof. of Physiology, Dept. of Biology, Faculty of Sciences, Shiraz Branch, Islamic Azad University, Shiraz, Iran, ORCID: 0000-0002-7936-1145.
(Corresponding Author): Tel: (071)36410041, Fax:( 071)36410059, E-mail: amin.edalatmanesh@gmail.com
[6]- PhD Candidate  of Animal Physiology, Dept. of Biology,  Faculty of Sciences, Shiraz Branch, Islamic Azad University, Shiraz, Iran, ORCID: 0000-0001-7505-7595.
[7]- PhD Candidate of Biochemistry and Exercise Metabolism, Dept. of Exercise Physiology, Kish International Campus, Tehran University, Kish, Iran, ORCID: 0000-0001-8516-9902.
[8]- MSc in Cell and Developmental Biology, Dept. of Biology, Faculty of Sciences, Shiraz Branch, Islamic Azad University, Shiraz, Iran,ORCID: 0000-0003-1541-0507.
نوع مطالعه: پژوهشي | موضوع مقاله: فيزيولوژي
دریافت: ۱۳۹۷/۲/۱۸ | پذیرش: ۱۳۹۷/۸/۱۹

ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
CAPTCHA code

ارسال پیام به نویسنده مسئول


کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق

© 2019 All Rights Reserved | Journal of Rafsanjan University of Medical Sciences

Designed & Developed by : Yektaweb