مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

گزارش کوتاه

مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان
دوره 17، مهر 1397، 688-681
 
بررسی فراوانی ژن‌های Necrotizing factor type 1 و Hemolysin در بین سویه‌های اشریشیاکلی جدا شده از بیماران بیمارستان روحانی شهرستان بابل در سال 1396: یک گزارش کوتاه
 
امیرحسین شعبانی[j1] [1]، اکرم امینی[2]، امیرمرتضی ابراهیم زاده نامور[3]
 
دریافت مقاله: 17/6/97   ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 27/6/97    دریافت اصلاحیه از نویسنده: 2/7/97           پذیرش مقاله: 4/7/97

چکیده
زمینه و هدف: در حال حاضر اشریشیا­کلی به عنوان یکی از عوامل اصلی عفونت­های باکتریایی مجاری ادراری در نظر گرفته
می‌شود. هدف از مطالعه حاضر، تعیین فراوانی ژن‌های Necrotizing factor type 1; CNF1 و Hemolysin; Hly در بین سویه‌های اشریشیا­کلی جدا شده از بیماران بیمارستان روحانی شهرستان بابل می‌باشد.
مواد و روش­ها: در این مطالعه توصیفی، 82 سویه اشریشیا­کلی مورد بررسی قرار گرفت. در ادامه تست آنتی­بیوگرام انجام و DNA باکتری استخراج و فراوانی ژن­های CNF1 و Hly به کمک واکنش زنجیره­ای پلیمراز مورد ارزیابی قرار گرفت. [j2] 
یافته‌ها: در بررسی مقاومت آنتی­بیوتیکی، مقاومت به اریترومایسین (9/71 درصد) 59 و ایمی­پنم (0 درصد) بود. هم­چنین درصد سویه­های مقاوم به چند دارو 7/31 درصد و فراوانی ژن­های CNF1 و Hly به ترتیب 28 درصد و 9/32 درصد بود.
نتیجه‌گیری: با توجه به نتایج، فراوانی ژن‌های CNF1 و Hly در بین سویه­های مورد مطالعه، مشابه با مطالعات دیگر بود.
واژه‌های کلیدی: اشریشیا­کلی، عفونت ادراری، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز
 

مقدمه
اشریشیا­کلی یکی از مهم­ترین علل عفونت­های مجاری ادراری محسوب می‌شود ]1[. علاوه بر التهاب مثانه و پیلونفریت می­توان به طیف وسیعی از دیگر عفونت­ها از قبیل پنومونی، استئومیلیت، سپسیس و عفونت­های بیمارستانی نیز اشاره نمود. اتصال باکتری به گیرنده­های اپیتلیال اولین و مهم­ترین مرحله در کلونیزاسیون این ارگانیسم محسوب می­گردد، لذا فاکتورهای بیماری­زای دخیل در چسبندگی در ایجاد این نوع از عفونت‌ها از اهمیت ویژه­ای برخوردار می‌باشند ]2[.
علاوه بر فاکتورهای چسبندگی، توکسین­ها نیز از مهم‌ترین عوامل بیماری­زایی محسوب می‌شوند که می‌توان به CNF1 (Cytotoxic necrotizing factor type 1) و Hly (Hemolysin) اشاره نمود. فاکتور CNF1 یک توکسین 115 کیلو دالتونی از نوع AB توکسین­ها است که توانایی کاتالیز جایگاه فعال گلوتامین از خانوادهRho  از GTPase را دارد ]3[. اکثر سویه­های اشریشیا­کلی حاوی ژن Cnf1 با پتانسیل تولید فاکتور سایتوتوکسیک نکروزان فاکتور نوع یک باعث فعالیت مداوم Rho GTPases، RhoA، Rac1 و Cdc42 خواهند شد، از این رو سویه­های مذکور در ایجاد عفونت­های ادراری پایدار، التهاب حاد پروستات و افزایش سطح پلی مورفونوکلئر­ها سهم به­سزایی را خواهند داشت ]4.[
توکسین Hly یک پروتئین حساس به پروتئین بوده که عملکرد آن ایجاد منافذ متعدد در غشاء سلول‌های مختلف سلول­های پستانداران به خصوص اریتروسیت­ها است ]5[. سویه­های حامل ژن‌های مذکور در ایجاد التهاب­های مجاری ادراری نقش مهمی ‌را ایفاء می‌کنند، به طوری­که التهاب مثانه از مهم­ترین علائم بالینی این سویه­ها می‌باشد ]6[. توکسین حاصل از این ژن در تخریب سلول­های مخاطی، کاهش اثر دهی سلول­های ایمنی، القاء آپوپتوز لنفوسیت­های T، نوتروفیل­ها و سلول­های کلیوی و افزایش دسترسی به مواد مغذی میزبان نقش قابل توجهی را ایفاء می­کند ]7[.
از آن جایی­که اهمیت ژن‌های CNF1 و Hly به وضوح دیده می‌شود لذا هدف از انجام این طرح تعیین فراوانی ژن‌های CNF1 و Hly در بین سویه‌های اشریشیاکلی جدا شده از بیماران بیمارستان روحانی شهرستان بابل در سال 1396 می‌باشد.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه توصیفی-مقطعی، طی مدت شش ماه (خرداد ماه 1396 الی آبان 1396) با مراجعه به آزمایشگاه بیمارستان آیت الله روحانی شهر بابل سویه­های اشریشیا‌کلی جمع‌آوری و به آزمایشگاه میکروب شناسی دانشگاه علوم پزشکی بابل ارسال گردید. هم­چنین این مطالعه دارای کد اخلاق از دانشگاه علوم پزشکی بابل به شماره MUBABOL.HRI.REC.1395.248 می­باشد. سویه­ها ابتدا بر روی محیط مک گانکی آگار (مرک، آلمان) کشت و سپس به کمک تست­هایی از قبیل رنگ­آمیزی گرم تست اندول، کشت در محیط Triple Sugar Iron (مرک، آلمان)، سیمون سیترات (مرک، آلمان)، تست حرکت (مرک، آلمان) و تست اوره (مرک، آلمان) مورد بررسی قرار گرفتند. در ادامه سویه­ها در محیط Brain Heart Infusion حاوی 15 درصد گلیسرول در دمای 20- درجه سانتی گراد ذخیره شدند ]1[.
تست مقاومت آنتی­بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن و با استفاده از دیسک­های آنتی­بیوتیکی اریترومایسین (15 میکروگرم)، توبرامایسین (10 میکروگرم)، سیپرو فلوکساسین (5 میکروگرم)، جنتامایسین (10 میکروگرم)، اوفلوکساسین (5 میکروگرم)، نیتروفورانتوئین (300 میکروگرم)، ایمی‌پنم (10 میکروگرم)، لووفلوکساسین (5 میکروگرم) و تریمتوپریم-سولفامتاکسازول (75/23-25/1 میکروگرم)، (Himedia-India) طبق معیارهای موسسه استاندارد بالینی و آزمایشگاهی انجام گردید ]8[.
در ادامه DNA باکتری با استفاده از کیت تجاری (یکتا تجهیز، ایران) بر اساس پروتکل شرکت سازنده استخراج و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) با استفاده از پرایمرهای اختصاصی انجام گرفت (جدول 1).

 
جدول 1- پرایمرهای استفاده شده جهت بررسی ژن‌های CNF1 و Hly در ایزوله‌های‌های اشریشیا­کلی جدا شده از بیماران بیمارستان روحانی شهرستان بابل در سال 1396
 

منبع	(bp)سایز	پرایمر	ژن
[9]	693	F: 5′- TTATATAGTCGTCAAGATGGA-3′	CNF1
		R: 5′- CACTAAGCTTTACAATATTGA-3′
[9]	565	F: 5′- AGATTCTTGGGCATGTATCCT-3′	Hly
		R:5′- TTGCTTTGCAGACTGTAGTGT-3′

 

حجم نهایی برای هر یک از واکنش­ها 25 میکرولیتر در نظر گرفته شد. برنامه شامل دناتوراسیون اولیه در دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 4 دقیقه و 35 سیکل که هر سیکل شامل سه مرحله دناتوراسیون در دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه، دمای annealing جهت تکثیر ژن CNF1 و Hly به ترتیب در دمای 57 و 60 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه، و مرحله extension در دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه و نهایتاً 72 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه انجام و پس از اتمام واکنش، محصول واکنش با استفاده از ژل آگارز 1 درصد و با استفاده از دستگاه مورد بررسی قرار گرفت.[j3] 
نتایج
از مجموع 82 سویه اشریشیا­کلی جمع­آوری شده از
آزمایشگاه بیمارستان آیت الله روحانی شهر بابل، 6/42 درصد و 4/57 درصد سویه­ها به ترتیب از جنس مذکر و مونث ایزوله گردید. در روش دیسک دیفیوژن آگار مقاومت به اریترومایسین (9/71 درصد) 59، جنتامایسین (2/51 درصد) 42، سیپروفلوکساسین (8/54 درصد) 45، اوفلوکساسین (4/30 درصد) 25، نیتروفورانتوئین (7/9 درصد) 8، توبرامایسین (9/32 درصد) 27، تری­متوپریم-سولفامتوکسازول (5/69 درصد) 57، لووفلوکساسین (4/13 درصد) 11 و ایمی‌پنم (0 درصد) گزارش شد. در بین ایزوله­های مورد مطالعه فراوانی سویه­های مقاوم به چند دارو 7/31 درصد درصد به دست آمد. هم­چنین فراوانی ژن­های CNF1 و Hly در روش مولکولی به ترتیب 28 درصد و 9/32 درصد  تعیین گردید. تصاویر مربوط به PCR ژن‌های CNF1 و Hly در شکل 1 و 2 آورده شده است.

شکل 1- PCR مربوط به ژن CNF1 در بین ایزوله­های اشریشیا­کلی جدا شده از بیمارستان روحانی شهرستان بابل در سال 1396
شماره 1- 100 bp DNA size marker، شماره 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8 و 9 سویه­های دارای ژن CNF1
 

شکل 2- PCR مربوط به ژن Hly در بین ایزوله­های اشریشیا­کلی جدا شده از بیمارستان روحانی شهرستان بابل در سال 1396
شماره 1: 100 bp DNA size marker، شماره 2 کنترل منفی، شماره 3، 4، 5، 6، 8 و 9 سویه­های دارای ژن Hly
 

از آن جایی­که وجود فاکتورهای متعدد در ظهور سویه‌های دارای پتانسیل بالای بیماری­زایی بسیار مشهود است، لذا ارزیابی ژنتیکی و بررسی میزان مقاومت چنین سویه­هایی از اهمیت بالایی برخوردار می‌باشد ]10[. انتشار این سویه‌ها در مراکز درمانی می‌تواند منجر به اپیدمی‌گردد ]10[، بنابراین تشخیص سریع و کنترل این موارد از مهم­ترین استراتژی­های درمانی محسوب می‌گردد. در مطالعه حاضر بیشترین میزان مقاومت به اریترومایسین و تری متوپریم-سولفامتوکسازول اختصاص یافت، در حالی ­که درصد حساسیت به نیتروفورانتوئین و ایمی­پنم قابل توجه بود، اما با این وجود شیوع سویه­های مقاوم به چند دارو زنگ خطر مهمی‌محسوب می‌شود، زیرا در مطالعات مشابه نتایج متفاوتی دیده می‌شود که ممکن است ناشی از سیاست­های درمانی مختلف، انتشار سویه­ها و یا رعایت اصول بهداشتی در مراکز مختلف درمانی باشد. در مطالعه حاضر درصد فراوانی ژن CNF1 28 درصد و فراوانی ژن Hly 9/32 درصد گزارش گردید. این در­حالی است که در مطالعه Tarchouna و همکاران در تونس میزان فراوانی ژن Hly و CNF1 به ترتیب 19 و 3 درصد اعلام شد] 11[. در مطالعه Asadi و همکاران که در شیراز صورت گرفت، فراوانی ژن Hly 3/23 درصد گزارش گردید ]12[. از طرفی Galane و همکارش در آفریقای جنوبی فراوانی ژن CNF1 را 2/2 درصد گزارش کردند ]13[. در مطالعه Farshad و همکاران فراوانی ژن Hly و CNF1 به ترتیب 5/13 درصد و 9/22 درصد ارزیابی شد ]14[.
مطالعه Marini و همکارانش نشان داد که سویه­های حاوی ژن­های CNF1 و Hly توانایی بالقوه‌ای در ایجاد عوارض سایتوتوکسیک بر روی سلول­های Hela دارند ]15[. با توجه به تحقیقات انجام شده اولین مرحله برای بیماری­زایی اتصال باکتری به دیواره سلول­های سنگفرشی مجاری ادراری می‌باشد که فیمبریه و فاکتورهای اتصالی نقش کلیدی را بر عهده دارند. همچنین ارتباط مستقیمی ‌بین پیلونفریت، عفونت­های پیچیده ادراری و حضور ژن‌های کد کننده فاکتورهای چسبندگی گزارش گردیده، لذا تشخیص سریع ایزوله­های مذکور می‌تواند در درمان این سویه­ها سهم به­سزایی داشته باشد ]15[.
تفاوت در فراوانی ژن­های بیماری­زا و هم­چنین درصد مقاومت آنتی­بیوتیکی در مطالعات مختلف ممکن است به علت تعداد سویه­های مورد مطالعه و هم­چنین پراکندگی سویه­ها در مناطق مختلف جغرافیایی باشد، لذا پیشنهاد می‌شود در مطالعات آتی تعداد سویه­های بیشتری مورد بررسی قرار گیرد.

• ‌گیری

مطالعه اخیر نشان داد فراوانی ژن­های  Hlyو CNF1 در
بین ایزوله­های اشریشیا­کلی یوروپاتوژن جدا شده از بیماران دچار عفونت ادراری به ترتیب 9/32 درصد و 28 درصد می‌باشدکه تا حدودی با مقالات مشابه هم­خوانی دارد. از طرفی ظهور سویه‌های مقاوم به چند داروی اشریشیا‌کلی بیماری­زای دستگاه ادراری نیز می‌تواند تهدیدی جدی در درمان این نوع از سویه­ها محسوب شود.
تشکر و قدردانی
این مقاله حاصل طرح دانشجویی است، لذا نویسندگان مقاله برخود لازم می­دانند که از معاونت محترم پژوهشی و هم­چنین پرسنل آزمایشگاه بیمارستان‌های آیت الله روحانی و جناب آقای باقری جهت همکاری­های انجام گرفته تشکر و قدردانی نمایند.

 
 
 
 
References
 

[1] Shabani AH, Amini A, Ebrahimzadeh Namvar A. The frequency of pap and sfa genes among Escherichia coli strains isolated from hospitalized patients of Rouhani hospital in babol, Iran. JBUMS 2018; 20(3): 64-8.
[2] Subashchandrabose S, Mobley HL. Virulence and Fitness Determinants ofUropathogenic Escherichia coli. Microbiology Spectrum 2015; 3(4): UTI-0015-2012.
[3] Lerm M, G Schmidt, Aktories K. Bacterial protein toxins targeting rho GTPases. FEMS Microbiol Lett 2000; 188(1): 1-6.
[4] Davis JM, Rasmussen SB, O'Brien AD. Cytotoxic necrotizing factor type 1 production by uropathogenic Escherichia coli modulates polymorphonuclear leukocyte function. Infect Immun 2005; 73(9): 5301-10.
[5] Smith YC, Rasmussen SB, Grande KK, Conran RM, O'Brien AD. Hemolysin of Uropathogenic Escherichia coli evokes extensive shedding of the uroepithelium and hemorrhage in bladder tissue within the first 24 hours after intraurethral inoculation of mice. Infect Immun 2008; 76(7): 2978-90.
[6] Real JM, Munro P, Buisson-Touati C, Lemichez E, P Boquet, Landraud L. Specificity of immunomodulator secretion in urinary samples in response to infection by alpha-hemolysin and CNF1 bearing uropathogenic Escherichia coli. Cytokine 2007; 37(1): 22-5.
[7] Los FC, Randis TM, Aroian RV, Ratner AJ. Role of pore-forming toxins in bacterial infectious diseases. 2013;(2):173–207.
[8] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; eighteenth informational supplement CLSI document M100-18 Wayne, 2016.
[9] Mladin C, Usein C, Chifiriuc M, Palade A, Slavu C, Negut M, Damian M. Genetic analysis of virulence and pathogenicity features of Uropathogenic Escherichia coli isolated from patietns with neurogenic bladder. Rom Biotechnol Lett 2009; 14(6): 4900-5.

1. UroPathogenic Escherichia coli (UPEC) Infections: Virulence Factors, Bladder Responses, Antibiotic, and Non-antibiotic Antimicrobial Strategies. Front Microbiol 2017; 15(8): 1566.

[11] Tarchouna M, Ferjani A, Ben-Selma W, Boukadida J. Distribution of Uropathogenic virulence genes in Escherichia coli isolated from patients with urinary tract infection. Int J Infect Dis 2013; 17(6): e450–3.
[12] Asadi I, Kargar M,Solhjoo K, Najafi A,GhorbaniDalini S. The Association of Virulence Determinants of Uropathogenic Escherichia coli with Antibiotic Resistance. Jundishapur J Microbiol 2014; 7(5): e9936.
[13] Galane P, Le Roux M. Molecular Epidemiology of Escherichia coli Isolated from Young South African Children with Diarrhoeal Diseases. J Health Popul Nutr 2001; 19(1): 31-8.
[14] Farshad S, Emamghorashi F. The Prevalence of Virulence Genes of E. coli Strains Isolated from Children with Urinary Tract Infection. Saudi J Kidney Dis Transpl 2009; 20(4): 613-7.
[15] Marini RP, Taylor NS, Liang AY, Knox KA, Peña JA, Schauer DB, Fox JG. Characterization of hemolytic Escherichia coli strains in ferrets: recognition of candidate virulence factor CNF1. J Clin Microbiol 2004; 42(12): 5904-8.

 

---

---