مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

مقاله پژوهشی
مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان
دوره 18، آذر 1398، 888-875
 
اثر همزمان تمرینات ورزشی تناوبی شدید و داربست بدون سلول غشاء مایع آمنیوتیک بر بیان ژنی عوامل تکثیر سلول­های ماهواره­ای در آسیب از بین رفتن حجیم عضلانی عضله ساقی قدامی‌در موش صحرایی: یک مطالعه تجربی
محمدرضا ایزدی^[1]،  عبدالحمید حبیبی^[2]،  زهرا خدابنده^[3]، مسعود نیکبخت^[4]
 
دریافت مقاله: 26/1/98   ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 21/2/98    دریافت اصلاحیه از نویسنده: 4/4/98           پذیرش مقاله: 11/4/98
 
زمینه و هدف: هدف از پژوهش حاضر تعیین اثر همزمان تمرین تناوبی شدید و استفاده از داربست دسلولار شده غشاء آمنیوتیک بر روی تغییرات بیان ژنی شاخص­های تکثیر و فعالیت سلول­های ماهواره­ای در آسیب از دست رفتن حجیم عضلانی بر روی عضله تیبیالیس قدامی‌موش صحرایی بود.
مواد و روش‌ها: در مطالعه تجربی حاضر، پس از تهیه و آماده سازی غشاء آمنیوتیک انسانی و دسلولاریزه کردن آن، آسیب Volumetric muscle loss) VML) بر روی عضله تیبیالیس قدامی 24 سر موش صحرایی انجام شد. موش­های صحرایی بر اساس دریافت و عدم دریافت داربست غشاء آمنیوتیک به دو گروه 12 تایی تقسیم شدند. سپس هر کدام از گروه­ها به گروه تمرین تناوبی شدید و بدون تمرین تقسیم شدند .برای بررسی بیان سه ژن PAX7، MyoD1 و Myogenin از تکنیک Real-time PCR استفاده شد.

• در بیان ژن PAX7 در گروه تمرین تناوبی شدید با داربست به ترتیب در مقایسه با گروه تمرین بدون داربست (004/0P=) و دو گروه دیگر (001/0P<) تفاوت معنی داری وجود داشت. در بیان ژنMyoD1، گروه تمرین تناوبی شدید به ترتیب با گروه­ بدون تمرین همراه با داربست (050/0P=) و دو گروه بدون داربست (001/0P<) تفاوت معنی دار داشت. در بیان ژنMyogenin  گروه تمرین تناوبی شدید به ترتیب با گروه­ بدون تمرین همراه با داربست (031/0P=) و دو گروه بدون داربست (001/0P<) تفاوت معنی دار داشت.

نتیجه‌گیری: نتایج نشان داد ترکیب تمرین تناوبی شدید و قراردادن داربست دسلولار شده غشاء آمنیوتیک، بیان ژن­های PAX7، MyoD1 و Myogenin را بیش‌تر می‌کند و احتمالاً در بازسازی آسیب و زخم‌های حجیم عضلانی بتواند مؤثر باشد.
واژه­های کلیدی: تمرین تناوبی شدید، سلول‌های ماهواره ای، مهندسی بافت، موش صحرایی

 

مقدمه
آسیب از بین رفتن حجیم عضلانی  (Volumetric muscle loss; VML)به از دست دادن حجم بزرگی از عضله اسکلتی اطلاق می­شود که در شرایط تروما، جراحی، نقص‌های مادرزادی و در جنگ­های گرم ایجاد می‌شود [1]. علی­رغم قدرت بازسازی خود به خودی بافت عضلانی، در آسیب VML به علت حجم زیاد میوفیبریل‌های از بین رفته، بازسازی به مقدار اندک و ناکافی انجام خواهد شد. از روش­های رایج درمان این آسیب، می­توان به استفاده از فلپ­های فاشیای پوست و عضله، پیوند عضلانی اشاره کرد [2]. اما استفاده از این روش­ها معایبی از جمله پاسخ­های خود ایمنی بدن و عفونت­ها را در پی دارد. بنابراین استفاده از روش نوین مهندسی بافت با استفاده از داربست­های بیولوژیک (Biologic scaffold) می‌تواند جایگزین بسیار مناسبی باشد که محدودیت‌ها و معایب روش­های رایج را نداشته باشد [3].
سلول­های ماهواره­ای (Satellite cells) سلول­های بنیادی ساکن عضله اسکلتی هستند که قابلیت خود ترمیمی ‌و تمایز را  دارند [4]. این سلول­ها که در سطح میوفایبرها در زیر غشاء پایه قرار دارند، در رشد عضلات بعد از تولد دخالت دارند و مسئولیت ترمیم عضلات را بعد از آسیب­های عضلانی برعهده دارند. این سلول­ها برای تولید میوبلاست‌ها فعال می‌شود و با تکثیر و تمایز، هسته­های عضلانی جدید را به ­وجود می­آورد [5].
پس از فعال سازی سلول‌های ماهواره­ای، عواملی از حلقه رونویسی مانند  myf-5،PAX7 وMyoD1 منجر به شرکت این عوامل در مراحل تکامل سلول عضله می­شوند. ابتدا PAX7 وMyoD1 در سلول­های پیش ساز عضله فعال می­شوند که بیان هم­زمان این دو عامل به عنوان شاخص فعال شدن سلول‌های ماهواره­ای شناخته می­شود. سپس Myogenin در سلول­های تمایز یافته تولید می­شود [7-6].
غشاء آمنیوتیک داخلی­ترین لایه جفت است که با قوام و استحکام قابل ملاحظه­ای از پروتئین­های ساختاری متنوعی ساخته شده است و از آن به عنوان پوشش بیولوژیک برای انواع زخم­های سطحی سوختگی و سایر موارد استفاده می‌شود دارای حداقل آنتی ژنیسیته است که موجب کاهش احتمال عفونت و افزایش سرعت ترمیم زخم می­شود [9-8]. هم­چنین بیان شده است غشاء آمنیوتیک بستری است که سلول­ها به خوبی بر روی آن قرار می­گیرند و این بستر می‌تواند محیطی را فراهم ­کند که میزان آنژیوژنز و تراکم مویرگی بافت داربست شده را افزایش دهد که به نوبه خود سبب خون رسانی به بافت جدید، پیش­گیری از فیبروزیس و بهبود ترمیم بافت می­گردد [12-10].
بیش­تر مطالعاتی که تأثیر تمرینات ورزشی را بر سلول‌های ماهواره‌ای بررسی کرده­اند که افزایش تعداد سلول­های ماهواره­ای را در عضلات آسیب دیده بعد از انواع تمرینات ورزشی گزارش کرده­اند. محققان تمرینات استقامتی و مقاومتی را به عنوان یک راه کار مناسب در بهبود آسیب‌های عضلانی و عملکرد آن­ها معرفی کرده‌اند [13]. تمرین تناوبی شدید (High-intensity interval training; HIIT) مدل تمرینی خاصی است که شامل تناوب­های فعالیت ورزشی با شدت زیاد و تناوب­های استراحتی فعال با شدت کم باشد. گزارش شده است دوره‌های طولانی مدت HIIT سنتز پروتئین­های عضلانی را افزایش می­دهد و نیز با تحریک عوامل رشد، رشد عضلات را تحت تأثیر قرار می­دهد [14].
پژوهش­های کم­تری به بررسی تمرینات تناوبی شدید پرداخته اند و از اثرات این نوع تمرین به نسبت سایر تمرینات ورزشی بر بهبود شمار و فعال شدن سلول­های ماهواره­ای در آسیب­های عضلانی پرداخته‌اند [15]، اما هنوز سازوکار اثر این نوع تمرین در بهبود تولید پروتئین و ‌هایپرتروفی مشخص نشده است [14]. بررسی­ها معمولاً در آسیب­هایی با درجه تخریب کم­تر بافت عضله بوده است و کم­تر پژوهشی به بررسی روند تکثیر و تمایز سلول­های ماهواره­ای در آسیب VML پرداخته است [16].
اما آیا غشاء امنیوتیک می‌تواند به تنهایی یا با ترکیب مداخله ورزشی تمرین HIIT بر روند تکثیر و تمایز سلول‌های ماهواره ای تأثیر داشته باشد؟. مفروض است تمرینات HIIT با داربست دسلولار شده غشاء آمنیوتیک (Decellularized amniotic membrane) بر روی زخم عمیق آسیب VMLمیزان بیان ژنی فاکتورهای پیش ساز سلول‌های ماهواره ای را در آسیب افزایش می­دهد. لذا مطالعه حاضر با هدف تعیین اثر هم­زمان تمرینات HIIT و استفاده از داربست دسلولار شده غشاء آمنیوتیک بر روی تغییرات بیان ژنی شاخص­های تکثیر و فعالیت سلول­های ماهواره­ای در آسیب VML بر روی عضله Tibialis anterior (TA) موش صحرایی انجام شد.
مواد و روش­ها
مطالعه حاضر از نوع تجربی است که در سال 1397 در دانشگاه شهید چمران اهواز انجام پذیرفت. جهت انجام این پژوهش تعداد 24 سر موش صحرایی نر با وزن 225 تا 250 گرم از مرکز تکثیر حیوانات آزمایشگاهی دانشکده دام­پزشکی دانشگاه شهید چمران اهواز تهیه شد و نگه­داری آن­ها در دمای 22 تا 24 درجه سانتی گراد، رطوبت 50 تا 60 درصد و سیکل روشنایی _– تاریکی12:12 در قفس‌های مخصوص با دسترسی آزادانه به آب و غذای استاندارد در همان آزمایشگاه انجام شد. در پژوهش حاضر کلیه اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی طبق مصوبه اخلاق در پژوهش دانشگاه شهید چمران اهواز رعایت و اجرا شد. هم­چنین این مطالعه دارای کد اخلاق از دانشگاه شهید چمران اهواز به شماره ثبتی EE/97.24.370024/scu.ac.ir می­یاشد.
آسیب VML از طریق جراحی در عضله Tibialis anterior (TA) همه 24 موش صحرایی ایجاد شد. موش­های صحرایی بر اساس دریافت داربست غشاء آمنیوتیک به دو گروه بدون داربست (گروه کنترل منفی) (12n=) و با داربست (12n=) تقسیم شدند. در گروه کنترل منفی، بعد از ایجاد VML فاشیا و پوست اطراف زخم بدون انجام هیچ مورد خاصی بخیه زده شد و زخم بسته شد. اما در گروه داربست دسلولار شده غشاء آمنیوتیک انسانی (Decellularized human amniotic membrane; dHAM) بعد از قرار گرفتن دولایه غشاء دسلولار شده بر روی زخم، فاشیا و پوست اطراف زخم بخیه و  بسته می­شود. بعد از گذشت دو هفته از جراحی و ریکاوری، موش‌های صحرایی هر گروه به دو گروه بدون تمرین و گروه HIIT تقسیم شدند (در مجموع چهار گروه شش تایی). سپس گروه تمرین به مدت هشت هفته به تمرین بر روی تردمیل پرداخت. در نهایت موش­های صحرایی برای بافت برداری و بقیه مراحل ابتدا با بی­هوشی عمومی ‌و سپس با استفاده از محفظه ایزوله CO₂ کشته شدند [17].
غشاء آمنیوتیک انسانی که پس از عمل جراحی سزارین از مادران سالم گرفته و به بیمارستان سوانح و سوختگی حضرت امیرالمومنین (ع) شیراز منتقل شده بود، تهیه شد و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد غشاء به آزمایشگاه منقل شد. جهت زدودن خون و سایر مواد چسبیده به غشا، بافت سه بار با محلول PBS (Buffered phosphate saline) شستشو داده شد. سپس غشاء سلول دار در محلول 75 درصد الکل و آب قرار گرفت و با PBS حاوی penicillin-streptomycin به مدت 24 ساعت (با تعویض هر 12 ساعت یک­ بار) جهت استریله شدن قرار داده شد. غشاء سلول دار جهت فرآیند سلول زدایی در محلول 1 درصد Triton X-100 به مدت 14 ساعت، در محلول lipase PBS به مدت 10 ساعت و در DNAase PBS به مدت 3 ساعت نگه­داری شد. در نهایت غشاء سلول زدایی شده به قطعات 2 ×2 سانتی متر برش داده شد و در 4 درجه سانتی‌گراد نگه­داری شد [18].
جهت تشخیص بدون سلول شدن داربست غشاء آمنیوتیک از رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) استفاده شد. به این صورت که پس از سلول زدایی، هسته­های سلول در رنگ‌آمیزی دیده نشد. نمونه­های برداشت شده توسط فرمالین 10 درصد به مدت 24 ساعت تثبیت و بلوک‌های پارافینی تهیه شد. پس از برش توسط میکروتوم، نمونه‌ها توسط هماتوکسیلین برای رنگ‌آمیزی هسته‌ها و بعد از شستشو با ائوزین رنگ‌آمیزی شدند و در انتها به­وسیله میکروسکوپ نوری Nikon E-200 microscope (Nikon, Tokyo, Japan) بررسی شدند.
جهت سنجش ژن­های مورد پژوهش و استخراج RNA از بافت و سنتز cDNA 24 ساعت بعد از آخرین جلسه تمرین، موش‌ها به وسیله تزریق درون صفاقی کتامین (90 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن) و زایلازین (10 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن) بی­هوش شدند. سپس بافت عضله TA با غشاء آمنیوتیک برش عرضی زده شد و بلافاصله در نیتروژن 20- منجمد و برای  سنجش بیان ژنی در فریزر 80- درجه سانتی­گراد نگه­داری شد. جهت سنجش بیان ژن از روش Real-time PCR استفاده شد.
ابتدا cDNA (Qiagen, Hilden, Germany) سنتز شده برای ژن­های مورد پژوهش با 40 میکرو لیتر RNase & DNase -free water رقیق شد. 5/1 میکرولیتر از هر یک از رقت‌ها به همراه 5/7 میکرولیتر Master Mix‌ (Tli RNaseH Plus, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) و یک میکرولیتر از پرایمرها Forward و یک میکرولیتر از پرایمر Backward در چهار میکرولیتر آب فاقد نوکلئاز (Nuclease –free Water) برای رسیدن به حجم نهایی 15میکرولیتر به خوبی حل و مخلوط شد. تمام واکنش‌ها به شکل دوتایی (دابلیکیت) انجام شد. درنهایت میکروتیوپ‌ها در محل مخصوص خود در دستگاه قرار داده شد و واکنش‌های تکثیر در طی 40 سیکل بر اساس دستورالعمل سازنده کیت انجام شد. واکنش تکثیر هر یک از ژن‌های مورد نظر در مطالعه نیز، همان­طورکه در بالا ذکر گردید انجام شد با این اختلاف که واکنش تکثیر فقط برای یک رقت از نمونه (رقت بهینه) الگو انجام شد. جهت بررسی تغییرات بیان ژن، ژن­های مورد نظر نیز واکنش qRT-PCR به همان ترتیب که گفته شد انجام شد. برای کنترل داخلی از ژن GAPDH‌ استفاده شد و جهت کنترل کیفی محصول واکنش GAPDH مربوط به نمونه بر روی ژل دو درصد انتقال داده شد و از نظر وجود و یا عدم وجود محصول بررسی شد. توالی پرایمرها در جدول 1 نشان داده شده است [19].

 
جدول 1- توالی پرایمری ژن­های مورد مطالعه حاضر

اندازه (bp)	توالی پرایمر  (5′ → 3′)		ژن
291	GGTGTGAGGGTTAGTAGAAAGA	Forward	Pax7
	AAAAAATTCAAACAAACAAACACT	Reserve

 

309	TAGGAATTGGGATATGGAGTTTT	Forward	MyoD1
	TTACAAACCCACAACAAACAAC	Reserve

 

164	CTACCTTCCTGTCCACCTTC	Forward	Myogenin
	CTCCAGTGCATTGCCCCACT	Reserve

 

109	GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA	Forward	GAPDH
	TTGAGGTCAATGAAGGGGTC	Reserve

 

پس از آشناسازی موش­های صحرایی به مدت 1 هفته با تردمیل (Danesh Salar Iranian model, Tehran Iran) با سرعت 5 متر در دقیقه، به مدت 5 دقیقه در 5 جلسه، آزمون ظرفیت ورزشی در موش­های صحرایی، دو روز قبل از شروع برنامه تمرینی و انتهای هر هفته انجام شد. موش­های صحرایی ابتدا به مدت 10 دقیقه با شدت 10 متر در دقیقه مرحله گرم کردن را انجام دادند. سپس آزمون فزآینده ورزشی آغاز شد و هر دو دقیقه سرعت تردمیل 03/0 متر در ثانیه به طور خودکار افزایش یافت تا زمانی که موش­های صحرایی قادر به ادامه فعالیت ورزشی نبودند. با توجه به نمودار سرعت دویدن و اکسیژن مصرفی در مطالعه Høydal و همکاران، حداکثر اکسیژن مصرفی هر موش محاسبه شد. فاصله دویده شده توسط هر موش­ صحرایی نیز به عنوان شاخص ظرفیت ورزشی در نظر گرفته شد و نهایتاً شدت تمرین در هر هفته، 02/0 متر در ثانیه افزایش یافت [20]. پروتکل تمرینی شامل هشت هفته تمرین تناوبی شدید بـود. برنامه تمرینی روی تردمیل طراحی شده ویژه حیوانات پنج روز در هفته بود که جزئیات آن در جدول 2 ارائه شده است [21].

 

 
جدول 2- برنامه هشت هفته­ای تمرین تناوبی شدید در موش­های صحرایی

	گرم کردن	تناوب شدید	تناوب کم شدت	سرد کردن
زمان تمرین (دقیقه)	5 دقیقه	4 دقیقه	2 دقیقه	5 دقیقه
شدت تمرین (درصد VO2max)	50 تا 60 درصد	85 تا 90 درصد	50 تا 60 درصد	40 تا 50 درصد

 

داده­ها با استفاده از نرم‌افزار آماری SPSS نسخه 24 محاسبه و تحلیل شد. برای تشخیص طبیعی بودن توزیع داده‌ها از آزمون  Kolmogorov-Smirnovو برای تعیین تجانس واریانس­ها از آزمون levene استفاده شد. کمی‌سازی بیان ژن‌های مورد نظر توسط فرمول^∆∆ct- 2 و مقادیر تغییرات چند برابری محاسبه شد. داده‌ها با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون تعقیبی Tukey تجزیه و تحلیل شدند. داده­ها به­ صورت انحراف استاندارد ± میانگین گزارش شدند. سطح معنی­داری در آزمون­ها  05/0 در نظر گرفته شد. همه نمودارها با استفاده از نرم ‌افزار  Graph pad prismنسخه 8 رسم شد.
نتایج
رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین از غشاء آمنیوتیک با سلول و دسلولار شده که در شکل قابل ملاحظه است، نشان می­دهد فرآیند سلول­زدایی با موفقیت انجام شده است.

 
B A
شکل 1- رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین از غشاء آمنیوتیک با سلول (A) و دسلولار شده  .(B)
 

در بیان ژن PAX7 در گروه تمرین تناوبی شدید با داربست به ترتیب در مقایسه با گروه تمرین بدون داربست (004/0P=) و دو گروه دیگر (001/0P<) تفاوت معنی­دار
مشاهده شد. در مقایسه گروه­های بدون داربست نیز شاهد تفاوت معنی­دار در گروه تمرین تناوبی شدید با گروه بدون تمرین مشاهده شد (022/0P=).

شکل 2- میزان تغییرات mRNA ژن PAX7 در گروه­های بدون داربست و با داربست با مداخله پروتکل تمرین تناوبی شدید و بدون برنامه تمرینی. روش آماری: آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون تعقیبی Tukey. نمودار به صورت انحراف معیار ± میانگین رسم شده است.
*P > 05/0, **P<01/0, ***P <001/0
در بیان ژنMyoD1  گروه تمرین تناوبی شدید به ترتیب با گروه­ بدون تمرین همراه با داربست (050/0P=) و دو گروه بدون داربست (001/0P<) تفاوت معنی­دار داشت. همچنین گروه بی تمرین با داربست به ترتیب با گروه تمرین بدون داربست (004/0P=) و گروه بی تمرین بدون داربست (001/0P<) تفاوت معنی­دار داشت.

شکل 3- میزان تغییرات mRNA ژن MyoD1 در گروه­های بدون داربست و با داربست با مداخله پروتکل تمرین تناوبی شدید و بدون برنامه تمرینی. روش آماری: آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون تعقیبی Tukey. نمودار به صورت انحراف معیار ± میانگین رسم شده است.
*P > 05/0, **P<01/0, ***P <001/0
در بیان ژنMyogenin  گروه تمرین تناوبی شدید به ترتیب با گروه­ بدون تمرین همراه با داربست (031/0P=) و دو گروه بدون داربست (001/0P<) تفاوت معنی­دار داشت. هم‌چنین گروه بی تمرین با داربست به ترتیب با گروه تمرین بدون داربست (001/0P<) و گروه بی تمرین بدون داربست (002/0P=) تفاوت معنی­دار داشت.

شکل 4- میزان تغییرات mRNA ژن Myogenin  درگروه­های بدون داربست و با داربست با مداخله پروتکل تمرین تناوبی شدید و بدون برنامه تمرینی. روش آماری: آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون تعقیبی Tukey. نمودار به صورت انحراف معیار ± میانگین رسم شده است.
*P > 05/0, **P<01/0, ***P <001/0
بحث
مطالعه حاضر به مطالعه اثر هم­زمان تمرینات ورزشی تناوبی شدید و داربست دسلولار شده غشاء آمنیوتیک بر میزان فعالیت و تکثیر سلول­های ماهواره­ای در آسیب VML عضله ساقی قدامی‌موش­های صحرایی پرداخت. یافته­های پژوهش نشان داد بیان ژنی مارکرهای بیان کننده تکثیر و فعالیت سلول‌های ماهواره­ای هم متأثر از فعالیت ورزشی تناوبی شدید و هم متأثر از داربست غشاء آمنیوتیک می‌باشد. ضمن این­که ترکیب تمرین HIIT و داربست بهترین عملکرد را در بیان ژنی هر سه شاخص نشان داد. درMyoD1 و  Myogenin به عنوان شاخص بلوغ و فعالیت سلول­های ماهواره­ای شاهد بیان ژنی معنی‌دار در گروه­های بدون تمرین با داربست غشاء آمنیوتیک با سایر گروه­های بدون داربست بودیم که به نوبه خود به تأثیر داربست بیولوژیک غشاء آمنیوتیک در زایش و تکثیر سلول‌های ماهواره­ای اشاره دارد. در PAX7 به عنوان ابتدایی‌ترین شاخص حضور و زایش سلول­های ماهواره­ای در بافت­های آسیب دیده، شاهد اثر بخشی جداگانه تمرین تناوبی شدید نسبت به گروه بی‌تمرین بودیم که هم­راستا با مطالعات پیشینی است که این نوع برنامه تمرینی را در بهبود رشد و زایش سلول­های ماهواره­ای موًثر دانسته­اند.
غشاء آمنیوتیک با ساختار کلاژنی، اینتگرینی و لامیلاری خود در زمانی که دسلولار یا آسلولار می‌شود شرایط مناسبی برای جای­گذاری یا Seeding سلول‌ها ایجاد می­کند و سلول­ها زمانی که رو یا درون این ساختار لانه گزینی می­کنند، بهتر می‌توانند تغذیه شوند و رشد کنند [23-22]. از طرف دیگر گزارش شده است در زیر یا درون غشاء آمنیوتیک دسلولار شده شبکه‌های مویرگی متراکم بیش­تری شکل می‌گیرند که به نوبه خود خون رسانی را به موضع آسیب دیده بیش‌تر می‌کنند و موجب افزایش رشد و فعالیت بیش‌تر سلول­های بنیادی و در نتیجه ترمیم بافت آسیب دیده می‌شود [25-24].
علاوه بر عوامل رشدی و ایمنی که هنگام آسیب از عضلات آسیب دیده آزاد می­شود و موجب فعال‌سازی سلول‌های ماهواره‌ای می­گردد، گزارش شده است تمرینات HIIT با سازوکاری ویژه موجب افزایش سطوح نیتریک اکساید [26] و در پی آن سبب فعال شدن فاکتور رشد کبدی (Hepatogenic growth factor; HGF) می‌شود که یکی از عوامل اصلی شروع کننده مسیر سیگنالی فعال شدن سلول­های ماهواره ای است [28-27].
همان گونه که قبلأ بیان شد تمرینات HIIT با برخورداری از خاصیت تولید پروتئین و افزایش نسبت DNA به حجم سیتوپلاسم موجب افزایش تعداد سلول­های ماهواره­ای می‌شوند [15] که این شاخصه در مطالعه حاضر با PAX7 نشان داده شده است. هم­چنین سلول­های ماهواره­ای به وسیله عوامل خارجی مانند انواع فاکتورهای رشدی و ایمنی تنظیم می‌شوند که در این میانPugh  و همکاران افزایش سطوح mRNA فاکتور رشدی PGC1-α را در ترکیب تمرینات HIIT و مقاومتی گزارش کردند [29]. Biglari و همکاران نیز کاهش بیان ژنی میوستاتین (به عنوان یک شاخص ایمنی مؤثر در فعال شدن سلول­های ماهواره­ای) موش­های صحرایی با هشت هفته تمرین HIIT را گزارش کردند [14]. از دیگر مکانیسم اثرهای تمرینات HIIT، تحریک آنژیوژنز در بافت­های آسیب دیده عضلانی می­باشد. که این امر سبب رشد بیش‌تر سلول‌های ماهواره­ای و ترمیم بیش‌تر بافت آسیب دیده می‌شود [31-30].
علی رغم مطالعات اندک در زمینه اثرات هم­زمان تمرینات ورزشی و داربست­ها بر روند ترمیم عضلانی و تکثیر سلول‌های بنیادی، Quarta و همکاران با تداخل یک برنامه 4 هفته ای تمرینات اختیاری چرخ دوار در آسیب VML در موش، در بخشی از روش­ مطالعه­اشان مقادیر پروتئین‌های PAX7 و MyoD را در سلول‌های بنیادی عضله اسکلتی انسان که برای تولید داربست کشت داده بودند در فلوسایتومتری مورد بررسی قرار دادند. این دو پروتئین در ایمونوسایتوشیمی‌نیز ملاحظه شد و نشان داد داربست به سمت تولید عضله پیش رفته است. بنابراین سنتز این دو پروتئین با افزایش بیان ژنی در نتایج مطالعه حاضر همسو است. البته تفاوت عمده این مطالعه با مطالعه حاضر در نوع داربست و نحوه تمرین بود [3]. گزارش‌های دیگری نیز از فعال شدن عوامل فعال کننده سلول‌های ماهواره‌ای در غیاب داربست و با انجام تمرینات HIIT در گروه‌های حیوانی وجود دارد که نشان دهنده نقش تمرینات HIIT و سازو کارهای آن در فعال کردن سلول­های ماهواره­ای و عوامل پیش ساز این سلول­ها می‌باشد [31-30].
از محدودیت­های مطالعه حاضر می‌توان به عدم دسترسی به نمونه‌های انسانی نام برد. از دیگر محدودیت­های پژوهش حاضر عدم استفاده از روش وسترن بلات برای اطمینان از سنتز پروتئین ژن‌های مورد مطالعه بود که علت عدم بررسی، کمبود بودجه پژوهش بوده است. عدم بررسی روش‌های رنگ‌آمیزی سطح مقطع عرض بافت (Cross sectional area; CSA) و بررسی آنژیوژنز نیز از دیگر محدودیت­های مطالعه حاضر بوده است. پیشنهاد می­شود در مطالعات آینده از نمونه‌های انسانی با جراحی­های ارتوپدی و یا با آسیب­های عمقی در محیط بالینی داربست غشاء آمنیوتیک با استفاده از سلول‌های بنیادی تمایز یافته به عضله کشت داده شود و روند ترمیم با ابزارها و روش­های نوین بررسی شود.
نتیجه‌گیری
بر اساس نتایج مطالعه حاضر، ترکیب تمرین HIIT و قراردادن یک لایه داربست دسلولار شده غشاء آمنیوتیک، بیان ژنی شاخص‌های تکثیر و فعالیت سلول‌های ماهواره‌ای را بیش‌تر می‌کند و احتمالاً در بازسازی بیش‌تر آسیب و زخم‌های عمیق عضلانی بتواند مؤثر باشد. خود غشاء آمنیوتیک نیز به تنهایی با ویژگی‌های منحصر به فرد خود شرایط مناسب‌تری را برای رشد و تغذیه سلول‌های ماهواره ای ایجاد می­کند. هر چند لازم است مطالعات بیش‌تری در شرایط بالینی و با ترکیب سلول‌های بنیادی تمایز یافته با ابزارهای دقیق‌تری انجام پذیرد.
تشکر و قدردانی
مطالعه حاضر برگرفته از رساله دکتری نویسنده مسئول می‌باشد. از اعضای محترم هیئت علمی‌دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهید چمران اهواز، آقایان دکتر نداف و دکتر تابنده که در جراحی و نگه‌داری بافت حیوانات ما را یاری نمودند کمال تشکر و قدردانی به عمل می­آید.

 

 
References
 

[1] Wu X, Corona BT, Chen X, Walters TJ. A standardized rat model of volumetric muscle loss injury for the development of tissue engineering therapies. Bioresearch Open Access 2012;1(6):280-90.
[2] Kesireddy V. Evaluation of adipose-derived stem cells for tissue-engineered muscle repair construct-mediated repair of a murine model of volumetric muscle loss injury. International Journal of Nanomedicine 2016;8(11):1461.
[3] Quarta M, Cromie M, Chacon R, Blonigan J, Garcia V, Akimenko I et al. Bioengineered constructs combined with exercise enhance stem cell-mediated treatment of volumetric muscle loss. Nature Communications 2017; 20(8):15613.
[4] Morgan JE, Zammit PS. Direct effects of the pathogenic mutation on satellite cell function in muscular dystrophy. Experimental Cell Research 2010;316(18):3100-8.
[5] Neal A, Boldrin L, Morgan JE. The satellite cell in male and female, developing and adult mouse muscle: distinct stem cells for growth and regeneration. PloS One 2012;7(5):e37950.
[6] Wen Y, Bi P, Liu W, Asakura A, Keller C, Kuang S. Constitutive Notch activation upregulates Pax7 and promotes the self-renewal of skeletal muscle satellite cells. Molecular And Cellular Biology 2012;32(12):2300-11.
[7] Bentzinger CF, Wang YX, Rudnicki MA. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology 2012;4(2):a008342.
[8] Fatemi MJ, Khajerahimi AA, Nikoumaram B, Sakhaei M, Mostafavi S, Atashi A et al. Amniotic membrane seeded with mesenchymal adipose-derived stem cell for coverage of wound in third degree burn: An experimental study. Tehran University Medical Journal TUMS Publications 2014;72(6):367-78.
[9] Delo DM, De Coppi P, Bartsch Jr G, Atala A. Amniotic fluid and placental stem cells.Methods in Enzymology Elsevier 2006. p. 426-38.
[10] Fouad H, Sabry D, Elsetohy K, Fathy N. Therapeutic efficacy of amniotic membrane stem cells and adipose tissue stem cells in rats with chemically induced ovarian failure. Journal of Advanced Research 2016;7(2):233-41.
[11] Gholipourmalekabadi M, Sameni M, Radenkovic D, Mozafari M, Mossahebi‐Mohammadi M, Seifalian A. Decellularized human amniotic membrane: how viable is it as a delivery system for human adipose tissue‐derived stromal cells? Cell Proliferation 2016;49(1):115-21.
[12] Song M, Wang W, Ye Q, Bu S, Shen Z, Zhu Y. The repairing of full-thickness skin deficiency and its biological mechanism using decellularized human amniotic membrane as the wound dressing. Materials Science and Engineering: C 2017;77:739-47.
[13] Bazgir B, Fathi R, Valojerdi MR, Mozdziak P, Asgari A. Satellite cells contribution to exercise mediated muscle hypertrophy and repair. Cell Journal (Yakhteh) 2017;18(4):473.
[14] Biglari S, Gaeini AA, Kordi MR, GhardashiAfousi A. The Effect of 8 Weeks High-intensity Interval Training on Myostatin and Follistatin Gene Expression in Gastrocnemius Muscle of the Rats. Journal of Arak University of Medical Sciences 2018;21(1):1-10.
[15] Behzad B, Asgari A. The Interactive Role Of Exercise And Satellite Cells In Skeletal Muscle Regeneration And Hypertrophy 2015. 27(2):1-10.
[16] Sicari BM, Rubin JP, Dearth CL, Wolf MT, Ambrosio F, Boninger M et al. An acellular biologic scaffold promotes skeletal muscle formation in mice and humans with volumetric muscle loss. Science translational medicine. 2014;6(234):234ra58-ra58.
[17] Boivin GP, Hickman DL, Creamer-Hente MA, Pritchett-Corning KR, Bratcher NA. Review of CO2 as a euthanasia agent for laboratory rats and mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science 2017;56(5):491-9.
[18] Shi P, Gao M, Shen Q, Hou L, Zhu Y, Wang J. Biocompatible surgical meshes based on decellularized human amniotic membrane. Materials Science and Engineering: C2015;54:112-9.
[19] Sugden D, de Winter P. Quantification of mRNA using real time RT-PCR. Molecular Biomethods Handbook. Springer 2008. p. 149-68.
[20] Høydal MA, Wisløff U, Kemi OJ, Ellingsen Ø. Running speed and maximal oxygen uptake in rats and mice: practical implications for exercise training. European Journal of Cardiovascular Prevention & Rehabilitation 2007;14(6):753-60.
[21] Kraljevic J, Marinovic J, Pravdic D, Zubin P, Dujic Z, Wisloff U et al. Aerobic interval training attenuates remodelling and mitochondrial dysfunction in the post-infarction failing rat heart. Cardiovascular Research 2013;99(1):55-64.
[22] Kehe K, Abend M, Ridi R, Peter RU, van Beuningen D. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Archives of Dermatological Research 1999;291(11):600-5.
[23] Lineen E, Namias N. Biologic dressing in burns. Journal of Craniofacial Surgery 2008;19(4):923-8.
[24] Machingal MA, Corona BT, Walters TJ, Kesireddy V, Koval CN, Dannahower A et al. A tissue-engineered muscle repair construct for functional restoration of an irrecoverable muscle injury in a murine model. Tissue Engineering Part A2011;17(17-18):2291-303.
[25] Turner NJ, Badylak SF. Regeneration of skeletal muscle. Cell and Tissue Research 2012;347(3):759-74.
[26] Fallahi A, Gaeini A, Shekarfroush S, Khoshbaten A. Cardioprotective effect of high intensity interval training and nitric oxide metabolites (NO2−, NO3−). Iranian Journal of Public Health2015;44(9):1270.
[27] Wozniak AC, Pilipowicz O, Yablonka-Reuveni Z, Greenway S, Craven S, Scott E et al. C-Met expression and mechanical activation of satellite cells on cultured muscle fibers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry 2003;51(11):1437-45.
[28] Tatsumi R, Hattori A, Ikeuchi Y, Anderson JE, Allen RE. Release of hepatocyte growth factor from mechanically stretched skeletal muscle satellite cells and role of pH and nitric oxide. Molecular Biology of The Cell 2002;13(8):2909-18.
[29] Pugh JK, Faulkner SH, Turner MC, Nimmo MA. Satellite cell response to concurrent resistance exercise and high-intensity interval training in sedentary, overweight/obese, middle-aged individuals. European Journal of Applied Physiology 2018;118(2):225-38.
[30] Cocks M, Wagenmakers AJ. The effect of different training modes on skeletal muscle microvascular density and endothelial enzymes controlling NO availability. The Journal of Physiology 2016;594(8):2245-57.
[31] Hoier B, Passos M, Bangsbo J, Hellsten Y. Intense intermittent exercise provides weak stimulus for vascular endothelial growth factor secretion and capillary growth in skeletal muscle. Experimental Physiology 2013;98(2):585-97.
 

 

---

---