مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

گزارش کوتاه

مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

دوره 13، دی 1393، 1018-1013

کاربرد میکرو ذرات چیتوزان – تکنسیوم-99 در تصویربرداری ریه موش: یک گزارش کوتاه

سمیرا رسانه[1]، فریبا جوهری دها[2]

دریافت مقاله: 5/5/93        ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 1/6/93      دریافت اصلاحیه از نویسنده: 21/6/93      پذیرش مقاله: 14/7/93

چکیده

زمینه و هدف: اسکن پرفیوژن ریه، در پزشکی هسته‌ای به کمک آلبومین ماکروآگرگیته-^mTc⁹⁹ که ذراتی نشاندار است انجام می‌شود. مشکلات و سختی‌هایی حین ساخت این ذرات وجود دارد که برای رفع این معضل، از میکروذرات چیتوزان به عنوان جایگزین استفاده شد و بعد از خالص سازی با تکنسیوم نشاندار گردید.

مواد و روش‌ها: تست‌های کنترل کیفی اعم از تعیین اندازه ذرات، درصد نشاندارسازی، پایداری در بافر سالین و تصویربرداری با سیستم پزشکی هسته‌ای در بدن موش انجام شد.

یافته‌ها: اندازه ذرات 90-110 میکرون، درصد نشاندارسازی 3±94%، پایداری بالا در بافر سالین و تجمع بسیار خوب در ریه‌های موش مشاهده شد.

نتیجه‌گیری: نتایج نشان داد که میکروذرات چیتوزان-تکنسیوم99 احتمالا میتواند یک کاندیدای امیدوارکننده برای کاربرد تشخیصی در اسکن پرفیوژن ریه بکار گرفته شود که نیاز به مطالعات بیشتری دارد.

واژه‌های کلیدی: چیتوزان، اسکن پرفیوژن ریه، آلبومین ماکروآگرگیته-^mTc⁹⁹، تکنسیوم

مقدمه

در پزشکی هسته‌ای اسکن پرفیوژن ریه به کمک ذرات نشاندار انجام می‌شود. اساس جذب این ذرات در مویرگ‌های ریه بر اساس اندازه آنها است. مویرگ‌های ریه قطری در حدود 8-25 میکرون دارند و ذرات بزرگتر در این مویرگ‌ها گیر کرده و هر گرفتگی و یا مشکل دیگری در خون‌رسانی را نشان می‌دهند. در حال حاضر برای
تصویربرداری پرفیوژن ریه از آلبومین ماکروآگرگیته-^mTc⁹⁹ (MAA) با ابعادی بین 10-150 میکرومتر استفاده می‌شود. روش ساخت، آماده‌سازی ذرات و نشاندارسازی این کیت بسیار پیچیده و پرزحمت است. از طرفی اندازه ذرات  MAAبسیار متغییر بوده (10-150 میکرومتر) و باعث ایجاد جذب کبدی، طحال، کلیوی و متعاقب آن باعث تداخلاتی در تصویربرداری پزشکی هسته‌ای می‌گردد [1].

چیتوزان یک پلیمر با نام علمیβ-D (1-4) N-acetly- glucosamine است که به دلیل داشتن خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاص همواره در پزشکی مد نظر بوده است [2]. داشتن خصوصیات انبساط و کشیدگی شدید، خاصیت ضد ویروسی و ضد باکتریایی، غیر سمی و غیر آلرژیک بودن، عدم حلالیت در آب، قدرت بالا در جذب مواد رنگی و خاصیت ژله‌ای شدن برخی از وی‍ژگی‌های فیزیکی و شیمیایی چیتوزان است.

در مطالعه که توسط Banerjee و همکارانش انجام شد، روشی برای سنتز نانو ذرات چیتوزان با اندازه‌های کوچک تر از 100 نانومتر و نشاندارسازی آن با تکنسیوم ارائه دادند. آنها پس از سنتز و نشاندارسازی نانوذرات، آن را به موش تزریق و توزیع زیستی آن را مورد بررسی قرار دادند [3].

Kim و همکاران، دو ترکیب متفاوت از چیتوزان را با تکنسیوم نشاندار نموده و توزیع زیستی این دو ترکیب را مورد بررسی قرار دادند که در نهایت مشاهده شد که Galactosyl-methylated chitosan  نشاندار شده با تکنسیوم در مقایسه با ترکیب دیگر Hydrazinonicotinamide-Galactosylated Chitosan نشاندار شده با تکنسیوم، تجمع بیشتری در کبد می‌یابد [4].

این گروه در ادامه در سال 2006، دو ترکیب مختلف دیگر از چیتوزان شامل Hydrazinonicotinamide-Galactosylated Chitosan  و hydrazinonicotinamide Chitosan را با تکنسیوم نشاندار کرده و پس از تزریق آن به موش Balb/c و بررسی توزیع زیستی آنها در 10، 60 و 120 دقیقه، تصاویری از موش‌ها با کمک دوربین گاما گرفتند که جذب بیشتر Hydrazinonicotinamide-Galactosylated Chitosan را در کبد و کلیه نشان می‌داد [5].

به علت برخی سختی‌ها و مشکلاتی که در شرایط ساخت، نگهداری و نشاندارسازی کیت MAA–^mTc⁹⁹ وجود دارد و با توجه به خصوصیات خوب و بارز پلیمر چیتوزان، تصمیم گرفته شد تا میکروذرات چیتوزان، سنتز و با تکنسیوم نشاندار شود و بعد از انجام آزمون‌های کنترل کیفی، قابلیت آن در تصویربرداری از ریه سنجیده شود.

در این تحقیق از ذرات نشاندار چیتوزان در ابعاد محدودتر که با روشی بسیار ساده و سریع بدست می‌آید استفاده شد تا بتوان برآوردی از قابلیت این دارو و احیانا جایگزینی آن به جای آلبومین ماکروآگرگیته-^mTc⁹⁹ بدست آورد.

مواد و روش‌ها

چیتوزان با وزن مولکولیkD 200 با درجه استیل زدائی 85%، سدیم تری پلی فسفات واسید استیک از شرکت سیگما تهیه شد. تهیه نانوذرات چیتوزان خالص به روش ژله‌ای شدن (Ionotropic gelation) انجام شد [6]. برای این منظور 5 میلی‌لیتر محلول چیتوزان در اسید استیک دو درصد (mg/mL 2) به 2 میلی‌لیتر از محلول سدیم تری‌پلی فسفات (mg/mL 1) اضافه شد. بعد از هم زدن به مدت 10 دقیقه محلول کلوئیدی بدست آمده حاوی میکرو ذرات چیتوزان است که بعد از شستشو با کمک فیلتر کردن و سانتریفیوژ، ذرات در محدوده 90-110 میکرون جدا شدند. نشاندارسازی میکروذرات چیتوزان، به روش مستقیم و با احیا کردن تکنسیوم به کمک کلرید قلع، مطابق روش Banerjee و همکارانش انجام شد [3].

پس از تهیه اندازه نانوذرات و پتانسیل زتا توسط دستگاه زتا سایزر مالورن اندازه گیری شد. همچنین، ابعاد نانوذرات در حالت خشک با میکروسکوپ الکترونی(TEM) تعیین شد.

به روش (Instant Thin Layer Chromatography (ITLC با استفاده از نوارهای واتمن شماره 1به عنوان فاز ثابت و بافر سالین به عنوان حلال ارزیابی گردید. روش کار بدین صورت است که ورقه ITLC با ابعاد cm 14 × 1 بریده می‌شود و به فاصله cm 5/1 از ابتدای آن نمونه‌گذاری (μl 5) می‌شود و پس از خشک شدن نمونه، ورقه برای جداسازی در تانک محتوی نرمال سالین قرار داده می‌شود. بعد از طی حدود cm 10 توسط فاز متحرک، به ورقه فرصت داده می‌شود تا خشک شود. آنگاه ورقه به قطعات cm 1 بریده می‌شود و مقدار اکتیویته در هر قطعه توسط دستگاه شمارنده گاما شمارش می‌شود. مجموع اکتیویته موجود در دو سانتی‌متر اول به اکتیویته کل تقسیم می‌شود تا بازده نشاندارسازی بدست آید.

از کمپلکس میکرو ذرات چیتوزان-تکنسیم در زمانهای 30، 60، 120، 180 و 300 دقیقه بعد نشاندارسازی نمونه‌هایی(Ciµ10) برداشته و بازده نشاندارسازی به روش  ITLC که در بالا توضیح داده شد، ارزیابی گردید.

جهت تصویربرداری به 6 تا موش سالم BALB/c با سن 8-6 هفته و وزن g35-25 ، lμ100Ci/μ250 از چیتوزان-تکنسیوم تزریق و بعد 15 دقیقه، با سیستم تصویربرداری پزشکی هسته‌ای تصاویر استاتیک با کولیماتور LEHR (Low Energy High Resolution) و در ابعاد 512 × 512 با شمارش 300 کیلو کانت بر پیکسل گرفته شد.

تعداد نمونه‌ها در همه بخش‌ها، 6 عدد در نظر گرفته شد که این عدد با کمک نرم‌افزار Mini Tab محاسبه شد. برای بالا رفتن دقت محاسبات هر اندازه‌گیری سه بار تکرار و در نهایت میانگین گیری و نتایج بصورت میانگین± انحراف معیار گزارش شد. کلیه داده‌ها در نرم‌افزار SPSS وارد و با کمک آن، تحلیل آماری و آزمونt-test  برای مقایسه بین گروه‌های مختلف انجام شد. حدود معنی‌داری 05/0p < در نظر گرفته شد.

نتایج

اندازه ذرات باسیستم ((DLS Dynamic Light ] [Scattering در محیط آبی و شکل ذرات به کمک میکروسکوپ الکترونی تعیین شد. اندازه ذرات بین 90-110 میکرون و به شکل تقریباً کروی بدست آمد. بازده نشاندارسازی کمپلکس، 60 دقیقه پس از انکوباسیون، 3±94% بدست آمد. پایداری این ترکیب نشاندار، تا 300 دقیقه بعد از نشاندارسازی، در حدود 98% بدست آمد. تصویربرداری از موش 15 دقیقه بعد از تزریق چیتوزان- تکنسیوم به کمک سیستم پزشکی هسته‌ای انجام شد که تصویر یک موش نمونه در شکل 1 نمایش داده شده است. مشخص شدن دو ریه در تصویر نشان از جذب بالای دارو در داخل ریه دارد.

شکل1- تصویر پزشکی هسته‌ای از یک موش نمونه، 15 دقیقه بعد از تزریق چیتوزان-تکنسیم

بحث

هدف این تحقیق، معرفی ذرات نشاندار چیتوزان با ابعاد محدودتر از آلبومین ماکروآگرگیته-^mTc⁹⁹ و احیانا جایگزینی آن در تصویربرداری از ریه در پزشکی هسته‌ای است.

اندازه ذرات بعد از خالص سازی 90-110 میکرون انتخاب شد. بازده نشاندارسازی بسیار بالا و 94 % بدست آمد. نتیجه بررسی درصد پایداری این ترکیب، حتی 5 ساعت بعد نشاندارسازی بسیار امیدوار کننده بود. به علت اندازه بزرگ ذرات در اولین عبور از ریه داخل مویرگ‌های آن گیر کرده و مقادیر بسیار کم آن وارد سایر اندام‌ها میشود و تصاویر پزشکی هسته‌ای که 15 دقیقه بعد از تزریق از موش گرفته شد موید همین نکته است.

Ergun و همکارانش میکروسفرهای پلی‌لاکتیک اسید(poly lactic acid) را ساخته و با تکنسیوم نشاندار کردند و نهایتاً آن را برای کاربرد تشخیصی در ریه موش و خرگوش، مورد استفاده قرار دادند. ابعاد ذرات آنها 1-10 میکرون و بازده نشاندارسازی 98% بود. نتایج توزیع حیاتی در موش و خرگوش نشان داد که این دارو تجمع بسیار سریع و مناسب در ریه، ولی خروج کندی از آن دارد که این یکی از معایب آن به شمار می‌رود [7].

Hafeli و همکارانش با poly l-lactide acide میکروذراتی تک اندازه ساختند که اولا شامل گیرنده bis(picolylamine) در انتهای آن بود و ثانیاً اندازه آنها 9 میکرون بود. آنها این ذرات را به کمک کیت کربونیل نشاندار کرده و نشان دادند که 15 دقیقه بعد از تزریق، تقریبا 80% ذرات در ریه گیر افتاده‌اند. آنها ادعا کرده بودند که تک اندازه کردن ذرات باعث بهبود کیفیت تصویربرداری می‌شود [8].

البته در این تحقیق زمان از بین رفتن و خارج شدن میکروذرات بررسی نشده است که امیدواریم در آینده نزدیک به این موضوع بپردازیم.

نتیجه‌گیری

با توجه به نتایج بدست آمده می‌توان نتیجه گرفت میکروذرات چیتوزان نشاندار شده با تکنسیوم، احتمالاً می‌تواند کاندیدای خوبی جهت مطالعات پرفیوژن کبدی در پزشکی هسته‌ای باشد که برای نتیجه‌گیری نهایی نیاز به مطالعات تکمیلی‌ بیشتری در این زمینه است.

References

1. Weitz JI. Pulmonary embolism. In: Goldman L, Schafer AI, eds. Cecil Medicine. 24th ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2011:chap 98.
2. Wang JJ, Zeng ZW, Xiao RZ, Xie T, Zhou GL, Zhan XR, et al. Recent advances of chitosan nanoparticles as drug carriers. Int J Nanomedicine 2011; 6: 765–74.
3. Banerjee T, Mitra S, Kumar Singh A, Kumar Sharma R, Maitra A. Preparation, characterization and biodistribution of ultrafine chitosan nanoparticles. Int J Pharm 2002; 243(1-2): 93-105.
4. Kim EM, Jeong HJ, Park IK, Cho CS, Kim CG, Bom HS. Hepatocyte-Targeted Nuclear Imaging Using ^99mTc-Galactosylated Chitosan: Conjugation, Targeting, and Biodistribution . J Nucl Med 2005; 46(1): 141-5.
5. Kim EM, Jeong HJ, Kim SL, Sohn MH, Nah JW, Bom HS, et al. Asialoglycoprotein-receptor-targeted hepatocyte imaging using ^99mTc galactosylated chitosan. Nucl Med Biol 2006; 33: 529-34.
6. Kouril J, Vyslouzil J, Kejdusova M, Dvorackova K,
   Vetchy D. Possibilities of influencing the drug content and encapsulation efficiency of chitosan microspheres prepared by ionic gelation process. Ceska Slov Farm 2014; 63(2): 75-83.
7. Ergun EL, Ercan MT, Selek H, Kas HS, Ruacan S, Unsal IS, et al. Evaluation of ^99mTc labelled poly lactic acid microspheres for diagnostic radioembolization. J Microencapsul 2000; 17(4): 509-18.
8. Hafeli UO, Saatchi K, Elischer P, Misri R, Bokharaei M, Labiris NR, et al. Lung Perfusion Imaging with Monosized Biodegradable Microspheres. Biomacromolecules 2010; 11(3): 561–7.