مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

مقاله پژوهشی

مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

دوره 14، بهمن 1394، 952-939

بررسی اثر سیتوتوکسیک عصاره اتانولی برگ گیاه پسته وحشی (Pistacia Khinjuk) بر دو رده سلول سرطانی Hela و MCF-7

باقر سید علیپور[1]، الهام پوراکبر[2]، علی طراوتی[3]

دریافت مقاله: 1/7/93        ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح:28/10/93 دریافت اصلاحیه از نویسنده: 17/8/94          پذیرش مقاله: 15/9/94

چکیده

زمینه و هدف: سرطان مهم‌ترین علت مرگ و میر در سراسر جهان است. فرآورده‌های طبیعی و مشتقات گیاهان دارویی می‌توانند نقش مهمی‌ برای درمان سرطان ایفا کنند. هدف از این تحقیق بررسی اثرات سمیت سلولی عصاره اتانولی برگ گیاه پسته وحشی (Pistacia Khinjuk) بر سلول‌های MCF-7 و HeLa  بود.

مواد و روش‌ها: در این مطالعه آزمایشگاهی، عصاره اتانولی گیاهPistacia Khinjuk  با روش خیساندن استخراج شد و سمیت سلولی آن بر رده‌ سلولی HeLa و MCF-7 بررسی گردید. رده‌های سلولی HeLa و MCF-7 با غلظت‌های مختلف عصاره (10-156/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) به مدت 72 ساعت تیمار شد و برای بررسی مهار رشد، از آزمون MTT Methy Thiazol Tetrazolium)) استفاده گردید. جذب نوری محلول رنگی در طول موج 570 نانومتر توسط الایزا ریدر تعیین شد. داده‌ها با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون تعقیبی دانت (Dunnett) تجزیه و تحلیل شدند.

یافته‌ها: عصاره اتانولی برگ گیاه پسته وحشی در غلظت‌های مختلف، رشد سلول‌های  Helaو MCF-7 را به طور معنی‌‌داری (05/0p<) نسبت به گروه کنترل بعد از 72 ساعت، کاهش داد. بالاترین درصد مهار رشد در غلظت 156/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر به میزان 33/81% و 76/76% بود و مقدارIC₅₀  به میزان 41/2 و 40/2 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر به ترتیب برای سلول‌های  Helaو MCF-7 محاسبه شد.

نتیجه‌گیری: عصاره اتانولی برگ گیاه پسته وحشی دارای اثر مهاری بر رده سلولی Hela و MCF-7  است. لذا به منظور پیدا کردن مکانیسم اساسی این فعالیت، تحقیقات بیشتری باید انجام شود.

واژه‌های کلیدی: سمیت سلولی، عصاره اتانولی، پسته وحشی، رده سلولی  HeLaوMCF-7

مقدمه

ﺳﺮﻃﺎن ﯾﮏ ﺑﯿﻤﺎری اﺳﺖ ﮐﻪ به رشد غیر قابل کنترل بافت که در نتیجه عدم تعادل بین تقسیم سلولی و پدیده آپوپتوز به خاطر عوامل پیچیده به وجود می‌آید، اطلاق می‌شود [1]. در سلول‌های سرطانی، کنترل‌های چرخه سلولی وجود ندارند و به سازوکارهای کنترلی بدن به طور طبیعی پاسخ نمی‌دهند. پروتئین‌هایی که در مسیرهای پیام‌رسانی نقش دارند و بر روی چرخه سلولی تأثیر می‌گذارند تغییر پیدا می‌کنند و به هم خوردن چرخه سلولی مشاهده می‌شود، سلول‌ها رفتار متفاوتی نشان می‌دهند و درمان‌های متفاوتی را می‌طلبد [2]. این بیماری مجموعه‌ای از وقایع ژنتیکی و عوامل مرتبط با محیط و شیوه زندگی می‌باشد [3] و یکی از علل عمده مرگ و میر در سراسر جهان است [4]. در ایران بعد از بیماری قلبی و عروقی و تصادفات سومین عامل مرگ و میر می‌باشد [5].

سلول‌های Hela، سلول‌های اپی‌تلیایی و نامیرا مشتق شده از سرطان گردن رحم است که ششمین سرطان شایع در بین همه انواع سرطان‌ها و دومین سرطان شایع در بین زنان می‌باشد. سلول‌های) MCF-7   Michigan Caner (Foundation-7، سلول‌های شبه اپی‌تلیالی مشتق شده از سرطان پستان هستند. این رده سلولی بسیاری از ویژگی‌های اپی‌تلیوم پستانداران نظیر توانایی پردازش استرادیول از طریق گیرنده‌های استروژنی سیتوپلاسمی‌را دارا می‌باشد [6]. مسیر سیگنالینگ Wnt (Wingless/integrated) نقش کلیدی در سرطان‌زایی و جنین‌زایی دارد و مولکول‌های مسیر سیگنالینگ Wnt اهداف قوی برای تشخیص، پیش‌گیری و درمان سرطان هستند. تحقیقات نشان داد  Wnt7Bدر رده سلول سرطانی پستان (MCF-7) بیان می‌شود و بتا استرادیول بر سطح بیان  Wnt7Bدر رده سلول سرطان MCF-7 تأثیر نمی‌گذارد [7].

تاکنون بیش از ۲۰۰ نوع مختلف سرطان شناخته شده است که اکثر آنها درمان قطعی ندارند اما برای جلوگیری از رشد و پیشرفت آنها از روش جراحی، رادیوتراپی، شیمی‌درمانی، هورمون درمانی، ژن درمانی استفاده می‌شود [8]. علی‌رغم تحقیقات بسیار در مورد سرطان و درمان آن، هنوز هم این بیماری به عنوان یکی از بزرگترین مشکلات سلامت جوامع انسانی مطرح می‌باشد. با توجه به این که داروهای شیمیایی مورد استفاده در درمان سرطان، علاوه بر ایجاد مقاومت دارویی، دارای اثرات جانبی نیز می‌باشند، مطالعه و بررسی عواملی با منشاء طبیعی، مانند ترکیبات به دست آمده از گیاهان که اثرات مضر کمتری دارند، یکی از مهم‌ترین اهداف تحقیق در حوزه درمان سرطان است [10-9]. بنابراین تلاش برای یافتن داروهای مؤثرتر و با عوارض جانبی کمتر در مورد سرطان‌ها با استفاده از گونه‌های بومی‌ مورد توجه می‌باشد.

پسته با نام علمی ‌Pistacia از تیره Anacardiaceae شامل 11 گونه در سراسر جهان است. در ایران سه گونه وحشی در بخش‌های مختلف ایران می‌روید که شامل Pistacia Atlantica (دارای سه زیر گونه)، گونه Vera Pistacia و گونهPistacia Khinjuk  (فصل بهار می‌روید) می‌باشد [11] و عمدتاً در نواحی مرکزی و شرقی شامل نواحی کوهستانی نیمه خشک کشور مانند بلوچستان تا خراسان، لرستان، کردستان، اصفهان، فارس، خوزستان، کرمان، یزد و تهران انتشار قابل‌توجهی را نشان می‌دهند [12]. پسته وحشی که در مناطق مرکزی ایران به نام خینجوک (Pistacia  khinjuk Stocks) معروف است (شکل 1) به دلیل شباهت بسیار زیاد مورفولوژیکی و برگی با Pistacia Atlantica معمولاً به اشتباه بنه نامیده می‌شود در حالی که بنه نام فارسی گونه Pistacia Atlantica می‌باشد. پسته وحشی گیاهی درختچه‌ای کوتاه به ارتفاع یک تا سه متر، دو پایه، با برگ‌های مرکب تک شانه‌ای، برگچه‌های تخم مرغی شکل، گل‌های ارغوانی مایل به قرمز، گل آذین خوشه مرکب و میوه شفت کوچک می‌باشد [12].

شکل1- تصاویری از گیاه Pistacia khinjuk Stocks (شهرستان بردسکن در استان خراسان رضوی)

گیاهان متعدی از این تیره وجود دارد که بعضی از آن‌ها دارای اثر درمانی و برخی دیگر دارای میوه‌های مطبوع و خوراکی هستند. پسته خندان با نام علمی‌Vera Pistacia دارای مقدار زیادی مواد روغنی، آمیدون و مقداری ساکارز در مغز پسته می‌باشد [13]. مطالعات نشان داد داده‌اند رزین khinjuk Pistacia برای درمان سوء‌هاضمه، دندان درد و به عنوان اثر قابض در طب سنتی مورد قرار می‌گرفته و هم‌‌چنین میوه khinjuk Pistacia مصرف خوراکی دارد [14]. قسمت هوایی گیاه Khinjuk Pistacia حاوی گلیکوزیدهای فلاونوئیدی شامل میریستین- 3 -گلیکوزید، میریستین- 3 -رتینوزید و میریستین- 3- گلیکوزید می‌باشد [15] و هم‌چنین مشتقات میریستین بیست درصد مقدار کل پلی فنول برگPistacia Lentiscus را شامل می‌شوند [16]. Benhammou و همکاران گزارش کردند عصاره اتانولی برگ Pistacia Atlantica فعالیت آنتی‌میکروبی ندارد [17]. Tohidi و همکاران گزارش کردند که اسانس برگ و صمغ گیاه Pistacia Atlantica فعالیت آنتی‌اکسیدانی و ضد قارچی مناسبی دارد [18].

 متابولیت‌های ثانویه گیاهی، ترکیباتی آلی هستند که مستقیماً در رشد و نمو یا تولید مثل گیاه دخیل نیستند. این ترکیبات برخلاف متابولیت اولیه انتشار محدودی در قلمرو گیاهان دارند. آلکالوئیدها، ترپنوئیدها و فلاونوئیدها متابولیت‌های ثانویه‌ای هستند که دارای اثر ضد سرطانی می‌باشند [19]. با توجه به وجود ترکیبات پلی فنول و گلیکوزیدهای فلاونوئیدی در برگ و قسمت هوایی گیاهان تیره پسته و عدم مطالعه تأثیرات ضد سرطانی گونه Pistacia Khinjuk  بر رده سلولی سرطان دهانه رحم و سرطان پستان، مطالعه حاضر با هدف بررسی اثر سمیت سلولی عصاره اتانولی گونه بومی ‌ایران Pistacia Khinjuk بر رده‌ سلول‌های سرطانی HeLa و MCF-7 انجام شد.

مواد و روش‌ها

در این مطالعه آزمایشگاهی، گیاه Pistacia Khinjuk در اوایل اردیبهشت ماه 1391 از شهرستان بردسکن در استان خراسان رضوی جمع‌آوری و توسط متخصص گیاه شناسی در دانشگاه قائم شهر شناسایی گردید.

تهیه و آماده سازی عصارۀ گیاه: ابتدا برگ گیاه Pistacia Khinjuk پس از خشک شدن در معرض هوا، با استفاده از دستگاه آسیاب برقی (Moulinex, model AR1066Q) به صورت پودر در آمده و 25 گرم از آن را به روش خیساندن (ماسراسیون) و با حلال اتانول 96 درصد خیسانده و در یک دوره حداقل سه روزه همراه با تحریک مکرر به منظور حل شدن ماده حل‌شونده در دمای اتاق نگه‌داری شد. پس از گذشت سه روز، مخلوط عصاره و الکل با استفاده از کاغذ صافی فیلتر شد تا مواد جامد از مایع جدا شوند و در نهایت با استفاده از دستگاه تقطیر در خلاء دوار (Rotary evaporate) (Laborota 4000-efficient, Heidolph, Germany)  حلال اضافی تبخیر و تغلیظ شد و به کمک دستگاه فریز درایر (LTE Scientific Ltd, UK) کاملاً خشک شد و به شکل پودر در آمد. در نهایت پودر خشک در ظرف شیشه‌ای در بسته و درون یخچال نگه‌داری و برای تهیه غلظت‌های مختلف استفاده شد [20].

به دلیل این که عصاره گیاه Pistacia Khinjuk مستقیماً در محیط کشت RPMI-1640 حل نمی‌شود و هم‌چنین حلال عصاره گیاهی دی متیل سولفوکساید (DMSO) خود دارای اثرات سمیت سلولی می‌باشد، برای حذف اثر این ماده بر روی سلول‌های تیمارشده، میزان آن را در محلول نهایی کمتر از 1% در نظر می‌گیرند. دی متیل سولفوکساید تا غلظت کمتر از 1% فاقد سمیت است و غلظت این حلال از این حیث مهم می‌باشد [21]. بدین منظور ابتدا 480 میلی‌گرم عصاره گیاه بعد از توزین، در 100 میکرو لیتر حلال دی‌متیل سولفوکساید حل شد. سپس یک میلی‌لیتر محیط کشت برای حل شدن بهتر اضافه شد و در نهایت حجم محلول با استفاده از محیط کشت به 24 میلی‌لیتر رسانده شد: سپس رقت‌های متوالی از این استوک با نسبت‌های 1:1، 1:2، 1:4، 1:8، 1:16، 1:32، 1:64 ، 1:128 برای تهیه غلظت‌های 10، 5/7، 5، 5/2، 25/1، 625/0، 312/0و 156/0 میلی‌گرم در میلی‌لیتر استفاده شد [22]. برای رده سلولی MCF-7 از هشت غلظت استفاده شد در صورتی که برای رده سلولی HeLa از هفت غلظت استفاده شد.

کشت سلول‌های Hela و MCF-7: رده‌های سلولی Hela (NCBI C115) و MCF-7 (NCBI C135) از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران خریداری شدند و در محیط کشت مایع RPMI1640 حاوی 10% سرم جنین گاو (FBS) غیر فعال شده، 2 میلی‌مولار گلوتامین، محلول پنی‌سیلین (100 واحد در هر میلی‌لیتر) و استرپتومایسین (100 میکرو‌گرم در میلی‌لیتر) و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 5% CO₂ و 95% رطوبت کشت و پاساژ داده شد تا سلول‌ها از لحاظ تعداد و مورفولوژی به حد مطلوب برسند (پس از 4-3 پاساژ). پس از جدا کردن سلول‌ها از سطح فلاسک توسط تریپسین-EDTA (Gibco BRL, Scotland) شمارش و ارزیابی حیات سلول انجام شد و تعداد 3000 سلول در چاهک‌های 96 خانه‌ای به همراه و یا بدون عصاره گیاهی Pistacia Khinjuk کشت داده شد [23]. تغییرات مورفولوژی و خصوصیات عمومی‌سلول پس از 24 ساعت با استفاده از میکروسکوپ invert  (Motic, AE31 model, China) مورد ارزیابی قرار گرفت.

بررسی اثر سمیت سلولی عصاره‌ها با روش آزمون رنگ سنجی MTT Methy Thiazol Tetrazolium)) انجام شد [24]. MTT (Sigma-Aldrich, USA) یک نمک تترازولیوم محلول در آب است که بر اساس فعالیت آنزیم سوکسینات دهیدروزناز میتوکندریایی سلول‌های زنده استوار است و محلول زرد رنگ MTT را به کریستال‌های بنفش رنگ نامحلول فورمازان تبدیل می‌کند (چون محتوای دهیدروژناز سلول‌های یک نوع نسبتاً ثابت است، میزان فورمازان تولید شده متناسب با تعداد سلول است) که به وسیله دی متیل سولفوکساید به صورت محلول در می‌آید [25].

 سلول‌ها در فلاسک‌های تی شکل 75 سانتی‌متر مربع در 15 میلی‌لیتر محیط و با تعداد اولیه 10⁶ × 2-1 سلول، شروع به رشد ‌کردند. بعد از گذشت سه روز و پوشیده شدن بستر فلاسک از سلول، لایه سلول چسبنده به کف فلاسک به روش آنزیمی ‌و با استفاده از تریپسین-ورسن جدا گردید و پس از انتقال به لوله آزمایش استریل به مدت 10 دقیقه در دور 1200 سانتریفیوژ شد (Germany Sigma, 3-30k model,). سپس سلول‌ها در محیط کشت تازه با کمک پیپت پاستور دوباره معلق شد و 100 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی همراه با عصاره و یا بدون عصاره به هر چاهک از پلیت 96 خانه‌ای افزوده گردید به طوری که در هر چاهک تعداد 3000 سلول ‌باشد. پلیت‌ها به مدت 24 ساعت درون انکوباتور (Germany, Memmert) انکوبه ‌شدند تا سلول‌ها از استرس ناشی از تریپسینه شدن به حال عادی باز‌‌‌گردند. سپس، رقت‌های مناسب از عصاره مورد نظر تهیه و 100 میکرولیتر از هر رقت به صورت ستونی به چاهک‌های پلیت اضافه ‌شد و سلول‌ها به مدت 72 ساعت در دمای 37 درجه و 5% CO₂ در انکوباتور قرار داده شدند. پس از 72 ساعت از اضافه کردن عصاره به سلول‌ها، به هر چاهک 20 میکرولیتر از محلول 5  میلی‌گرم بر میلی‌لیتر MTT اضافه شد. پلیت‌ها به مدت 4 ساعت انکوبه شدند و پس از طی زمان لازم محیط کشت حاوی MTT به دقت خارج شد و به هر چاهک 100 میکرولیتر DMSO اضافه گردید تا فورمازان حاصل حل گردد [26]. پس از 10 دقیقه و تکان دادن پلیت‌ها با استفاده از تکان دهنده پلیت، جذب نوری در 570 نانومتر توسط دستگاه الایزا ریدر (Awareness Technology Inc, Stat Fax 2100, USA) خوانده شد. چاهک‌های حاوی سلول و بدون عصاره به عنوان چگالی نوری کنترل و چاهک‌های بدون سلول و تنها محیط RPMI1640 به همراه سرم جنین گاوی به عنوانBlank  در نظر گرفته شد.

درصد حیات سلولی با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد [27]:

لازم به ذکر است که اثر هر غلظت از عصاره بر رده سلولی Hela و MCF-7 در سه آزمایش مستقل از یکدیگر تحت بررسی قرار گرفت؛ از این رو اعداد درج شده در جدول، میانگین درصد پاسخ‌های به دست آمده در مهار رشد سلول برای سه بار تکرار مستقل می‌باشد. با توجه به مقادیر جذب نوری به دست آمده به وسیله دستگاه الایزا ریدر درصد مهار رشد مربوط به هر غلظت با به کار‌گیری فرمول زیر محاسبه شد [28]:

در نهایت برای به دست آوردن میزان IC₅₀ که بیانگر غلظتی از عصاره است که موجب 50% درصد مهار رشد سلولی‌های سرطانی می‌شود، از طریق رگرسیون خطی محاسبه انجام شد. با استفاده از منحنی، معادله خط برای سلول‌های سرطانی MCF-7 و HeLa به ترتیب 89/78+ x99/11- = Y و 08/120+ x96/28- = Y بدست آمد و سپس با جایگزینی 50 درصد مهار به جایY  در معادله، میزان IC₅₀ برای سلول‌های سرطانی MCF-7 و HeLa بدست آمد. برای تجزیه و تحلیل داده‌ها از نرم‌افزار آماری SPSS نسخه 16 استفاده شد و نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار حاصل از 3 تکرار تعیین گردید. داده‌ها با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه و آزمون تعقیبی دانت (Dunnett) تجزیه تحلیل شدند و سطح معنی‌داری در آزمون 05/0 در نظر گرفته شد.

نتایج

برای بررسی سمیت سلولی عصاره اتانولی گیاه Pistacia Khinjuk، غلظت‌های مختلف از عصاره تهیه شده و اثرات سمیت سلولی هر غلظت با کمک روش MTT بر رده سلول‌های سرطانی  HeLaو  MCF-7مورد بررسی قرار گرفت. همان‌طور که در جدول 1 مشاهده می‌شود عصاره گیاه Pistacia Khinjuk در غلظت‌های 156/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر و 312/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر اثر مهاری بر رده سلول Hela داشته است که این اثر معنی‌دار بوده و هم‌چنین بالاترین درصد مهار رشد در سلول‌های HeLa به ترتیب 33/81% و 21/64% برای این دو غلظت مشاهده شد. در غلظت‌های 625/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر و 25/1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر اختلاف معنی‌دار در مقایسه با گروه کنترل مشاهده نشد اما در صد مهار رشد کاهش پیدا کرد. در غلظت‌های 5/2، 5 و 10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر تغییرات معنی‌داری همراه با کاهش در صد مهار رشد مشاهده شد. بنابراین با افزایش غلظت عصاره، در تمام غلظت‌ها در صد مهار رشد کاهش پیدا کرد و شاید بتوان این نتیجه را ناشی از اثر عوامل محرک رشد ناشناخته موجود در عصاره اتانولی در غلظت‌های بالاتر دانست که اثر سمیت سلولی ترکیبات موجود در این عصاره اتانولی را خنثی می‏کنند. مقدار IC₅₀ برای رده سلولیHeLa ، 41/2 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر به دست آمد.

جدول 1- اثر غلظت‌های مختلف عصاره گیاه Pistacia Khinjuk  بر مهار رشد سلول‌های HeLa

تفاوت میانگین‌ها در سطح 05/0 معنی‌دار در نظر گرفته شده است (one way ANOVA, Dunnett's post-test).

نتایج اثر سمیت سلولی عصاره اتانولی گیاه Pistacia Khinjuk بر رده سلول‌های سرطانی MCF-7 در جدول 2 نشان داده شده است. نتایج نشان می‌دهد 72 ساعت تیمار با غلظت‌های 156/0 و 312/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر، اثر مهاری بر رده سلول MCF-7 داشته است که نسبت به کنترل معنی‌دار می‌باشد در صورتی که در بقیه غلظت‌ها نسبت به کنترل اثر معنی داری مشاهده نشد )05/0 .(p>بالاترین در صد مهار رشد در غلظت‌های 156/0 و 312/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر به ترتیب برابر 76/76% و 25/72% بود. هم چنین مقدار IC₅₀ برای رده سلولی MCF-7 به میزان 40/2 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر به دست آمد.

جدول 2- اثر غلظت‌های مختلف عصاره گیاه Pistacia khinjuk بر مهار رشد سلول‌های MCF-7

تفاوت میانگین‌ها در سطح 05/0 معنی‌دار در نظر گرفته شده است (one way ANOVA, Dunnett's post-test).

بحث

با ﭘﻴﺸـﺮﻓﺖ‌ﻫـﺎی ﺗﻜﻨﻮﻟـﻮژی در ﺑﻴﻮاﻧﻔﻮرﻣﺎﺗﻴﻚ و ﺗﻜﻨﻴﻚﻫﺎی ﻣﻮﻟﻜﻮﻟﻲ، اﻃﻼﻋﺎت زﻳﺎدی به دست آﻣﺪه ﻛﻪ در ﺷﻨﺎﺧﺖ زودرس ﺑﻴﻤﺎری ﺳﺮﻃﺎن ﻛﻤﻚ ﺧﻮاﻫـﺪ ﻛـﺮد. مطالعه و بررسی عواملی با منشاء طبیعی، مانند ترکیبات به دست آمده از گیاهان که اثرات مضر کمتری دارند یکی از مهم‌ترین اهداف تحقیق در حوزه درمان سرطان است. بدین منظور مطالعات گسترده‌ای بر روی گیاهان مختلف صورت گرفته و اثرات سمیت سلولی و ضد‌سرطانی آنها مورد بررسی و ارزیابی قرار گرفته است.

در این تحقیق اثر سمیت سلولی عصاره اتانولی برگ گیاه Pistacia Khinjuk به روش سنجش MTT مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این مطالعه نشان می‌دهد اثر عصاره اتانولی برگ گیاه Pistacia Khinjuk بر روی سلول‌های HeLa در غلظت 156/0 و 312/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر به طور معنی‌داری (به ترتیب به میزان 33/81%، 21/64%) باعث مهار رشد سلول‌ها نسبت به گروه کنترل شده است. مطالعه حاضر نشان داد با افزایش غلظت عصاره اتانولی برگ گیاه Pistacia Khinjuk از 156/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر به 10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر توانایی زیستی سلول‏ها افزایش یافت به عبارتی، مهار رشد سلول‌های سرطانی کاهش پیدا کرد. شاید بتوان این نتیجه را ناشی از اثر عوامل محرک رشد ناشناخته موجود در عصاره اتانولی در غلظت‌های بالاتر دانست که در غلظت‌های بالا اثر سمیت سلولی ترکیبات موجود در این عصاره اتانولی را خنثی می‏کنند اما به هر حال، با نظر به این که ترکیبات موجود در عصاره مورد آنالیز و تجزیه کمی ‌و کیفی قرار نگرفته‏اند و جداسازی و خالص‌سازی ترکیبات مؤثره و تعیین ساختار جزء مؤثره عصاره موجود در عصاره اتانولی انجام نشد، نمی‏توان در این مورد اظهار نظر قطعی نمود.

امروزه بیش از 60% از ترکیبات ضد‌سرطانی که برای درمان بیماران سرطانی کاربرد دارد از منابع گیاهی، دریایی و میکروارگانیسم‌ها به دست می‌آیند. متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دارای اثرات بیولوژیکی متعدد از جمله اثرات ضدالتهابی، ضد سرطانی، ضد دردی و اثرات متعدد قلبی عروقی هستند. نتایج حاصل از آنالیز اسانس برگ گیاه Pistacia lentiscus L توسط GC-MC حاکی از وجود سزکوئی ترپن (Sesquiterpene) به مِیزان 4% بود و هیچ گونه الکل منوترپنی مشاهده نشد، در صورتی که در مطالعات قبلی که بر روی گیاهان  Pistacia khinjuk Stocks و Pistacia chinensis Bunge انجام گرفت به ترتیب 16% و 8% الکل منو ترپن گزارش شد [29]. مطالعات نشان داد ترکیبات اصلی اسانس قسمت‌های هوای گیاه Pistacia Khinjuk  شامل pinene, β-pinene, myrcene, beta-caryophyllene, germacrene B و spathulenol می‌باشد که مسئول فعالیت آنتی‌اکسیدانی و آنتی‌قارچی می‌باشند [30]. نتایج به دست آمده از آنالیز اسانس میوه گیاه Pistacia Khinjuk نشان داد که جزء اصلی آن شاملphellandrene ، α-pinene و Limonene- ∆ می‌باشد که مقدار آن‌ها به ترتیب 33/52%، 27/15% و 08/4% گزارش شد [14]. از سوی دیگر، فعالیت آنتی‌اکسیدانی و ضد‌میکروبی نیز برای برگ گیاه
P.Khinjuk به واسطه حضور ترکیبات فنولیک آن‌ها گزارش شد [31-30]. در این تحقیق پس از بررسی اثرات سیتوتوکسیک عصاره بر رده سلول‌های سرطانی Hela و تأیید فعالیت آنتی‌اکسیدانی و حضور ترکیبات فنلی بالاخص فلاونوئِید از مطالعات قبلی و نقش فلاونوئِید در ارتباط با اثرات ضد‌سرطانی، این نتیجه حاصل شد که فعالیت ضد سرطانی عصاره برگ Pistacia khinjuk می‌تواند به علت ترکیبات فنلی باشد. بنابراین، این یافته با مطالعات مختلفی که در ارتباط با اثرات ضد‌سرطانی ترکیبات پلی فنول با مکانیسم‌هایی نظیر القاء مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی، مهار رشد سلولی، مهار فعالیت پروتئین کینازها و جلوگیری از تهاجم سلول‌ها انجام شده است، مطابقت دارد [32].

نتایج این مطالعه هم‌چنین نشان می‌دهد که عصاره اتانولی برگ گیاه Pistacia Khinjuk در غلظت‌های 156/0، 312/0، 625/0، 25/1 و 10 میلی‌گرم در میلی‌لیتر باعث مهار رشد سلول‌های MCF-7 به ترتیب به میزان 76/76%، 25/72%، 06/31% و 89/19% شده است و هر چه غلظت عصاره بیشتر می‌شود اثر مهار رشد سلول‌های سرطانی کمتر می‌گردد. این احتمال وجود دارد در این محدوده از غلظت، ترکیب مؤثر در عصاره برگ گیاه Pistacia Khinjuk به گونه‌ای نبوده که سبب مهار رشد شود هر چند کاهش رشد مشاهده شد.Balan  و همکاران با بررسی فعالیت آنتی تومور صمغ گیاهPistacia lentiscus  نشان دادند که این گیاه با القاء آپوپتوز، تکثیر سلول تومور کولورکتال انسان را در vitro in مهار می‌کند [33]. Rezaei و همکاران گزارش دادند عصاره میوهPistacia Atlantica  رشد سلول‌های کارسینومای انسان را مشابه با دوکسی روبسین مهار می‌کند [34]. Almehdar و همکاران نشان دادند، روغن رزین Pistacia Vera  اثر سیتوتوکسیک ملایم در برابر رده سلولی سرطان پستان، رده سلولی سرطان سرویکس و ملانوسیت‌های نرمال دارد [35]. بنابراین، یافته مطالعه حاضر منطبق با نتایج حاصل از گونه‌های مختلف پسته و تأیید نقش ضد‌سرطانی فلاونوئیدها از طریق مهار پلیمریزاسیون توبولین‌ها، ممانعت از عمل تخریبی رادِیکال‌های آزاد و القاء آپوپتوز می‌باشد [36]. مقایسه اثرات سمیت سلولی عصاره گیاه Pistacia Khinjuk بر روی سلول‌های سرطانی MCF-7 با HeLa نشان داد این عصاره دارای اثرات سمیت بیشتری بر روی سلول‌هایHeLa  در مقایسه با سلول‌های MCF-7 بود، به گونه‌ای که در تمامی ‌غلظت‌های عصاره، درصد مهار رشد سلول‌های سرطانی HeLa تا حدی بیشتر است. با وجود این شواهد، می‌توان انتظار داشت که فعالیت مهارکنندگی گونه Pistacia Khinjuk بر سلول‌های سرطانی احتمالاً به علت وجود ترکیبات فلاونوئید و فعالیت آنتی‌اکسیدانی در آن باشد. لذا به نظر می‌رسد خواص سیتوتوکسسیک عصاره گیاه Pistacia Khinjuk را بتوان به طور کلی به حضور متابولِیت‌های ثانویه به خصوص در درجه اول فلاونوئیدها و در درجه دوم به فنل تام موجود در این گیاه نسبت داد.

از آن جا که مطالعه بر روی روش‌های مختلف درمان سرطان، یکی از مهم‌ترین اهداف پژوهشی پزشکی در عصر حاضر به حساب می‌آید، لذا جهت یافتن روش‌های درمانی مناسب و اثربخش، تلاش‌های گسترده‌ای آغاز شده است که از آن جمله می‌توان به به بررسی اثرات سمیت سلولی مواد نشأت گرفته از گیاهان در شرایط آزمایشگاهی با استفاده از روش سنجش MTT اشاره نمود. هرچند روش سنجش MTT یک روش پرکاربرد در آزمایشگاه‌ها و مراکز تحقیقاتی مختلف است، اما خود نیز دارای معایبی می‌باشد که از آن جمله می‌توان به این حقیقت اشاره نمود که این روش بر پایه فعالیت میتوکندری‌های سلول‌های زنده استوار می‌باشد و با استفاده از نتایج این تست تشخیصی، نمی‌توان در مورد کاهش تعداد سلول‌ها با قطعیت کامل قضاوت نمود، زیرا که اگر ماده‌ای سبب تغییر در تعداد میتوکندری‌های سلول شود، اثر آن توسط این تست، مشابه تغییر تعداد سلول‌ها تفسیر می‌گردد. از طرفی برای استفاده بالینی ترکیبات گیاهی نیازمند انجام تست‌های بیشتر و دقیق‌تر بوده و لذا جداسازی و خالص‌سازی ترکیبات مؤثره موجود در عصاره، تعیین ساختار جزء مؤثره عصاره، تعیین مکانیسم بیوشیمیایی فعالیت ضد‌سرطان و بررسی اثرات ضد‌سرطانی عصاره این گیاه در شرایط in vivo پیشنهاد می‌گردد.

نتیجه‌گیری

در این مطالعه مشخص گردید عصاره اتانولی برگ گیاه Pistacia Khinjuk در غلظت‌های 156/0 و 312/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر به طور معنی‌داری سبب مهار رشد سلول‌های سرطانی MCF-7 و  HeLaشد به طوری که بالاترین درصد مهار در این دو غلظت مشاهده گردید. برای تأیید توان سیتوتوکسیک ماده مؤثره این گیاه و احتمالاً بهره‌برداری دارویی از آن، تحقیقات بیشتر و تکمیلی ‌مورد نیاز است.

تشکر و قدردانی

بدین‌وسیله از جناب آقای دکتر بهمن اسلامی‌که در جمع‌آوری و شناسایی نمونه و دکتر نقی‌نژاد در توضیحات گیاه‌شناسی و هم‌چنین از کارشناس آزمایشگاه زیست سلولی و مولکولی سرکار خانم محمدی که در کارهای آزمایشگاهی ما را یاری نمودند، نهایت تشکر به عمل می‌آید.

References

[1] Bansal P, Gupta V, Bansal R, Sapra R. Dietary phytochemicals in cell cycle arrest and apoptosis an insight. J Drug Deliv Ther 2012; 2(2): 8-18.

[2] Reece JB, Urry LA, Cain ML, Wasserman SA, Minorsky PV, Campbell NA. Campbell Biology, 9th edn, San Francisco, California, USA, Benjamin Cummings, 2012; pp: 1464.

[3] Van Lier EA, van Kranen HJ, Van Vliet JA, Rahamat-Langendoen JC. Estimated number of new cancer cases attributable to infection in the Netherlands in 2003. Cancer let 2008; 272(2): 226-31.

[4] Wicki A, Hagmann J. Diet and cancer. Swiss Med Wkly 2011; 141: w13250.

[5] Kosha A, Farahbakhsh M, Hakimi S, Abdollahi L, Golzari M, Seif M. Epidemiology of cancer in west Azarbaijan in 2007. Med J Tabriz Univ Med Sci 2010; 32(4): 74-9. [Farsi]

[6] Levenson AS, Jordan VC. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res 1997; 57(15): 3071-8.

[7] Kirikoshi H, Katoh M. Expression of WNT7A in human normal tissues and cancer, and regulation of WNT7A and WNT7B in human cancer. Int J Oncol 2002; 21(4): 895-900.

[8] Shahneh FZ, Valiyari S, Azadmehr A, Hajiaghaee Reza, Yaripour S, Bandehagh A, et al. Inhibition of Growth and Induction of Apoptosis in Fibrosarcoma Cell Lines by Echinophora platyloba DC: In Vitro Analysis. Adv Pharmacol Sci 2013; 2013: 512931.

[9] Mehta RG, Murillo G, Naithani R, Peng X. Cancer chemoprevention by natural products: how far have we come? Pharmaceutical Research 2010; 27(6): 950–61.

[10] Taraphdar AK, Roy M, Bhattacharya RK. Natural products as inducers of apoptosis: implication for cancer therapy and prevention. Current Science 2001; 80(11): 1387–96.

[11] Rechinger KH. Anacardiaceae in Flora Iranica. Graz, Akademische Druck-und Verlasanstalt, 1969; 63: pp: 1-8.

[12] Mozafarian V. Trees and Shrubs of Iran. Tehran, Farhang moaser, 2005; pp: 15-22.

[13] Zargari A. Medicinal plants. 8th Edition, Tehran,University of Tehran press, 2012; vol 1: pp: 573-86.

[14] Ghasemi Pirbalouti A, Aghaee K. Chemical Composition of Essential Oil of Pistacia khinjuk Stocks Grown in Bakhtiari Zagross Mountains, Iran. Electronic Journal of Biology 2011; 7(4): 67-9.

[15] Kawashty SA, Mosharrafa SAM, El-Gibali M, Saleh NAM. The flavonoids of four Pistacia species in Egypt. Biochem Syst Ecol 2000; 28(9): 915–7.

[16] Romani A, Pinelli P, Galardi C, Mulinacci N, Tattini M. Identification and quantification of galloyl derivatives, flavonoid glycosides and anthocyanins in leaves of Pistacia lentiscus L. Phytochem Anal 2002; 13(2): 79–86.

[17] Benhammou N, Bekkara FA, Panovska TK. Antioxidant and antimicrobial activities of the Pistacia lentiscus and Pistacia atlantica extracts. Afr J Pharm Pharacol 2008; 2(2): 22–8.

[18] Tohidi M, Khayami M, Nejati V, Meftahizade H. Evaluation of antibacterial activity and wound healing of Pistacia atlantica and Pistacia khinjuk J Med Plants Res 2011; 5(17): 4310–4.

[19] Kawashty SA, Mosharrata SAM, El-Gibali M, Saleh NAM. The flavonoids of four Pistacia species in Egypt. Biochem Syst Ecol 2000; 28(9): 915–7.

[20] Koleva II, van Beek TA, Linssen JP, de Groot A, Evstatieva LN. Screening of Plant Extracts for Antioxidant Activity: a Comparative Study on Three Testing Methods. Phytochem Anal 2002; 13(1): 8–17.

[21] Da Violante G, Zerrouk N, Richard I, Provot G, Chaumeil JC, Arnaud P. Evaluation of the cytotoxicity effect of dimethyl sulfoxide (DMSO) on CaCO₂/TC7 colon tumor cell cultures. Biol Pharm Bull 2002; 25(12): 1600-3.

[22] Kanimozhi D. In-Vitro Anticancer Activity of Ethanolic Extract of Cynodon dactylon Against HEP-2, HELA and MCF-7 Cell Lines. IJSRR 2012; 1(1): 10-23.

[23] Feridberg R. An investigation into the antimicrobial and anticancer activities of Geranium incanum, Artemisia afra and Artemisia absinthium [Dissertation]. South Africa: Faculty of Health Sciences, Nelson Mandela Metropolitan University; 2009. p.1-245.

 [24] Mossman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983; 65(1-2): 55-63.

[25] Iselt MA, Holtei WJ, Hilgad PT. The tetrazolium dye assay for rapid in vitro assessment of cytotoxicity. Drug Res 1998; 39: 125-9.

[26] Carmichale J, De Graff WG, Gazdar AF, Mina JD, Mitchell JB. Evaluation of a tetrazolium based semi automated colorimetric assay: assessment of chemo sensitivity testing. Cancer Res 1987; 47(4): 936-42.

[27] Stoddart MJ. Mammalian Cell Viability, Methods and Protocols in molecular Biology. Estimation of cell number Based on Metabolic Activity: The MTT Reduction Assay. Methods Mol Biol 2011; 740: 13-9.

[28] Gordanian B, Behbahani M, Carapetian J, Fazilati M. Evaluation of Cytotoxicity of Sagebrush Plain Extract on Human Breast Cancer MCF7 Cells. Armaghane danesh 2013; 18(3): 241-51.

[29] De Pooter HL, Schamp NM, Aboutabl EA. Essential Oils from the Leaves of Three Pistacia Species Grown in Egypt. Flavour Frag J 1991; 6(4): 229-32.

[30] Taran M, Sharifi M, Azizi E. Antimicrobial activity of the leaves of Pistacia khinjuk. J Med Plants 2010; 9(6): 81-5.

[31] Peksel A, Arisan-Atac I, Yanardag R. Evaluation of antioxidant and antiacetylcholin esterase activities of the extracts of pistacia khinjuk desf leaves. J of Food Biochem 2010; 34(3): 451-76.

[32] Kanadaswami C, Lee L, Lee P, Hwang P, Ke  JJ, Huang YT. The antitumor activities of flavonoids. In Vivo 2005; 19(5): 895-910.

[33] Balan KV, Prince J, Han Z. Antiproliferative activity and induction of apoptosis in human colon cancer cells treated in vitro with constituents of a product derived from Pistacia lentiscus L. var. chia. Phytomedicine 2007; 14(4): 263-72.

[34] Rezaei PF, Fouladdel S, Hassani S. Induction of apoptosis and cell cycle arrest by pericarp polyphenol-rich extract of Baneh in human colon carcinoma HT29 cells. Food Chem Toxicol 2012; 50(3-4): 1054-9.

[35] Almehdar H, Abdallah HM, Osman M, Abdel-Sattar EA. In vitro cytotoxic screening of selected Saudi medicinal plants. J Nat Med 2012; 66(2): 406-12.

[36] Gibbons S. Anti-staphylococcal plant natural products. Nat Prod Rep 2004; 21(2): 263-77.