مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

مقاله پژوهشی

مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

دوره 14، بهمن 1394، 938-923

تهیه نانو واکسن نوترکیب نوروتوکسین بوتولینوم تیپ E بر پایه کیتوسان و مقایسه ایمنی‌زایی آن به دو روش تزریقی و خوراکی در موش سوری

محمد جواد باقری‌پور[1]، فیروز ابراهیمی[2]، عباس حاجی‌زاده[3]، شهرام نظریان²، محمدعلی عارف‌پور[4]

دریافت مقاله: 2/2/94        ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 10/4/94    دریافت اصلاحیه از نویسنده: 17/6/94      پذیرش مقاله: 19/8/94

چکیده

زمینه و هدف: بیماری بوتولیسم در اثر مسمومیت با یکی از هفت نوروتوکسین بوتولینوم ایجاد می‌شود. زیر واحد اتصالی این سموم ایمونوژن بوده و کاندید واکسن نوترکیب زیر واحدی علیه این بیماری می‌باشند. با توجه به ایمنی‌زایی پایین پروتئین نوترکیب، استفاده از حاملین مناسب جهت رسانش آنتی‌ژن به سلول‌های هدف، اجتناب‌ناپذیر است. هدف از این تحقیق، ارزیابی استفاده از نانوذرات کیتوسان به عنوان حامل در تجویز خوراکی و تزریقی پروتئین نوترکیب ناحیه اتصالی Botulinum Neurotoxin type E (BoNT/E) بود.

مواد و روش‌ها: در این مطالعه تجربی، نانوذرات کیتوسان حاوی پروتئین نوترکیب ناحیه اتصالی BoNT/E با روش ژلاسیون یونی تهیه و به صورت خوراکی و تزریقی به 5 گروه موش‌ سوری تجویز شدند. تیتر آنتی‌بادی IgG ضد نورتوکسین بوتولینوم با روش الایزا مورد بررسی قرار گرفت. در نهایت، تمام گروه‌ها با نوروتوکسین فعال بوتولینوم تیپ E چالش شدند و داده‌های بدست آمده با آزمون t-test مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

یافته‌ها: میزان تولید آنتی‌بادی IgG ضد نورتوکسین بوتولینوم پس از هر بار تزریق در همه گروه‌های مورد آزمون، افزایش یافت. استفاده از نانوذرات کیتوسان، افزایش معنی‌داری در میزان تولید آنتی‌بادی IgG ضد نورتوکسین بوتولینوم به دنبال نداشت (p>0.05). با مقایسه تیتر آنتی‌بادی IgG ضد نوروتوکسین بوتولینوم در موش‌های ایمن شده با نانوذرات حاوی آنتی‌ژن از طریق خوراکی و تزریقی تفاوت معنی‌داری مشاهده نشد (p>0.05). در چالش با نوروتوکسین فعال بوتولینوم تیپ E، موش‌هایی که به صورت خوراکی ایمن شده بودند، 500 برابر LD₅₀ را تحمل کردند.

نتیجه‌گیری: نتایج این تحقیق نشان داد پروتئین نوترکیب BoNT/E به تنهایی قادر است از طریق سیستم گوارش، جذب و منجر به بروز پاسخ ایمنی مؤثر شود. نتایج چالش نشان داد پاسخ ایمنی ایجاد شده در تجویز خوراکی، مؤثر و در تجویز تزریقی ناکارآمد بود.

واژه‌های کلیدی: نانوذرات کیتوسان، واکسن خوراکی، ژلاسیون یونی، واکسن نوترکیب، نوروتوکسین بوتولینوم تیپ E

مقدمه

بوتولیسم بیماری خطرناکی است که در اثر تماس با نوروتوکسین‌های بوتولینوم ایجاد می‌شود. در میان نوروتوکسین‌های بوتولینوم، عمدتاً انواع A، B و E برای انسان‌ بیماری‌زا هستند. تاکنون تحقیقات گسترده‌ای برای یافتن واکسن مناسب علیه این نوروتوکسین‌ها صورت گرفته است. در حال حاضر تنها واکسن موجود در برخی کشورهای پیشرفته، یک واکسن توکسوئیدی پنج‌گانه بر علیه تیپ‌های A تاE  می‌باشد. مشکلات موجود در تهیه واکسن‌های توکسوئیدی‌ نظیر هزینه بالای تولید، لزوم استفاده از چندین سروتیپ مختلف، خطرات ناشی از کار با سویه‌های خطرناک فعال و در نهایت ورود پروتئین‌های ناخواسته به بدن در زمان ایمن‌سازی، موجب شده تا پژوهشگران تحقیق بر روی واکسن‌های نوترکیب را در اولویت اول تحقیقات خود قرار دهند. در این نوع واکسن‌ها از نواحی خاصی از توکسین که توانایی تحریک سیستم ایمنی را داشته و فاقد اثرات سمی هستند، استفاده می‌شود [6-1]. 

با توجه به خاصیت ایمونوژنی زیر واحد اتصال‌دهنده توکسین، استفاده از پروتئین نوترکیب این زیر واحد به عنوان کاندید واکسن، مورد توجه قرار دارد. به منظور بهبود کارایی واکسن‌های زیر واحدی باید از ادجوان‌ها یا سیستم‌های مناسب تحویل آنتی‌ژن استفاده نمود. برای این منظور، امروزه سامانه‌های رهایش آنتی‌ژن مبتنی بر نانو و میکروذرات به صورت گسترده‌ای مورد توجه و استفاده محققین قرار گرفته است [9-7].

واکسن‌ها را می‌توان به طرق مختلف از جمله تزریقی، خوراکی و استنشاقی استفاده نمود. تجویز خوراکی، به دلیل ماهیت غیرتهاجمی آن، مسیر مناسبی برای تجویز واکسن می‌باشد. از جمله ویژگی‌های این روش نسبت به روش تزریقی، عدم احساس درد و ناراحتی و نیز کاهش احتمال آلودگی است. با این حال، واکسن‌های تجویز شده، باید بتوانند در برابر شرایط اسیدی معده و محیط روده مقاومت کنند. به طور معمول،  پپتیدها و پروتئین‌ها زمانی که به صورت خوراکی تجویز ‌شوند، به دلیل نفوذ پذیری کم مخاط و عدم پایداری‌شان در محیط دستگاه گوارش و در نتیجه تخریب آنها قبل از جذب، دسترسی زیستی ضعیفی نشان می‌دهند. طیف وسیع آنزیمی و شرایط فیزیکی شیمیایی دستگاه گوارش، محیطی نامناسب را برای بسیاری از واکسن‌های خوراکی ایجاد می‌کند [11-10]. اگر چه در حال حاضر بیشتر واکسن‌های مؤثر و کاربردی به شکل تزریقی تهیه می‌شوند، اما مؤسسات تحقیقاتی به دنبال توسعه واکسن‌های خوراکی هستند. استفاده از واکسن‌های خوراکی دارای محدودیت‌هایی است که از آن جمله می‌توان به ایجاد تحمل خوراکی و کارا نبودن، هضم و تخریب ساختار واکسن در دستگاه گوارش و عدم ارسال صحیح و سالم آن به نواحی جذب گوارشی اشاره کرد که در نتیجه منجر به عدم تحریک سیستم ایمنی بدن می‌گردد [12].

تاکنون مطالعات زیادی به منظور یافتن راه‌کارهای مختلف برای بهینه‌سازی و افزایش تحویل خوراکی پپتیدها و پروتئین‌های درمانی صورت گرفته است. تغییر شیمیایی واکسن‌های پروتئینی، استفاده از حاملین اختصاصی، بکارگیری مهارکننده‌های آنزیم‌های گوارشی، ترکیبات افزایش و تقویت‌کننده جذب، پلیمرهای متصل شونده به مخاط گوارشی و استفاده از پاتوژن‌های گوارشی دستکاری شده برای حمل واکسن‌ها از جمله این راه‌کارها می‌باشند. یکی از روش‌های پیشنهادی برای افزایش دسترسی زیستی در تجویز خوراکی، استفاده از حامل‌های کلوئیدی از قبیل امولسیون‌ها، لیپوزوم‌ها، نانوذرات پلیمری و دندریمرها، می‌باشد. از جمله مزایای نانوذرات پلیمری نسبت به سایر حامل‌های کلوئیدی مانند لیپوزوم‌ها، می‌توان به امکان تجویز مؤثر واکسن‌ به بافت‌های مخاطی و محافظت آنتی‌ژن در مقابل آنزیم‌های پروتئولیتیک هنگام تجویز مخاطی اشاره کرد [15-13].

استفاده از پلیمرها به عنوان حامل واکسن، نه تنها باعث محافظت در برابر شرایط اسیدی و پروتئازهای دستگاه گوارش خواهد شد، بلکه با رهایش آهسته و طولانی‌مدت آنتی‌ژن و عرضه آن به سیستم ایمنی بدن، پاسخ ایمنی مؤثر ایجاد خواهد شد. برای این منظور می‌توان از پلیمرهای زیست‌تخریب‌پذیر و زیست‌سازگار مختلفی استفاده نمود که به صورت طبیعی و یا مصنوعی تولید می‌شوند [16]. ماهیت پلیمر و خواص فیزیکوشیمیایی آن، تأثیر قابل‌توجهی بر اندازه نانوذرات و مشخصات رهایش آنها خواهد داشت. کیتوسان از جمله پلیمرهای طبیعی است که به دلیل نفوذپذیری زیاد و خصوصیات ویژه‌اش، در تحقیقات اخیر بسیار مورد استفاده قرار گرفته است [18-17]. روش‌های مختلفی برای فرمولاسیون نانوذرات وجود دارد که در این میان، روش ژلاسیون یونی برای ساخت نانوذرات از پلیمرهای طبیعی هیدروفیل مانند ژلاتین، آلژینات و کیتوسان کاربرد فراوانی دارد [20-19]. از آنجا که سم کلستریدیوم بوتولینوم  یکی از قوی‌ترین سموم کشنده باکتریایی برای انسان بوده و سبب بروز مسمومیت غذایی می‌گردد و از طرفی نیز واکسیناسیون تزریقی همواره مسائلی از قبیل واکنش‌های التهابی احتمالی و اثرات روانی تزریق واکسن در افراد جامعه را به دنبال دارد، دستیابی به روش ایمن‌سازی مناسبی از قبیل تجویز خوراکی برای مقابله با بیماری ناشی از توکسین کلستریدیوم ضروری به نظر می‌رسد.

هدف از این تحقیق، فرمولاسیون نانوذرات کیتوسان حاوی پروتئین نوترکیب ناحیه اتصالی نوروتوکسین بوتولینوم تیپ E و بررسی میزان ایمنی‌زایی آن پس از تجویز تزریقی و خوراکی به موش بود.

مواد و روش‌ها

در این مطالعه تجربی، کیتوسان با وزن مولکولی متوسط از شرکت Sigma-Aldrich (ساخت کشور آلمان)، سدیم تری پلی فسفات از شرکت Scharlau (ساخت کشور اسپانیا)، مواد شیمیایی، کیت و نشانگر‌های مولکولی از شرکت‌های مرک آلمان، سیناژن ایران، کیاژن آلمان و فرمنتاز آلمان تهیه شد. پروتئین نوترکیب ناحیه اتصالی نورورتوکسین بوتولینوم تیپ E از مرکز تحقیقات زیست‌شناسی دانشگاه جامع امام حسین (ع) تهیه شد. این مطالعه در سال 1393 و در مرکز تحقیقات زیست‌شناسی  دانشکده و پژوهشکده علوم پایه دانشگاه جامع امام حسین (ع)، صورت گرفت.

روش تهیه نانوذرات کیتوسان: برای تهیه نانوذرات کیتوسان از روش ژلاسیون یونی استفاده شد [22-20]. در این روش، کیتوسان در محیط اسیدی به علت باردار شدن گروه‌های آمینی موجود در آن به شکل پلی کاتیونی در آمده و می‌تواند به گروه‌های دارای بار منفی مانند سولفات و فسفات متصل شود. سدیم تری پلی فسفات، پلی آنیونی است که می‌تواند از راه برقراری نیروهای الکترواستاتیکی بین گروه‌های فسفات خود و گروه‌های آمینی کیتوسان به پلیمر متصل شود.

5 میلی‌لیتر محلول سدیم تری پلی فسفات با غلظت 1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر به صورت قطره قطره و در طول مدت زمانی یک ساعت، به 5/7 میلی‌لیتر محلول کیتوسان با غلظت 2 میلی‌گرم در میلی‌لیتر در اسید استیک 2% حاوی پروتئین، در حالی که بر روی همزن مغناطیسی قرار گرفته بود، اضافه شد. ایجاد کدورت در محلول، نشان از تشکیل ژل کیتوسانی دارد و تأیید‌کننده برقراری نیروهای الکترواستاتیکی بین گروه‌های فسفات سدیم تری پلی فسفات و گروه‌های آمینی کیتوسان است. پس از تشکیل نانوذرات، محلول کلوئیدی به مدت 40 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و با سرعت 13500 دور در دقیقه سانتریفوژ و سپس رسوب حاصله که شامل نانوذرات می‌باشد، جهت سیر مراحل آماده‌سازی و تجویز، در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. پس از تهیه نانوذرات، مقداری از آن را بر روی فویل آلومینیومی قرار داده و سپس اجازه داده شد تا در دمای اتاق خشک شود. از این نمونه، جهت تهیه تصویر SEM با دستگاه میکروسکوپ الکترونی روبشی مدل LEO-1455VP ساخت کشور انگلستان و متعلق به مؤسسه پژوهشی علوم و فناوری رنگ و پوشش استفاده شد. همچنین جهت بررسی اندازه نانوذرات از دستگاه DLS مدل Malvern ساخت کشور انگلستان متعلق به دانشگاه علوم پزشکی بقیه اله استفاده شد.

بررسی ایمنی‌زایی نانوذرات کیتوسان حاوی آنتی‌ژن: جهت بررسی ایمنی‌زایی، از پنج گروه موش استفاده شد. موش‌ها از بخش حیوانات آزمایشگاهی انستیتو پاستور کرج تهیه و ﺩﺭ ﺗﻤﺎﻣﻲ ﻣﺮﺍﺣﻞ،ﻛﺎﺭﻫﺎﻱ ﺍﻧﺠﺎﻡ ﺷﺪﻩ ﺑﺮ ﺭﻭﻱ ﺣﻴﻮﺍﻧﺎﺕ، ﻣﻄﺎﺑﻖ ﺑﺎ ﻗﻮﺍﻧﻴﻦ ﺗﻮﺻﻴﻪ ﺷﺪﻩ ﻛﺎﺭ ﺑﺎ ﺣﻴﻮﺍﻧﺎﺕ ﺁﺯﻣﺎ-ﻳﺸﮕﺎﻫﻲ ﺑﻮﺩ. هر گروه شامل 10 سر موش سوری ماده 8 هفته‌ای با وزن تقریبی 25-20 گرم بود. تجویز به صورت تزریقی و خوراکی صورت گرفت. به گروه اول، نانوذرات کیتوسان همراه با آنتی‌ژن به صورت خوراکی تجویز شد. به عنوان کنترل، گروه دوم تنها آنتی‌ژن و گروه سوم تنها نانوذرات (بدون آنتی‌ژن) را به صورت خوراکی دریافت کردند. گروه چهارم نیز نانوذرات کیتوسان همراه با آنتی‌ژن را به صورت تزریقی دریافت کردند. به عنوان کنترل، به گروه پنجم نانوذرات کیتوسان بدون آنتی‌ژن تزریق شد. در تجویز تزریقی، به هر موش نانوذرات کیتوسان حاوی 15 میکروگرم آنتی‌ژن به صورت زیر‌جلدی تزریق گردید. در همه گروه‌ها، تجویز خوراکی و تزریقی در چهار نوبت و با فواصل 14 روز انجام شد [23].

سنجش تیتر آنتی‌بادی ضد نوروتوکسین: در فواصل 8 روز پس از هر تجویز، از گوشه چشم حیوانات خونگیری به عمل آمد. نمونه‌های خون به داخل میکروتیوپ منتقل و پس از یک ساعت گرماگذاری در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، یک شب در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. سپس به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با سرعت1000 دور در دقیقه سانتریفوژ گردیده و سرم جدا شده، در دمای 20- درجه نگهداری شد. میزان آنتی‌بادی پلی‌کلونال IgG ضد نورتوکسین بوتولینوم سرم، به روش الایزا مورد بررسی و ارزیابی قرار گرفت [25-24].

چاهک‌های پلیت الایزا با پروتئین نوترکیب به غلظت 30 میکروگرم در میلی لیتر با استفاده از بافر کربنات/بی‌کربنات (6/9=pH) در طول شب در دمای 4 درجه سانتی‌گراد پوشانده شدند. دو چاهک جهت کنترل در نظر گرفته شد، داخل یکی از چاهک‌ها آنتی‌ژن و بافر کوتینگ و در چاهک دیگر، تنها بافر کوتینگ ریخته شد. چاهک‌ها با بافر PBST (PBS -0.05% Tween 20) شستشو و به منظور جلوگیری از واکنش‌های ناخواسته سرم و کانژوگه، 100 میکرولیتر بافر بلاکینگ (Blocking Buffer) (محلول شیرخشک 5 درصد در بافر PBST) ریخته و به مدت یک ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه گردید.

پس از شستشوی دوباره، سرم موش‌ها از رقت 100/1 به صورت سریال رقت دوگانه به چاهک‌ها اضافه گردید و میکروپلیت به مدت 1 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. پس از شستشو و خشک کردن، ابتدا رقت 2000/1 از کانژوگه (Anti mouse IgG HRP Conjugate) در PBST تهیه و از آن به میزان 100 میکرولیتر درون هر چاهک ریخته شد و در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد به مدت یک ساعت گرماگذاری گردید. پس از شستشو و خشک‌کردن، 100 میکرولیتر سوبسترا حاوی محلول (O- Phenilene Diamine)OPD  به هر چاهک اضافه و میکروپلیت در محل تاریکی نگهداری شد تا واکنش انجام گیرد. پس از تغییر رنگ محلول، واکنش با اسید سولفوریک 5/2 مولار متوقف گردید. بعد از توقف کامل واکنش، جذب نوری چاهک‌ها توسط دستگاه خواننده الایزا در طول موج 495 نانومتر خوانده شد. درون‌سنجی و میان‌سنجی برای بررسی وضعیت تکرارپذیری روش الایزا با استفاده از نمونه مثبت و منفی انجام گرفت.

چالش موش‌های ایمن‌شده: به منظور چالش موش‌های ایمن‌شده، ابتدا میزان LD₅₀ نوروتوکسین محاسبه شد. پس از آن، نوروتوکسین غیرفعال با استفاده از آنزیم تریپسین فعال ‌شد و سپس گروه‌های مختلف با دوزهای 50، 100، 500 و 1000 برابر LD₅₀ به صورت داخل صفاقی و با حجم نهایی 500 میکرولیتر مورد چالش قرار گرفتند [27-26]. شاخص LD₅₀ میزان سمیت یک ماده را مشخص نموده و نمایانگر حداقل میزان سم مورد نیاز برای کشتن 50% از جمعیت حیوان آزمایشگاهی مورد مطالعه می‌باشد.

تجزیه و تحلیل آماری: بررسی ﺗﻔﺎﻭﺕ‌ﻫﺎﻱ ﻣﻌﻨﻲ‌ﺩﺍﺭ ﺁﻣﺎﺭﻱ ﺩﺭ ﻣﻮﺭﺩ ﺗﻴﺘﺮ ﺁﻧﺘﻲ‌ﺑﺎﺩﻱ ﺍﺧﺘﺼﺎﺻﻲ ﺑﻮﺳﻴﻠﻪ ﺁﺯﻣﻮﻥ‌ﻫﺎﻱ T-test و Anova (Duncan)  ﻭ با استفاده از نرم‌افزارSPSS (SPSS, Inc. Chicago, IL)   نسخه 16 انجام شد.

نتایج

مشخصات نانوذرات کیتوسان تولیدی: نتایج دستگاه DLS بیانگر تولید نانوذرات کیتوسان با میانگین اندازه 285 نانومتر بود (نمودار 1). تصاویر بدست آمده نیز اندازه نانوذرات را کمتر از 300 نانومتر نشان می‌داد (شکل 2). بعد از بهینه‌سازی شرایط تهیه نانوذرات، میزان بارگذاری پروتئین در نانوذرات، حدود 91%0 بود.

نمودار 1- توزیع اندازه نانوذرات کیتوسان حاوی پروتئین نوترکیب ناحیه اتصالی BoNT/E

شکل 1- نانوذرات کیتوسان حاوی پروتئین نوترکیب ناحیه اتصالیBoNT/E (نانوذرات خشک شده بر روی فویل آلومینیومی، روی گرید قرار گرفته و پس از پوشش‌دهی با لایه طلا، با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی مدل LEO-1455VP تصویر‌برداری شد)

مقایسه تیتر IgG ضد نوروتوکسین بوتولینوم در گروه‌های مورد مطالعه: در آزمون الایزا میانگین و انحراف معیار جذب نوری کنترل مثبت 08/0±62/1 و کنترل منفی026/0± 123/0 تعیین شد. با استفاده از فرمولCV % =SD/X × 100 ، ضریب تغییرات برای کنترل مثبت و منفی به ترتیب 93/4 و 13/21 درصد بود. نتایج واکنش الایزا جهت سنجش میزان آنتی‌بادی IgG ضد نورتوکسین بوتولینوم نمونه‌های سرم جدا شده از مراحل مختلف خونگیری، در نمودارهای 2 تا 4 نشان داده شده است.

نمودار 2- میانگین تیتر آنتی‌بادی IgG ضد نورتوکسین بوتولینوم پس از تجویز تزریقی نانوذرات حاوی آنتی‌ژن

(نمونه‌های تست شامل نانوذرات حاوی آنتی‌ژن و نمونه کنترل شامل نانوذرات فاقد آنتی‌ژن است. فواصل زمانی تزریق در هر دو گروه تست و کنترل،  14 روز و زمان خونگیری، 8 روز پس از هر تزریق بود. میزان OD رقت 100/1 در تزریق اول، 58/0 و در تزریق چهارم 9/2 بود)

نمودار 3- میانگین تیتر آنتی‌بادی IgG ضد نورتوکسین بوتولینوم پس از تجویز خوراکی نانوذرات حاوی آنتی‌ژن

(نمونه‌های تست شامل نانوذرات حاوی آنتی‌ژن و نمونه کنترل شامل نانوذرات فاقد آنتی‌ژن است. تجویز در هر دو گروه  به صورت خوراکی و در فواصل زمانی 14 روز انجام شد. خونگیری، 8 روز پس از هر تجویز صورت گرفت. میزان OD رقت 100/1 در تجویز اول، 83/0 و در تجویز چهارم 8/2 بود)

نمودار 4- میانگین تیتر آنتی‌بادی IgG ضد نورتوکسین بوتولینوم پس از تجویز خوراکی آنتی‌ژن

(نمونه‌ شامل آنتی‌ژن به تنهایی است. تجویز به صورت خوراکی و در فواصل زمانی 14 روز انجام شد. خونگیری 8 روز پس از هر تزریق صورت گرفت. میزان OD رقت 100/1 در تجویز اول، 88/0 و در تجویز چهارم 1/3 بود)

افزایش تیتر آنتی‌بادی در گروهی که نانوذرات حاوی آنتی‌ژن را به صورت تزریقی دریافت کرده بودند در نمودار 2 دیده می شود. نمودار 3 بیانگر این است که تجویز خوراکی نانوذرات حاوی آنتی‌ژن نیز همانند گروهی که به صورت تزریقی، تجویز شده بودند، منجر به افزایش تیتر آنتی‌بادی IgG ضد نورتوکسین بوتولینوم در هر مرحله شده است. بر طبق آنچه که در نمودار 4 آورده شده است در گروهی که آنتی‌ژن به تنهایی و به صورت خوراکی تجویز شده بود، نیز در هر مرحله شاهد افزایش تیتر آنتی‌بادی بودیم به نحوی که بیشترین میزان OD مربوط به رقت 100/1 در تزریق چهارم و به میزان 1/3 بود.

نتایج بدست آمده از تیتر آنتی‌بادی نشان داد در موش‌های ایمن شده خوراکی با نانوذرات حاوی آنتی‌ژن، تیتر آنتی‌بادی IgG ضد نورتوکسین بوتولینوم به صورت بارزی بالاتر از گروه کنترل دریافت کننده نانوذره کیتوسان (01/0p<) بود (جدول1).

گروه دریافت‌کننده نانوذرات حاوی آنتی‌ژن به صورت تزریقی نیز به صورت معنی‌داری نسبت به گروه دریافت‌کننده نانوذره کیتوسان تزریقی (05/0p<) تیتر آنتی‌بادی IgG ضد نورتوکسین بوتولینوم بالاتری را نشان داد. تفاوت معنی‌داری بین تیتر آنتی‌بادی در گروه‌های تجویز خوراکی نانوذرات حاوی آنتی‌ژن و آنتی‌ژن به تنهایی خوراکی دیده نشد (05/0p<).

نتایج تیتر آنتی‌بادی نشان داد در موش‌های ایمن شده با نانوذرات حاوی آنتی‌ژن از طریق خوراکی افزایش تیتر آنتی‌بادی IgG ضد نورتوکسین بوتولینوم نسبت به موش‌های ایمن شده با نانوذرات حاوی آنتی‌ژن از طریق تزریقی تفاوت معنی‌داری نداشت (05/0p<).

جدول 1- آنالیز آماری پاسخ های هومورال (IgG تام ضد نورتوکسین بوتولینوم) در موش‌های ایمن شده با فرمولاسیون‌های مختلف

مقایسه چالش موش‌های مورد مطالعه با نوروتوکسین بوتولینوم: پس از اندازه‌گیری و بررسی میزان آنتی‌بادی IgG ضد نورتوکسین بوتولینوم در گروه‌های مختلف، موش‌های ایمن شده با نوروتوکسین فعال بوتولینوم تیپ E چالش شدند. نتایج چالش نشان داد گروهی که نانوذرات کیتوسان حاوی آنتی‌ژن و همچنین گروهی که آنتی‌ژن به تنهایی را به صورت خوراکی دریافت کرده بودند، توانستند 500 برابر دوز کشنده توکسین را تحمل کنند اما گروهی که نانوذرات حاوی آنتی‌ژن را به صورت تزریقی دریافت کرده بودند، علی‌رغم تولید آنتی‌بادی، نتوانستند حتی 50 برابر دوز کشنده را تحمل نمایند.

بحث

نوروتوکسین‌های باکتری کلستریدیوم بوتولینوم از طریق سطوح مخاطی نظیر روده، بافت ریه و یا محل زخم به گردش خون وارد شده و با ممانعت از آزاد شدن استیل کولین در پایانه‌های عصبی، سبب ایجاد فلج عضلانی پیش‌رونده می‌شوند که در موارد حاد، غالباً با مرگ همراه است [5-4]. نتایج بررسی‌های همه‌گیرشناسی نشان می‌دهد که بیشترین موارد ابتلاء به بوتولیسم در ایران مربوط به نوع E می‌باشد [28]. مشکلات موجود در تهیه واکسن‌ نظیر هزینه بالای تولید، لزوم استفاده از چندین سروتیپ مختلف، خطرات ناشی از کار با سویه‌های خطرناک فعال و در نهایت ورود پروتئین‌های ناخواسته به بدن در زمان ایمن‌سازی، موجب شده تا نسل جدید واکسن‌ها با استفاده از روش‌های مهندسی ژنتیک مورد توجه قرار گیرد [5].

یکی از راه‌های ایمنی‌زایی در بدن، مصرف واکسن‌های خوراکی است که امروزه مطالعات زیادی در این خصوص در جهان صورت گرفته است. برای طراحی واکسن‌های خوراکی باید فاکتورهایی مانند پایداری در اسیدیته بالای معده، پایداری و مقابله با پروتئازهای دستگاه گوارش، حلالیت واکسن‌ها در pH نزدیک به خنثی، نفوذپذیری از دیواره روده و غشاء پایه و ورود به جریان خون را در نظر داشت. پایدارسازی، هدایت و افزایش جذب واکسن‌های خوراکی به صورت تغییرات شیمیایی، مهار آنزیم‌های گوارشی و ازدیاد جذب گوارشی و استفاده از سیستم‌های انتقال و جذب موکوسی، ایده‌های مطرح در طراحی واکسن‌های خوراکی می‌باشند [29].

در سال‌های اخیر مطالعات زیادی بر روی استفاده از نانوذرات به عنوان حاملین واکسن صورت گرفته است [34-30]. نانوذرات زیست تخریب‌پذیر به دلیل فرمولاسیون متنوع، خواص رهایش حفظ‌شده، اندازه کوچک (کمتر از اندازه سلولی‌) و زیست‌سازگاری با سلول‌ها و بافت‌های مختلف بدن، گزینه مناسبی برای حمل واکسن می‌باشند. مزیت استفاده از نانوذرات پلیمری مانند کیتوسان این است که با کپسوله‌نمودن مولکول‌های فعال زیستی باعث حفاظت آنها در برابر تخریب هیدرولیتیک و آنزیمی می‌شوند [35].

تاکنون مقالات متعددی در مورد سیستم‎های تحویل خوراکی نانوذرات منتشر شده است که نتایج دلگرم‎کننده‌ای‎ نیز به همراه داشته است، اما این مشاهدات بر اساس اطلاعات بدست آمده در شرایط آزمایشی مختلف (مدل‎های درون‌تنی و برون‌تنی مختلف، پروتئین‎های مختلف، غلظت‎های متفاوت‏، پلیمرهای مختلف و …) بوده است، که در نتیجه سؤالاتی را به دنبال خواهد داشت. به عبارت دیگر  ، نمی‎توان نتایج مختلف را با هم مقایسه کرده و از بین آنها بهترین نانوذرات مناسب را بدست آورد و چون مطالعات بالینی کمی در مورد انسان صورت گرفته است، لذا نمی‎توان نتایج حاصل را به انسان تعمیم داد. با این حال، برخی از نتایج بدست‎آمده (مانند عوامل مؤثر بر جذب نانوذرات توسط سلول‎های روده) را می‎توان با یکدیگر مقایسه کرد و مورد بررسی قرار داد. اندازه نانوذرات و خواص سطح نانوذرات جزء معیارهای مهم و درجه اول هستند. تقریباً تمام محققین در مورد اندازه مطلوب (500 - 100 نانومتر) به یک اتفاق نظر واحد رسیده‎اند ولی در مورد خواص سطح مطلوب که متأثر از ماهیت پلیمر می‎باشد، اتفاق نظر وجود ندارد. بنابراین برای تحویل خوراکی پپتید و پروتئین‎های درمانی، انتخاب ماتریس پلیمری و بهینه‎نمودن انواع جدید آن (با توجه به نیازهای سلول)، از اهمیت ویژه‎ای برخوردار است [39-36].

با وجود مطالعات گسترده‌ای که در خصوص استفاده از کیتوسان به عنوان حامل دارو یا واکسن‌های مختلف علیه بیماری‌های گوناگون به صورت تزریقی و خوراکی صورت گرفته است [43-40]، تاکنون در خصوص استفاده از آن به صورت تزریقی و خوراکی برای پروتئین نوترکیب ناحیه اتصالی BoNT/E مطالعه‌ای انجام نشده است. در یک مطالعه، Ravichandran و همکاران نشان دادند که استفاده از کیتوسان در تجویز مخاطی (داخل بینی) واکسن سه‌گانه علیه سروتیپ‌های A، B و E باعث افزایش میزان تولید آنتی‌بادی می‌شود [44]. Jain و همکاران نیز با فرمولاسیون وزیکولی نانوذرات و تجویز خوراکی آنها، غلظت بالای sIgA و پاسخ ایمنی بهتری را مشاهده کردند [45].  Rabiee Rudsariو همکاران نیز با بررسی اثر ادجوانتی نانوذرات طلا بر ایمنی‌زایی BoNT/E نشان دادند که این نانوذرات می‌توانند همانند ادجوانت فروند، باعث تحریک سیستم ایمنی و در نتیجه بروز پاسخ شوند [46].

در پژوهش حاضر، نتایج الایزا نشان داد در هر سه گروه‌ مورد آزمون، میزان تیتر آنتی‌بادی IgG ضد نورتوکسین بوتولینوم در هر مرحله افزایش یافته است. افزایش تیتر آنتی‌بادی در گروهی که نانوذرات حاوی آنتی‌ژن را به صورت تزریقی دریافت کرده بودند، نشان داد نانوذرات توانسته‌اند به عنوان ادجوان عمل کرده و با تحریک مؤثر سیستم ایمنی، منجر به تولید IgG ضد نورتوکسین بوتولینوم شوند به طوری که بیشترین میزان OD مربوط به رقت 100/1 در تزریق چهارم و به میزان 9/2 بود (نمودار 2).

تجویز خوراکی نانوذرات حاوی آنتی‌ژن نیز همانند گروهی که به صورت تزریقی، تجویز شده بودند، منجر به افزایش تیتر آنتی‌بادی IgG ضد نورتوکسین بوتولینوم در هر مرحله شد. در این گروه بیشترین میزان OD مربوط به رقت 100/1 در تجویز چهارم و به میزان 8/2 بود که تفاوت معنی‌داری با گروهی که نانوذرات حاوی آنتی‌ژن را به صورت تزریقی دریافت کرده بودند، نداشت (نمودار 3).

در گروهی که آنتی‌ژن به تنهایی و به صورت خوراکی تجویز شده بود، نیز در هر مرحله شاهد افزایش تیتر آنتی‌بادی بودیم به نحوی که بیشترین میزان OD مربوط به رقت 100/1 در تجویز چهارم و به میزان 1/3 بود (نمودار 4). با توجه به این که در این گروه، تجویز خوراکی آنتی‌ژن به تنهایی منجر به تولید آنتی‌بادی به میزان قابل قبولی شده بود، انتظار می‌رفت استفاده از نانوذرات حاوی آنتی‌ژن و تجویز خوراکی آن، این اثر را تقویت نموده و در نتیجه با افزایش بسیار زیاد آنتی‌بادی مواجه باشیم. اما بر خلاف تصور، این میزان با کمی کاهش همراه بود که البته از لحاظ آماری معنی‌دار نبود (05/0p<).

نتیجه‌گیری

با در نظر گرفتن نتایج چالش می‌توان نتیجه گرفت، پروتئین نوترکیب ناحیه اتصالی نوروتوکسین بوتولینوم E در صورت تجویز خوراکی، قادر است سیستم ایمنی را به طور مؤثر تحریک نموده و پاسخ ایمنی مناسب ایجاد نماید و استفاده از نانوذرات همراه با این آنتی‌ژن، تأثیری در افزایش تولید آنتی‌بادی و در نتیجه ایمنی نخواهد داشت. در مقابل، تجویز تزریقی نانوذرات حاوی این آنتی‌ژن، علی‌رغم تولید آنتی‌بادی IgG ضد نورتوکسین بوتولینوم، توانایی حفاظت در برابر توکسین را نداشته و لذا روش مناسبی جهت تجویز نمی‌باشد. پیشنهاد می‌شود تأثیر نانوذرات پلیمری دیگری از جمله پلیمرهای سنتزی مثل PLGA در میزان ایمنی‌زایی این پروتئین نوترکیب و نیز زیر واحدهای اتصالی سروتایپ‌های دیگر از جمله A وB  نیز بررسی شود.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از مرکز تحقیقات زیست‌‌شناسی به واسطه فراهم آوردن امکانات لازم جهت انجام این تحقیق، تشکر و قدردانی می‌شود.

References

[1]       Valipour E, Moosavi ML, Amani J, Nazarian S. High level expression, purification and immunogenicity analysis of a protective recombinant protein against botulinum neurotoxin type E. World J Microbiol Biotechnol 2014; 30(6):1861-7.

[2]       Gargari SLM, Rasooli I, Valipour E, Basiri M, Nazarian S, Amani J, et al. Immunogenic and protective potentials of recombinant receptor binding domain and a C-terminal fragment of Clostridium botulinum neurotoxin type E. Iranian Journal of Biotechnology 2011; 9(3):181-7.

[3]       Smith LA, Byrne MP, Middlebrook JL, Lapenotiere H, Clayton MA, Brown DR. Recombinant vaccine against  botulinum neurotoxin. United States Patent 7214787, 2007.

[4]       Mansour AA, Mousavi SL, Rasooli I, Nazarian S, Amani J, Farhadi N. Cloning, high level expression and immunogenicity of 1163-1256 residues of C-terminal heavy chain of C. botulinum neurotoxin type E. Biologicals 2010; 38(2):260-4.

[5]       Smith LA. Botulism and vaccines for its prevention. Vaccine 2009; 27: D33-D39.

[6]       Przedpelski A, Tepp WH, Kroken AR, Fu Z, Kim JP, Johnson EA, et al. Enhancing the Protective Immune Response against Botulism. Infection and Immunity 2013; 81(7): 2638-44.

[7]       Kim MG, Park JY, Shon Y, Kim YB, Oh YK. Nanodelivery systems for mucosal vaccines. Recent Patents on Nanomedicine 2013; 3(2): 119-27.

[8]       Akagi T, Baba M, Akashi M. Biodegradable Nanoparticles as Vaccine Adjuvants and Delivery Systems: Regulation of Immune Responses by Nanoparticle-Based Vaccine. Adv Polym Sci 2012; 247: 31-64.

[9]       Vilar G, Tulla-Puche J, Albericio F. Polymers and Drug Delivery Systems. Current Drug Delivery  2012; 9 (4): 367-94.

[10]   Simerska P, Moyle PM, Olive C, Toth I. Oral vaccine delivery-new strategies and technologies. Curr Drug Deliv 2009; 6(4): 347-58.

[11]   Steffansen B, Nielsen CU, Brodin B, Eriksson AH, Andersen R, Frokjaer S. Intestinal solute carriers: an overview of trends and strategies forimproving oral drug absorption. Eur J Pharm Sci 2004; 2: 3-16.

[12]   Sinha V, Singh A, Kumar RV, Singh S, Kumria R, Bhinge J. Oral colon-specific drug delivery of protein and peptide drugs. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 2007; 24(1): 63-92.

[13]   Mestecky J, Moldoveanu Z, Michalek SM, Morrow CD, Compans RW, Schafer DP, et al. Current options for vaccine delivery systems by mucosal routes. J Con Rel 1997; 48: 243-57.

[14]   Galindo-Rodriguez SA, Allemann E, Fessi H, Doelker E. Polymeric nanoparticles for oral delivery of drugs and vaccines: a critical evaluation of in vivo studies. Crit Rev Ther Drug Carr Syst 2005; 22: 419-64.

[15]   Nandedkar TD. Nanovaccines: recent developments in vaccination. J Biosci 2009; 34(6): 1-9.

[16]   Rieux AD, Fievez V, Garinot M, Schneider YJ, Preat V. Nanoparticles as potential oral delivery systems of proteins and vaccines: A mechanistic approach. J Control Release 2006; 116(1): 1-27.

[17]   Makadia HK, Siegel SJ. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers 2011; 3: 1377-97.

[18]   Balthasar S, Michaelis K, Dinauer N, von BH, Kreuter J, Langer K. Preparation and characterisation of antibody modified gelatin nanoparticles as drug carrier system for uptake in lymphocytes. Biomaterials 2005; 26: 2723-32.

[19]   Zhao LM, Shi LE, Zhang ZL, Chen JM, Shi DD, Yang J, et al. Preparation and application of chitosan nanoparticles and nanofibers. Brazilian Journal of Chemical Engineering 2011; 28(3): 353-62.

[20]   Vaezifar S, RazaviSh, Golozar MA, Karbasi S, Morshed M, Kamali M. Effects of Some Parameters on Particle Size Distribution of Chitosan Nanoparticles Prepared by Ionic Gelation Method. J Clust Sci 2013; 24(2): 891-903.

[21]    Nesalin AJ, Smith AA. Preparation and evaluation of chitosan nanoparticles containing zidovudine. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences 2012; 7(1): 80-4.

[22]   Dustgani A, Vasheghani Farahani E, Imani M. Determination of the Optimum Conditions for Production of Chitosan Nanoparticles. Iranian Journal of Polymer science and thecnology 2007; 20(5): 457-67. [In Persian]

[23]   Hedrich H. The laboratory Mouse. 1^st edition, Italy, Elsevier academic press, 2004; pp. 526-141.

[24]   Crowther JR. The ELISA guidebook. Methods in molecular biology, Humana Press, New Jersey, 2001; pp. 115-301.

[25]   Schunk MK, Macallum GE. Applications and optimization of immunization procedures. Institute of Laboratory Animal Resources 2005; 241e57.

[26]   Clayton MA, Clayton JM, Brown DR, Middlebrook JL. Protective vaccination with a recombinant fragment of Clostridium botulinum neurotoxin serotype A expressed from a synthetic gene in Escherichia coli. Infect Immun 1995; 63(7): 2738-42.

[27]   Yu YZ, Li N, Wang RL, Zhu HQ, Wang S, Yu WY, et al. Evaluation of a recombinant Hc of Clostridium botulinum neurotoxin serotype F as an effective subunit vaccine. Clin Vaccine Immunol 2008; 15(12) :1819-23.

[28]   Shahcheraghi F, Nobari S, Masoumi Asl H, Aslani MM. Identification of botulinum toxin type in clinical samples and foods in Iran. Arch Iran Med 2013; 16(11): 642-6.

[29]   Honari H. Special Adjuvant for the Oral Vaccines and the Role of that in Passive Defense.
Passive Defense Quarterly 2011;(2):11-9. [Farsi]

[30]   Fujita Y, Taguchi H. Current status of multiple antigen-presenting peptide vaccine systems: Application of organic and inorganic nanoparticles. Fujita and Taguchi Chemistry Central Journal 2011; 5:48.

[31]   Nnamani PO, Scoles G, Krol S. Preliminary characterization of N-trimethylchitosan as a nanocarrier for malaria vaccine. J Vector Borne Dis 2011; 48: 224–30.

[32]   Bret D, Ulery BD, Kumar D, Ramer-Tait AE, Metzger DW, Wannemuehler MJ, et al. Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases. PLoS ONE 2011; 6(3): e17642.

[33]   Nazarian S, Gargari SL, Rasooli I, Hasannia S, Pirooznia N. A PLGA-encapsulated chimeric protein protects against adherence and toxicity of enterotoxigenic Escherichia coli. Microbiol Res 2014; 169(2-3): 205-12.

[34]   Jahantigh D, Saadati M, FasihiRamandi M, Mousavi M, Zand AM. Novel Intranasal Vaccine Delivery System by Chitosan Nanofibrous Membrane Containing N-Terminal Region of Ipad Antigen as a Nasal Shigellosis Vaccine, Studies in Guinea Pigs. Journal of Drug Delivery Science and Technology 2014; 24(1): 33-9.

[35]   Wang JJ, Zhao ZW, Xiao RZ, Xie T, Zhou GL, Zhan XR, et al. Recent advances of chitosan nanoparticles as drug carrier. Int J Nanomedicine 2011; 6: 765–74.

[36]   Rieux A, Fievez V, Garinot M, Schneider YJ, Préat V. Nanoparticles as potential oral delivery systems of proteins and vaccines: A mechanistic approach. Journal of Controlled Release 2006; 116: 1–27.

[37]   Bakhru SH, Furtado S, Morello AP, Mathiowitz E. Oral delivery of proteins by biodegradable nanoparticles. Adv Drug Deliv Rev 2013; 65(6): 811-21.

[38]   Yun Y, Cho YW, Park K. Nanoparticles for oral delivery: targeted nanoparticles with peptidic ligands for oral protein delivery. Adv Drug Deliv Rev 2013; 65(6): 822-32.

[39]   Herrera Estradaa LP,  Champion J A. Protein nanoparticles for therapeutic protein delivery. Biomater Sci 2015; 3: 787-99.

[40]   MohammadpourDounighi N, Eskandari R, Avadi MR, Zolfagharian H, Mir Mohammad Sadeghi A, Rezayat M. Preparation and in vitro characterization of chitosan nanoparticles containing Mesobuthuseupeus scorpion venom as an antigen delivery system. The Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases 2012; 18(1): 44-52.

[41]   Bowman K, Leong KW. Chitosan nanoparticles for oral drug and gene delivery. International Journal of Nanomedicine 2006; 1(2): 117-28.

[42]   Rajan M, Raj V. Potential Drug Delivery Applications of Chitosan Based Nanomaterials. International Review of Chemical Engineering 2013; 5(2): 145-55.

[43]   Chen F, Zhang ZR, Huang Y. Evaluation and modification of N-trimethyl chitosan chloride nanoparticles as protein carriers. International Journal of Pharmaceutics 2007; 336: 166-73.

[44]   Ravichandran E, Al-Saleem FH, Ancharski DM, Elias MD, Singh AK, Shamim M, et al. Trivalent vaccine against botulinum toxin serotypes A, B, and E that can be administered by the mucosal route. Infection and Immunity 2007; 75(6): 3043-54.

[45]   Jain S, Sharma RK, Vyas SP. Chitosan nanoparticles encapsulated vesicular systems for oral immunization: preparation, in-vitro and in-vivo characterization. J Pharm Pharmacol 2006; 58(3): 303-10.

[46]   Rabiee Rudsari A, Ebrahimi F, ArefpourTorabi MA. Study of Adjuvant Capability of the Gold Nanoparticles on the Immunity of Botulinum Neurotoxin Serotype E in Mouse. Journal of Advanced Defence Science and Technology 2013; 4(2): 87-92. [Farsi]