مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

مقاله پژوهشی

مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

دوره 15، فروردین 1395، 16-3

تأثیر جدایه‌های لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس برویس بر رشد آسپرژیلوس فلاووس و کاهش آفلاتوکسین B₁

علیرضا صادقی[1]، مریم ابراهیمی[2]، بلال صادقی[3]

دریافت مقاله: 17/6/94      ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 13/8/94    دریافت اصلاحیه از نویسنده: 4/11/94      پذیرش مقاله: 24/11/94

چکیده

زمینه و هدف: آفلاتوکسین B₁، سمی‌ترین نوع آفلاتوکسین و از قوی‌ترین مواد سرطان‌زای کبدی است که توسط برخی از گونه‌های جنس آسپرژیلوس تولید می‌گردد. کنترل موفق رشد این کپک می‌تواند گامی مهم در پیشگیری از سرطان باشد. این پژوهش با هدف ارزیابی تأثیر جدایه‌های لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس برویس بر رشد آسپرژیلوس فلاووس و کاهش آفلاتوکسین B₁ به اجرا درآمد.

مواد و روش‌ها: در این مطالعه آزمایشگاهی که در سال 1393 انجام شد، پس از شناسایی جدایه‌های لاکتیکی یک نمونه خمیرترش سنتی با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، تأثیر آنها بر رشد آسپرژیلوس فلاووس و توانایی آنها در کاهش آفلاتوکسین B₁ با کمک آزمون الایزای رقابتی مستقیم مورد بررسی قرار گرفت. همچنین، تأثیر زمان گرمخانه‌گذاری و تیمار حرارتی بر میزان باقیمانده آفلاتوکسین B₁ در حضور جدایه‌های مذکور ارزیابی شد. داده‌ها با استفاده از آزمون t مستقل و آنالیز واریانس یک‌طرفه و آزمون تعقیبی LSD مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

یافته‌ها: در پایان دوره گرمخانه‌گذاری، قطر کلنی آسپرژیلوس فلاووس در حضور لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، لاکتوباسیلوس برویس و نمونه کنترل به ترتیب 50/1، 46/3 و 00/9 سانتی‌متر بود. همچنین درصد باقیمانده آفلاتوکسین B₁ پس از گرمخانه‌گذاری در حضور لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در زمان‌های 0، 24 و 48 ساعت به ترتیب 60/50، 93/48 و 24/41% و در حضور لاکتوباسیلوس برویس به ترتیب 26/66، 40/64 و 61/55% بود. سلول مرده این جدایه‌ها در مقایسه با سلول زنده آنها به نحو مؤثرتری (05/0p<) توانست آفلاتوکسین B₁ را کاهش دهد.

نتیجه‌گیری: با توجه به قابلیت بالای باکتری‌های لاکتیکی مورد مطالعه در این پژوهش در کنترل رشد آسپرژیلوس فلاووس و کاهش آفلاتوکسین B₁، شاید بتوان از قابلیت نگهدارندگی زیستی آنها با هدف کاهش خطر ابتلاء به سرطان استفاده نمود.

واژه‌های‌کلیدی: لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، لاکتوباسیلوس برویس، الایزای رقابتی، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، آفلاتوکسین B₁

مقدمه

رشد کپک‌ها در فرآورده‌های مختلف، علاوه بر خسارت اقتصادی جبران‌ناپذیر، سبب تولید آفلاتوکسین‌ها شده و مشکلات عدیده‌ای را برای سلامت افراد جامعه در پی دارد. آلودگی مواد غذایی با آفلاتوکسین‌ها، یک مشکل رایج در مناطق گرمسیری و نیمه حاره‌ای دنیا به خصوص در کشورهای در حال توسعه می‌باشد [1]. آفلاتوکسین B₁ (AFB₁ Aflatoxin B₁;)، سمی‌ترین نوع آفلاتوکسین و از قوی‌ترین مواد سرطان‌زای کبدی محسوب می‌گردد که تا به امروز شناخته شده است. این مایکوتوکسین توسط تعداد زیادی از گونه‌های آسپرژیلوس تولید می‌شود [2]. استفاده از میکروارگانیسم‌هایی با اثر آنتاگونیسمی و بی‌ضرر (Generally Recognized as Safe; GRAS) برای کاهش رشد کپک آسپرژیلوس و متعاقباً کاهش آفلاتوکسین از مهم‌ترین روش‌های نگهداری زیستی مواد غذایی محسوب می‌شود [3]. با توجه به اثرات سلامتی‌بخش باکتری‌های اسید لاکتیک به عنوان ارگانیسم‌های پروبیوتیک، این باکتری‌ها مورد توجه بسیار زیادی قرار گرفته‌اند [4]. باکتری‌های اسید لاکتیک از قابلیت تولید ترکیبات ضد میکروبی نظیر اسیدهای آلی، دی‌استیل، استون، پراکسید هیدروژن، پپتیدهای ضد قارچی و باکتریوسین‌ها برخوردارند که در مقابل طیف وسیعی از عوامل بیماری‌زا و مولد فساد مؤثر می‌باشند [5].

Rejiniemon و همکاران [6] و Lavermicocca و همکاران ]8-7[، طی پژوهش‌هایی جداگانه به ترتیب نشان دادند که جدایه‌های لاکتیکی به دست آمده از مالت و خمیرترش، می‌توانند با تولید فنیل لاکتیک اسید و 4-هیدروکسی فنیل لاکتیک اسید به طور قابل‌ملاحظه‌ای رشد آسپرژیلوس، پنی‌سیلیوم و فوزاریوم را مهار کنند.

Tropcheva و همکاران [9] نیز طی پژوهشی مشخص ساختند که زیرگونه‌های مختلف لاکتوباسیلوس برویس جدا شده از ماست تخمیری بلغاری می‌توانند به طور کامل، رشد آسپرژیلوس آواموری و پنی‌سیلیوم کلاویفورم را مهار نموده و همچنین رشد آسپرژیلوس فلاووس و تولید آفلاتوکسین B₁ را به صورت معنی‌داری کاهش دهند. Fuchs و همکاران نیز دریافتند که لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس زیرگونه VM20 و بیفیدوباکتریوم بیفیدوم زیرگونه VM12 به ترتیب می‌توانند بیش از 95% اکراتوکسین و تا 80% پاتولین را کاهش دهند[10]. بر اساس یافته‌های محققین مذکور، عوامل مختلفی نظیر غلظت توکسین، جمعیت باکتری، میزان pH و زنده یا غیر زنده بودن باکتری در میزان اتصال سموم به دیواره سلولی آن مؤثر است.

در مطالعه Rezaei و همکارش [11]، توانایی لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در حذف آفلاتوکسین M₁ در کفیر با استفاده از الایزای رقابتی محرز گردید. Shetty و همکارش [12] و Karimi dastjerd و همکاران [13] نیز با استفاده از الایزای رقابتی نشان دادند که باکتری‌های اسید لاکتیک در حالت زنده و غیر زنده، توانایی کاهش انواعی از آفلاتوکسین‌ را دارند. اتصال باکتری‌های اسید لاکتیک به مایکوتوکسین‌ها از طریق اتصال دیواره سلولی باکتری با این سموم صورت می‌گیرد. پپتیدوگلیکان‌ باکتری با تمایل زیاد برای اتصال به ترکیبات خارجی باعث محافظت از باکتری در برابر آلودگی‌های خارجی می‌شود [14]. اتوکلاو نیز موجب دناتوره شدن پروتئین‌ها و آنزیم‌های موجود در پیکره باکتری شده و با تأثیر بر مکانیسم اتصال، سبب افزایش اتصالات پپتیدوگلیکان با سموم گردیده و به شکل معنی‌داری میزان حذف آفلاتوکسین را افزایش می‌دهد [13-12].

همواره استفاده از روش‌های نوین شناسایی و تعیین ویژگی‌های کاربردی باکتری‌های اسید لاکتیک در زیست‌بوم‌هایی که کمتر مورد مطالعه قرار گرفته‌اند امکان دستیابی به جدایه‌هایی با قابلیت‌های منحصر به فرد را افزایش داده است. امروزه با در نظر گرفتن محدودیت‌های روش‌های شناسایی مبتنی بر خصوصیات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی، شناسایی مولکولی این میکروارگانیسم‌ها از اعتبار بسیار بیشتری برخوردار می‌باشد. فرآورده‌های غذایی تخمیری نظیر خمیرترش، زیستگاه بسیار مناسبی برای باکتری‌های اسید لاکتیک محسوب می‌شوند. از فلور میکروبی خمیرترش به عنوان آغازگر اختصاصی و به دلایل خاصی نظیر بهبود آروما، طعم، زمان ماندگاری، ارزش تغذیه‌ای و یا حتی ایجاد خواص سلامتی‌بخش در فرآیند تخمیر نان استفاده می‌گردد [15]. هدف از انجام این پژوهش، جداسازی، شناسایی مولکولی و بررسی تأثیر جدایه‌های لاکتیکی غالب موجود در یک نمونه خمیرترش سنتی بر رشد آسپرژیلوس فلاووس و کاهش آفلاتوکسین B₁ بود.

مواد و روش‌ها

در این مطالعه آزمایشگاهی که در آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشکده صنایع غذایی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان از مهر تا اسفند 1393 انجام شد، تک پرگنه خالص جدایه‌های لاکتیکی مورد استفاده، از کشت خطی سوسپانسیون میکروبی یک نمونه خمیرترش سنتی که دارای قابلیت کاهش کپک‌زدگی نان بود در محیط کشت اختصاصی Agar MRS (Merck، آلمان) به دست آمد. پس از شناسایی اولیه جدایه‌های مورد نظر با استفاده از روش‌های بیوشیمیایی و مورفولوژی نظیر آزمون کاتالاز و رنگ‌آمیزی گرم، DNA تک پرگنه آنها، استخراج (Bioneer، AccuPrep K-3032، کره جنوبی) و توسط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction; PCR) دارای پرایمر اختصاصی، تکثیر و متعاقباً محصولات PCR، توالی‌یابی (MWG، آلمان) شد ]16[. شرایط واکنش این آزمون و پرایمرهای مورد استفاده در جدول 1 آمده است.

جدول 1- پرایمرهای اختصاصی مورد استفاده برای آزمون PCR شناسایی جدایه‌های لاکتیکی

واکنش PCR در حجم نهایی 50 میکرو لیتر، شامل یک واحد بافر استاندارد PCR، 25 پیکامول از هر پرایمر، مخلوطی از هر dNTP با غلظت 2/0 میلی‌مولار، 25 میکروگرم سرم آلبومین، Taq پلیمراز با فعالیت 5/2 واحد (Robust، فرانسه) و 2 میکرو لیتر DNA با غلظت 100 نانوگرم انجام شد. سپس در مرحله اول تکثیر، واسرشت DNA با شروع داغ در دمای 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 2 دقیقه، آغاز گشته و طی 35 چرخه با برنامه حرارتی 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، 61 درجه سانتی‌گراد به مدت 60 ثانیه و 68 درجه سانتی‌گراد به مدت 60 ثانیه ادامه یافت. سرانجام مرحله تکثیر انتهایی نیز به مدت 7 دقیقه در دمای 68 درجه سانتی‌گراد (Corbett، مدل CG1-96، استرالیا) خاتمه پیدا کرد ]16[.

پس از شناسایی جدایه‌های لاکتیکی، این جدایه‌ها در محیط MRS broth (Merck، آلمان)، دمای 37 درجه سانتی‌گراد و شرایط بی‌هوازی به مدت 24 ساعت کشت داده شدند. سپس باکتری‌ها به کمک سانتریفوژ یخچال‌دار (Sigma، مدل 3K30، آمریکا) در 4000 دور در دقیقه، 4 درجه سانتی‌گراد و به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ گردیده و پس از حذف سوپرناتانت در سرم فیزیولوژی حل شدند. عمل شستشو سه بار تکرار گردید و نهایتاً میزان جذب سرم حاوی باکتری به کمک اسپکتروفتومتر (PG instruments، مدل LTD T80، انگلستان) در nm600=OD اندازه‌گیری و تعداد باکتری در مقادیر مشخص تنظیم گردید [10]. آسپرژیلوس فلاووس (5004PTCC ) نیز پس از کشت بر روی محیط (PDA) Potato Dextrose Agar به مدت یک هفته در دمای 25 درجه سانتی‌‌گراد گرمخانه‌گذاری شد. در مرحله بعد، اسپورها از سطح پلیت جمع‌آوری و در بافر فسفات سالین با 7=pH به صورت سوسپانسیون درآورده شد و نهایتاً به کمک لام هموسایتومتر، میزان اسپور در هر میلی‌لیتر از سوسپانسیون معادل 10⁶ تنظیم گردید [9].

در ادامه به منظور ارزیابی تأثیر جدایه‌های لاکتیکی بر رشد آسپرژیلوس فلاووس، ابتدا یک درصد از سلول‌های شسته شده هر کدام از جدایه‌های لاکتوباسیلوس (CFU/ml 10⁸)، به محیط کشت MRS broth تلقیح گردید و به مدت 12 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری شد. سپس محیط مذکور با محیط PDA (45 درجه سانتی‌گراد) در حجم‌های مساوی، مخلوط و در پلیت ریخته شد. نمونه کنترل، شامل پلیت‌های آگاردار حاوی محیط کشت MRS broth و فاقد باکتری لاکتیکی بود. پس از انعقاد محیط کشت، 3 میکرولیتر از اسپور قارچ به صورت نقطه‌ای بر روی سطح و در قسمت مرکزی پلیت گذاشته شد. سپس پلیت‌ها در شرایط هوازی در دمای 25 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند و به صورت روزانه، قطر رشد کلنی کپک در آنها تا زمانی که کپک در نمونه کنترل به طور کامل سطح پلیت را پوشاند، اندازه‌گیری گردید [9].

آفلاتوکسین B₁ مورد استفاده در این پژوهش از شرکت Sigma (6636) به صورت ویال یک گرمی حاوی پودر توکسین خریداری شد. این پودر پس از افزودن به محلول بنزن و استونیتریل (Merck، آلمان) به نسبت 97:3 و تبخیر حلال، در بن‌ماری (بهداد، مدل 3505، ایران) و زیر هود شیمیایی در بافر فسفات با 7=pH حل گردید. برای تعیین توانایی جدایه‌های لاکتیکی در جذب آفلاتوکسینB₁  به هر میلی‌لیتر از ویال‌های حاوی توکسین، غلظت‌ مشخصی از سویه باکتریایی مورد نظر افزوده شد. سپس ویال‌ها در زمان‌های 0، 24 و 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در انکوباتور شیکردار (ژال، مدل JTSL20، ایران)، گرمخانه‌گذاری شدند. پس از گرمخانه‌گذاری، محلول بافر فسفات حاوی هر یک از دو جدایه باکتری و آفلاتوکسین به مدت 15 دقیقه در 10000 دور در دقیقه سانتریفوژ گردید تا سلول باکتری رسوب داده شود. سپس میزان آفلاتوکسین B₁ محلول فوقانی با روش الایزای رقابتی مستقیم (واکنش رقابتی بین آنتی‌ژن نمونه با آنتی‌ژن نشان‌دار شده در اتصال به آنتی‌بادی اختصاصی) به کمک کیت الایزای خریداری شده از شرکت Rocket international (آلمان) و دستگاه الایزا ریدر (Biotek، مدل S2000، آلمان) اندازه‌گیری و با نمونه کنترل (فاقد باکتری و حاوی همان مقدار آفلاتوکسین)، مقایسه گردید [17].

جهت بررسی توانایی سلول‌های غیر زنده در کاهش میزان آفلاتوکسین B₁، از تیمار حرارتی استفاده شد. برای انجام تیمار حرارتی، پس از برداشت سلول در مرحله رشد لگاریتمی و سانتریفوژ (4000 دور در دقیقه، 4 درجه سانتی‌گراد و به مدت 10 دقیقه)، 10 میلی‌لیتر محلول بافر فسفات حاوی غلظت مشخصی از جدایه‌های لاکتیکی تهیه شد و در دمای 121 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو (ایران طب زعیم، مدل 87419، ایران) شد، سپس تأثیر آن بر حذف آفلاتوکسین به روش مشابه بررسی گردید [18].

نتایج حاصل از این پژوهش با استفاده از آزمون‌های آماری t مستقل و آنالیز واریانس یک طرفه با مقایسات زوجی حداقل اختلاف معنی‌داری در سطح معنی‌داری 05/0 با سه تکرار و به کمک نرم‌افزار SAS نسخه 1/9 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت [19] و برای ترسیم نمودارها نیز از نرم‌افزار Microsoft Office Excel نسخه 2007 استفاده شد. لازم به توضیح است که در تیمارهایی که صرفاً تأثیر زمان گرمخانه‌گذاری در مورد هر کدام از جدایه‌های لاکتیکی به شکل مستقل در بازه‌های 0، 24 و 48 ساعت بر کاهش آفلاتوکسین مورد ارزیابی قرار گرفته بود و همچنین در تیمارهایی که تأثیر دو جدایه لاکتیکی و نمونه کنترل در هر یک از روزهای اول تا ششم پس از کشت به شکل مستقل بر رشد آسپرژیلوس سنجیده شده بود از روش آماری آنالیز واریانس یک طرفه استفاده شد. علاوه بر این، در مورد مقایسه دو جدایه لاکتیکی با یکدیگر به لحاظ قابلیت کاهش آفلاتوکسین در زمان‌های یکسان گرمخانه‌گذاری و همچنین مقایسه بین دو حالت زنده و مرده هر یک از دو جدایه لاکتیکی بر کاهش آفلاتوکسین نیز از آزمون t مستقل استفاده شد.

نتایج

ارزیابی اولیه تکثیر DNA تک پرگنه‌های حاصل از کشت خطی سوسپانسیون میکروبی خمیرترش سنتی با ژل الکتروفورز محصولات تولیدی، تأیید گردید (شکل 1).

شکل1- ژل الکتروفورز محصولات PCR دارای پرایمر اختصاصی با توالی هدف 500 جفت بازی جهت شناسایی پرگنه جدایه‌های لاکتیکی سوسپانسیون میکروبی خمیرترش سنتی (لاین 2 و 3) در مجاورت مارکر صد جفت بازی (لاین 1) و همچنین نمونه‌های کنترل مثبت حاوی DNA حاصل از کشت خالص Lactobacillus spp. (لاین 4) و کنترل منفی یا فاقد باکتری (لاین 5).

نتایج توالی‌یابی محصولات PCR دارای پرایمر اختصاصی از DNA این تک پرگنه‌ها نیز پس از مقایسه توالی‌های مذکور با داده‌های موجود در پایگاه‌های اطلاعاتی NCBI (National Center for Biotechnology Information) و RDP (Ribosomal Database Project) منجر به شناسایی لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس برویس شد.

نتایج تأثیر سویه‌های لاکتوباسیلوس برویس و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس به عنوان جدایه‌های لاکتیکی خمیرترش سنّتی بر رشد آسپرژیلوس فلاووس در جدول 2 نشان داده شده است.

جدول 2- مقایسه تأثیر دو جدایه لاکتیکی و نمونه کنترل بر رشد آسپرژیلوس فلاووس با تعیین قطر کلنی کپک (سانتی‌متر) در هر یک از روزهای اول تا ششم پس از کشت

حروف مشابه در هر ستون، نمایانگر عدم وجود اختلاف معنی‌دار در سطح 05/0 است (آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون مقایسات زوجی حداقل اختلاف معنی‌داری)

همان‌طور که ملاحظه می‌گردد هر دو جدایه مذکور دارای فعالیت بالای بازدارندگی علیه آسپرژیلوس فلاووس بودند. بررسی‌های آماری نشان داد که بین قطر کلنی آسپرژیلوس فلاووس در پلیت کنترل در مقایسه با پلیت‌های حاوی لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس برویس در هر یک از روزهای اول تا ششم رشد کپک، اختلاف معنی‌داری وجود داشت (05/0p<). همچنین بین تأثیر دو جدایه لاکتوباسیلوس برویس و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بر رشد آسپرژیلوس فلاووس از روز اول تا روز چهارم، اختلاف معنی‌داری مشاهده نشد اما در روزهای پنجم و ششم، اختلاف معنی‌دار بود (05/0p<)؛ میزان رشد کپک مذکور نیز در حضور جدایه لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس به طور معنی‌داری کمتر از رشد آن در حضور جدایه لاکتوباسیلوس برویس بود. لازم به ذکر است که در طول دوره بررسی شش روزه، قطر
کلنی آسپرژیلوس فلاووس در حضور جدایه لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس حداکثر 5/1 سانتی‌متر بود (جدول 2).

با توجه به تأکید تحقیقات صورت گرفته بر اهمیت تعداد باکتری‌های مورد نیاز برای ایجاد اتصال بهینه با آفلاتوکسین، در بخش دیگری از این پژوهش، تأثیر جمعیت‌های مختلف جدایه‌های لاکتیکی بر میزان آفلاتوکسین B₁ مورد ارزیابی قرار گرفت. بدین منظور، میانگین مقادیر جذب آفلاتوکسین مربوط به محلول‌های استاندارد و مقادیر جذب این نمونه‌ها بر میانگین جذب استاندارد صفر (نمونه فاقد آفلاتوکسین)، تقسیم و در عدد 100 ضرب گردید تا نتایج به صورت درصد بیان شود. نتایج نشان داد که جمعیت سلول باکتریایی، یک عامل اصلی جهت تأثیرگذاری بر میزان کاهش آفلاتوکسین می‌باشد (نمودار 1).

نمودار 1- درصد باقیمانده آفلاتوکسین B1 در حضور جدایه‌های لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس برویس

حروف مشابه در هر جدایه، نمایانگر عدم وجود اختلاف معنی‌دار در سطح 05/0 است (آنالیز واریانس یک‌طرفه و آزمون مقایسات زوجی حداقل اختلاف معنی‌داری)

درصد باقیمانده آفلاتوکسین B₁ با افزایش جمعیت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس برویس به ترتیب تا ‌10⁹×1 و CFU/ml‌10⁹×2 روندی نزولی داشت ولی پس از آن، تغییر معنی‌داری در کاهش مقدار آفلاتوکسین B₁ مشاهده نشد (05/0p<). بر اساس این نتایج، تعداد لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس برویس مورد نیاز برای اتصال بهینه با آفلاتوکسین B₁ و حذف آن، به ترتیب 10⁹×1 و CFU/ml‌10⁹×2 برآورد گردید.

پس از تعیین تعداد مناسب جدایه‌های لاکتیکی برای برقراری اتصال بهینه با آفلاتوکسین B₁ و حذف آن، تأثیر زمان گرمخانه‌گذاری بر میزان حذف آفلاتوکسین B₁ توسط جدایه‌های لاکتیکی مورد ارزیابی قرار گرفت. بر اساس نتایج به دست آمده در این پژوهش، میزان باقیمانده آفلاتوکسین B₁ پس از گرمخانه‌گذاری در دمای
 37 درجه سانتی‌گراد در هر یک از زمان‌های صفر (بلافاصله پس از افزودن جدایه و بدون گرمخانه‌گذاری)، 24 و 48 ساعت در حضور لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس به شکل معنی‌داری کمتر از نمونه حاوی جدایه لاکتوباسیلوس برویس بود (05/0P <). علاوه بر این، میزان باقی‌مانده آفلاتوکسین در حضور جدایه لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در زمان‌های 0، 24 و 48 ساعت به ترتیب 60/1±60/50، 34/1±93/48 و 45/1±24/41 درصد و میزان باقیمانده آفلاتوکسین در حضور جدایه لاکتوباسیلوس برویس در زمان‌های 0، 24 و 48 ساعت به ترتیب 16/1±26/66، 75/0±40/64 و 46/6±61/55% به دست آمد. بر این اساس، لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس از توانایی بیشتری در حذف آفلاتوکسین  B₁ در مقایسه با لاکتوباسیلوس برویس در هر یک از زمان‌های مورد بررسی برخوردار می‌باشد.

همان‌طور که مشاهده می‌شود در مورد هر کدام از دو جدایه لاکتیکی، بین میزان باقیمانده آفلاتوکسین B₁ در زمان صفر با میزان باقیمانده آفلاتوکسین پس از 24 ساعت گرمخانه‌گذاری، تفاوت معنی‌داری وجود نداشت (05/0p<). اما میزان باقیمانده آفلاتوکسین B₁ بعد از 48 ساعت گرمخانه‌گذاری در مقایسه با زمان صفر در هر کدام از دو جدایه لاکتیکی به شکل معنی‌داری متفاوت بود (05/0p<).

در بخش دیگری از این پژوهش، به منظور بررسی توانایی سلول‌های غیر زنده باکتریایی در کاهش میزان آفلاتوکسین، از تیمار حرارتی (اتوکلاو به مدت 15 دقیقه) استفاده شد. بر اساس نتایج به دست آمده، میزان باقیمانده آفلاتوکسین در حضور جدایه لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس از 60/1±60/50 به 49/1±23/31 درصد و در حضور جدایه لاکتوباسیلوس برویس از 16/1±26/66 به 32/1±30/43 درصد کاهش یافت (05/0p<).

بحث

امروزه آلودگی مواد غذایی با انواع مختلف قارچ‌های توکسین‌زا یکی از مشکلات جدی جامعه جهانی به شمار می‌آید. از این بین، آسپرژیلوس فلاووس از مهم‌ترین کپک‌های توکسین‌زاست که به علت قابلیت تولید کنیدی‌های آلرژی‌زا و آفلاتوکسین B₁ بسیار مورد توجه قرار گرفته است. آفلاتوکسین B₁ از طریق خوردن یا استنشاق، به بدن وارد و با عبور از روده کوچک، جذب خون شده و سپس در بافت‌های مختلف از جمله کبد، ریه، کلیه، سیستم‌های ایمنی، تناسلی، عصبی و گوارشی تجمع پیدا می‌کند. این آفلاتوکسین همچنین در کبد، تغلیظ گردیده و در نهایت سرطان کبد را به وجود می‌آورد [20]. روزانه میلیون‌ها نفر در کشورهای در حال توسعه به طرق مختلف در معرض مقادیر متفاوتی از انواع سموم قارچی قرار می‌گیرند که اهمیت استفاده از نگهدارنده‌های مناسب برای محافظت از این افراد را نشان می‌دهد [21]. اخیراً گزارشات متعددی درباره فعالیت‌های ضد قارچی باکتری‌های اسید لاکتیک و امکان استفاده از آنها به عنوان نگهدارنده‌های زیستی گزارش شده است [25-22].

بر اساس نتایج این پژوهش، لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس برویس جدا شده از یک نمونه خمیرترش سنتی ایران، توانایی مهار رشد آسپرژیلوس فلاووس را دارا هستند. Gerbaldo و همکاران [22]، در ارزیابی ویژگی‌های جدایه‌های لاکتوباسیلوس رامنوسوس L60 و  لاکتوباسیلوس فرمنتوم L23 دریافتند که آنها دارای طیف وسیعی از اثرات ضد قارچی در برابر آسپرژیلوس بوده و ضمن کاهش معنی‌دار رشد این کپک، میزان آفلاتوکسین B₁ تولید شده را نیز به ترتیب 8/99-5/97% و 100-5/27% کاهش دادند. همچنین Magnusson و Schnurer [26]، Tropcheva و همکاران [9] و Khanafari و همکاران [27] به ترتیب در مطالعاتی جداگانه، اثرات ضد قارچی لاکتوباسیلوس کورینی‌ فورمیس، لاکتوباسیلوس برویس و لاکتوباسیلوس پلانتاروم را نشان دادند. تولید اسیدهای آلی، پراکسید هیدروژن، دی استیل و پپتیدهای زیست‌فعال از دلایل بروز اثرات ضد قارچی این باکتری‌ها به شمار می‌آید. در برخی منابع نیز فعالیت ضد قارچی باکتری‌های اسید لاکتیک به اثر سینرژیستی این ترکیبات نسبت داده می‌شود [22].

باکتری‌های اسید لاکتیک علاوه بر مهار رشد قارچ‌های توکسین‌زا، توانایی اتصال به توکسین‌هایی نظیر آفلاتوکسین B₁ و حذف آنها را نیز دارند. باید در نظر داشت که جمعیت سلول باکتریایی، یکی از عوامل مؤثر در کاهش آفلاتوکسین B₁ است. لذا می‌بایست برای محافظت مصرف کننده در برابر آفلاتوکسین B₁، جمعیت مناسبی از آن را در رژیم غذایی مورد استفاده قرار داد.

نتایج تحقیق حاضر نشان داد که جمعیت باکتریایی لازم برای حذف معنی‌دار آفلاتوکسین توسط لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، CFU/ml ‌10⁹ و در مورد لاکتوباسیلوس برویس، CFU/ml10⁹×2 می‌باشد. Kabak و Var [28]، مشخص نمودند که جمعیت سلول باکتریایی، مهم‌ترین عامل جهت تأثیرگذاری بر میزان کاهش آفلاتوکسین است. Karimi dastjerd و همکاران [13] نیز میزان مؤثر جمعیت باکتریایی لاکتوباسیلوس‌های جدا شده از ماست‌های سنتی ایران برای حذف آفلاتوکسین B₁ را  CFU/ml‌10⁹ مشخص کردند. همچنین در پژوهش دیگری، Bueno و همکاران [29] دریافتند که در حضور CFU/ml 10⁸×2 از زیر گونه‌های مختلف لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، دامنه کاهش آفلاتوکسین B₁ از 4/25 تا 8/42% متغیر است. Guevara-Gonzalez [30] نیز نشان داد که در حضور CFU/ml 10⁸×2 از جدایه‌های لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، لاکتوباسیلوس پلانتاروم و لاکتوباسیلوس کازئی، دامنه حذف آفلاتوکسین B₁ از 13% تا 42% متغیر است. البته باید در نظر داشت علاوه بر جمعیت باکتریایی، مقدار توکسین، دمای گرمخانه‌گذاری و pH نیز در میزان جذب و کاهش آفلاتوکسین تأثیر دارند [30].

بر اساس نتایج این پژوهش، میزان باقی‌مانده آفلاتوکسین B₁ در هر یک از زمان‌های 0، 24 و 48 ساعت گرمخانه‌گذاری در حضور  لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس کمتر از نمونه‌های حاوی لاکتوباسیلوس برویس بود. همچنین با گذشت زمان گرمخانه‌گذاری، تفاوت معنی‌داری در حذف آفلاتوکسین نسبت به زمان صفر در خصوص هر کیک از دو جدایه لاکتیکی مذکور مشهود بود. محققین مختلفی [32-31، 13] با بررسی توانایی اتصال و کاهش آفلاتوکسین توسط برخی از لاکتوباسیل‌های جدا شده از محصولات تخمیری نشان دادند که با گذشت زمان گرمخانه‌گذاری، جذب آفلاتوکسین  توسط سلول‌های زنده افزایش می‌یابد که با نتایج تحقیق حاضر، مطابق دارد. بر اساس نتایج این محققین، به موازات افزایش زمان گرمخانه‌گذاری و به واسطه افزایش تولید متابولیت‌هایی نظیر اگزوپلی‌ساکاریدها که در جذب مایکوتوکسین مؤثر هستند قابلیت کاهش آفلاتوکسین نیز افزایش می‌یابد. این در حالی است که نتایج تحقیق حاضر با نتایج برخی پژوهش‌ها [34-33، 30] در تناقض می‌باشد. در این پژوهش‌ها مشخص شده است که زمان گرمخانه‌گذاری تأثیری بر کاهش میزان آفلاتوکسین ندارد.

 بر اساس نتایج این پژوهش‌ها، کاهش آفلاتوکسین به واسطه واکنش آن با لایه پوشش باکتری و بدون تغییر شیمیایی توکسین صورت می‌گیرد و لذا ضرورتی برای ورود آفلاتوکسین B₁  به سلول و تبدیل متابولیکی آن وجود ندارد. بنابراین نقش اصلی در حذف آفلاتوکسین به ترکیبات دیواره سلولی باکتری‌ نسبت داده می‌شود [30]. از طرف دیگر، تفاوت در ساختار دیواره سلولی باکتری [28]، غلظت اولیه آفلاتوکسین مورد بررسی [35]، جمعیت باکتری مورد نظر، pH [10]، دمای گرمخانه‌گذاری و نوع جدایه [36] نیز در این زمینه اهمیت دارند.

برای مطالعه بهتر مکانیسم حذف آفلاتوکسین B₁، در بخش دیگری از این پژوهش، تأثیر سلول‌های زنده و مرده با یکدیگر مقایسه گردید. نتایج به دست آمده، تفاوت معنی‌دار بین این دو حالت را نشان داد. این نتایج با نتایج پژوهش‌هایی [34-33] که بین توانایی باکتری‌ها در اتصال با توکسین در دو حالت زنده و مرده تفاوتی مشاهده نکردند، در تناقض بوده و با نتایج برخی پژوهش‌ها
[35، 30، 12] هم‌خوانی دارد. ترکیبات مؤثر در اتصال آفلاتوکسین B₁ به دیواره سلول باکتری هنوز کاملاً شناخته نشده است اما به نظر می‌رسد که کربوهیدرات‌های غنی از مانو پروتئین‌ها یا گلیکان‌ها در این فرایند نقش داشته باشند. تیمار حرارتی نیز ممکن است سبب دناتوره شدن پروتئین و شکل‌گیری هزاران واکنش بینابینی در دیواره سلولی شود. حرارت همچنین می‌تواند با انحلال برخی از واحدهای مانانی سطح سلول سبب افزایش نفوذپذیری دیواره سلولی گردیده و در نهایت افزایش دسترسی جایگاه‌های اتصالی و حذف بیشتر آفلاتوکسین را در پی داشته باشد [35، 30، 12].

از یک سو به علت قابلیت نگهدارندگی زیستی باکتری‌های اسید لاکتیک که عموماً در فرآوری محصولات غذایی تخمیری به عنوان کشت آغازگر مورد استفاده قرار می‌گیرند و از طرف دیگر، به دلیل نیاز به معرفی جایگزین‌های ایمن و طبیعی برای نگهدارنده‌های سنتزی و آنتی‌بیوتیک‌ها، همواره تعیین ویژگی‌های ضد میکروبی بالقوه جدایه‌های لاکتیکی حاصل از محصولات تخمیری سنتی مورد توجه بوده است. بر اساس نتایج این پژوهش، تأثیر بازدارنده دو جدایه لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس برویس بر رشد آسپرژیلوس فلاووس و کاهش میزان آفلاتوکسین B₁ مورد تأیید قرار گرفت. بر این اساس، باکتری‌های مذکور از قابلیت بالایی برای استفاده به عنوان کشت آغازگر و یا کشت همراه در فرآوری محصولات تخمیری برخوردار بوده و می‌توان از قابلیت نگهدارندگی زیستی آنها با هدف کاهش خطر ابتلاء به سرطان‌های ناشی از این مایکوتوکسین نیز استفاده نمود. جالب‌تر این‌که حتی در صورت اعمال فرآیند استریلیزاسیون بر محصولات حاوی این باکتری‌ها، تأثیر آنها بر کاهش آفلاتوکسین افزایش یافته و نشان می‌دهد که قابلیت استفاده از آنها به منظور کاهش آفلاتوکسین، به این مواد غذایی محدود نمی‌گردد. کاهش رشد آسپرژیلوس فلاووس و کاهش میزان آفلاتوکسین توسط جدایه‌های مورد مطالعه در این پژوهش از جنبه افزایش زمان ماندگاری محصولات تخمیری و ارتقاء ایمنی مصرف‌کنندگان این فرآورده‌ها نیز از اهمیت بسزایی برخوردار است. البته به منظور استفاده از جدایه‌های لاکتیکی مذکور به عنوان کشت همراه در فرآوری محصولات تخمیری، قاعدتاً باید اثر متقابل آنها با کشت آغازگر اصلی به واسطه تأثیر بر خصوصیات فرآورده تولیدی و همچنین اثر سینرژیستی یا آنتاگونیسمی آنها مد نظر قرار گیرد.

نتیجه‌گیری

در این پژوهش پس از تأیید شناسایی لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس برویس جدا شده از یک نمونه خمیرترش سنتی با استفاده از PCR دارای پرایمر اختصاصی، تأثیر این جدایه‌ها بر رشد آسپرژیلوس فلاووس و توانایی آنها در کاهش میزان آفلاتوکسین B₁ تحت تأثیر زمان گرمخانه‌گذاری (0، 24 و 48 ساعت) و تیمار حرارتی (اتوکلاو به مدت 15 دقیقه) به کمک آزمون الایزای رقابتی مستقیم مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج به دست آمده جدایه‌های لاکتیکی شناسایی شده بر کاهش رشد آسپرژیلوس فلاووس و کاهش آفلاتوکسین B₁ مؤثر بودند. لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس از قابلیت بیشتری در کاهش میزان آفلاتوکسین B₁ برخوردار بود و سلول اتوکلاو شده این جدایه‌ها نیز در مقایسه با سلول زنده آنها به نحو مؤثرتری توانست آفلاتوکسین B₁ را کاهش دهد. افزایش میزان حذف آفلاتوکسین طی گرمخانه‌گذاری، به تفاوت ساختار دیواره سلولی باکتری‌، غلظت اولیه آفلاتوکسین مورد بررسی، جمعیت باکتری مورد نظر، pH، دمای گرمخانه‌گذاری و نوع باکتری بستگی دارد. بر اساس نتایج این پژوهش می‌توان از دو جدایه مورد مطالعه به عنوان آغازگر میکروبی در فرآوری مواد غذایی تخمیری با هدف کنترل رشد آسپرژیلوس فلاووس و کاهش آفلاتوکسین B₁ موجود در چنین فرآورده‌هایی و متعاقباً کاهش خطر ابتلاء به سرطان ناشی از محصولات آلوده با این مایکوتوکسین استفاده نمود.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان که بخشی از هزینه‌های اجرایی این پژوهش را تأمین نمودند، قدردانی می‌گردد.

References

[1] Gupta RC. Aflatoxins; ochratoxins and citrinins. Repprod Toxicol 2011; 55(1): 753-61.

[2]  Wild CP, Montesano R. A model of interaction: aflatoxins and hepatitis viruses in liver cancer aetiology and prevention. Cancer Lett 2009; 286(1): 22-8.

[3] Silva JF, Peluzio JM, Prado G, Madeira JE, Silva Mo, de Morais Pb, et al. Use of probiotics to control aflatoxin production in peanut grains. Sci entific World J 2015; 2015; 959138.

[4] Dalie DKD, Deschamps AM, Richard-Forget F. Lactic acid bacteria; potential for control of mould growth and mycotoxins: a review. Food Control 2010; 21(4): 370-80.

[5] Galvez A, Abriouel H, Lucas Lopez R, Ben Omar N. Bacteriocin-based strategies for food biopreservation. Inter J Food Microbiol 2007; 120(1-2): 51-70.

[6] Rejiniemon TS, Hussain RR, Rajamani R. In-vitro functional properties of Lactobacillus plantarum isolated from fermented ragi malt. S Ind J Biol Sci 2015; 1(1): 15-23.

[7] Lavermicocca P, Valerio F, Evidente A, Lazzaroni S, Corsetti A, Gobbetti M. Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B. Appl Microbiol 2000; 66(9): 4084-90.

[8] Lavermicocca P, Valerio F, Visconti A. Antifungal activity of phenyllactic acid against molds isolated from bakery products. Appl Environ Microb 2003; 69(1): 634-40.

[9] Tropcheva R, Nikolova D, Evstatieva Y, Danova S. Antifungal activity and identification of Lactobacilli, isolated from traditional dairy product “katak”. Anaerobe 2014; 28(1): 78-84.

 [10] Fuchs S, Sontag G, Stid R, EhrlichV, Kundi M, Knasmüller S. Detoxification of patulin and ochratoxin A, two abundant mycotoxins, by lactic acid bacteria. Food Chem Toxicol 2008; 46(4): 1398-407.

[11] Rezaei M, Marhamatizadeh MH. Study on chicory effect of aflatoxin in kefir probiotic contain chicory and Lactobacillus acidophilus or Bifidobacterium bifidum. B Environ Pharmacol Life Sci 2015; 4(4): 18-22.

[12] Shetty PH, Jespersen L. Saccharomyces cerevisiae and lactic acid bacteria as potential mycotoxin decontaminating agents. Trends Food Sci Tech 2006; 17(2): 48-55.

[13] Karimi dastjerd A, Tajabadi Ebrahimi M, Sharifan A, Nikoopour H, Hashemi M. Binding ability of some Iranian native Lactobacillus spp. to aflatoxin M. J Microbial Biotech 2012; 4(12): 7-12. [Farsi]

[14] Guan R, Wang Q, Sundberg EJ, Mariuzza RA. Crystal structure of human peptidoglycan recognition protein S (PGRP-S) at 1.70 A resolution. J Mol Biol 2005; 347(4): 683-91.

[15] Katina K. Sourdough a tool for the improved flavour, texture and shelf-life of wheat bread. VTT publication 569, VTT technical research center of Finland. 2005; pp: 13-41.

[16] Ferchichi M, Valcheva R, Vost H, Onno B, Dousset X. Molecular identification of the microbiota of french sourdough using temporal temperature gradient gel electrophoresis. Food Microbiol 2007; 24(7-8): 678-86.

[17] Hernandez-Mendoza A, Garcia HS, Steele JL. Screening of Lactobacillus casei strains for their ability to bind aflatoxin B₁. Food Chem Toxicol 2009; 47(6): 1064-8.

[18] Shetty PH, Hald B, Jespersen L. Surface binding of aflatoxin B₁ by Saccharomyces cerevisiae strains with potential decontaminating abilities in indigenous fermented foods. Int J Food Microbiol 2007; 113(1): 41-6.

[19] SAS Institue. 2003. SAS Statistics and Graphics Guide, Release 9.1. SAS Institute, Cary, North Carolina 27513, USA.

 [20] Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global cancer statistics, 2002. Cancer J Clin 2005; 55(2): 74-108.

[21] William JH, Phillips TD, Jolly PE, Stiles JK, Jolly CM, Aggarwal D. Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and intervention. Am Soc Clin Nutr 2004; 80(1): 1106-22.

 [22] Gerbaldo GA, Barberis C, Pascual L, Dalcero A, Barberis L. Antifungal activity of two Lactobacillus strains with potential probiotic properties. FEMS Microbiol Lett 2012; 332(1): 27-33.

[23] Delavenne E, Ismail R, Pawtowski A, Mounier J, Barbier G, Le Blay G. Assessment of lactobacilli strains as yogurt bioprotective cultures. Food Control 2012; 30(2013): 206-13.

[24] El-Mabrok ASW, Hassan Z, Mokhtar AM, Hussin KM. Antifungal activity of Lactobacillus plantarum LAB-C5 and LAB-G7 isolated from Malaysian fruits. Acta Biol Malaysiana 2013; 2(1): 22-30.

[25] Oliveira PM, Zannini E, Arendt EK. Cereal fungal infection, mycotoxins, and lactic acid bacteria mediated bioprotection: from crop farming to cereal products. Food Microbiol 2014; 37(1): 78-95.

[26] Magnusson J, Schnürer J. Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis strain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound. Appl Environ Microbiol 2001; 67(1): 1-5.

[27] Khanafari A, Soudi H, Miraboulfathi M. Biocontrol of Aspergillus flavus and aflatoxin B₁ production in corn. Iranian J Environ Health Sci Eng 2007; 4(3): 163-8.

[28] Kabak B, Var I. Factors affecting the removal of aflatoxin M₁ from food model by Lactobacillus and Bifidobacterium strains. J Environ Sci Health 2008; 43(7): 617-24.

[29] Bueno D, Casale C, Pizzolitto R, Salvano M, Oliver G. Physical adsorption of aflatoxin B₁ by lactic acid bacteria and Saccharomyces cerevisiae: a theoretical model. J Food Protect 2007; 70(7): 2148-54.

[30] Guevara-Gonzalez RG. Aflatoxins, biochemistry and molecular biology, InTech, Croatia. 2011; pp 323-46.

[31] El-Khoury A, Atoui A, Yaghi J. Analysis of aflatoxin M₁ in milk and yogurt and AFM₁ reduction by lactic acid bacteria used in Lebanese industry. Food Control 2011; 22(10): 1695-9.

[32] Peltonen K, El-Nezami, H, Haskard C, Ahokas J, Salminen S. Aflatoxin B₁ binding by dairy strains of lactic acid bacteria and bifidobacteria. Dairy Sci 2001; 84(10): 2152-6.

[33] Haskard CA, El-Nezami HS, Kankaanaa PE, Salminen S, Ahokas JT. Surface binding of aflatoxin B₁ by lactic acid bacteria. Appl Environ Microbiol 2001; 67(7): 3086-91.

 [34] El-Nezami HS, Kankaanp P, Salminen SJ, Ahokas JT. Ability of dairy strains of acid lactic bacteria to bind food carcinogens. Food Chem Toxicol 1998; 36(4): 321-6.

[35] Lee Y, El-Nezami H, Haskard C, Gratz S, Puong K, Salminen S, et al. Kinetics of adsorption and desorption of Aflatoxin B₁ by viable and nonviable bacteria. J Food Protect 2003; 66(3): 426-30.

[36] kateh Shamshiri M, Mohammadi Sani A, Sarabi Jamab M, Rahnama Vosough P, Mehraban Sangatash M. Biodetoxification of aflatoxin M₁ using Lactobacillus acidophilus in simulated gastric model. Iran Food Sci Tech Res J 2014; 10(3): 204-10. [Farsi]