مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

مقاله پژوهشی

مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

دوره 15، دی 1395، 916-903

تعیین گونه انگل لیشمانیا و فون پشه‌خاکی‌های شهرستان زیرکوه استان خراسان جنوبی

امین بهارشاهی[1]، علیرضا کیخسروی[2]، محمودرضا بهروان[3]

دریافت مقاله: 4/8/95        ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 22/8/95    دریافت اصلاحیه از نویسنده: 1/10/95      پذیرش مقاله: 4/10/95

چکیده

زمینه و هدف: بیماری لیشمانیازیس از مهم‌ترین بیماری‌های ناقل-زاد مشترک بین انسان و حیوان است که توسط گونه‌های پشه‌خاکی به انسان انتقال می‌یابد. مطالعه حاضر با هدف تعیین گونه پشه‌خاکی‌های شهرستان زیرکوه و تعیین گونه انگل لیشمانیا در پشه‌خاکی‌های این شهرستان با روش RFLP-PCR انجام شد.

مواد و روش‌ها: صید پشه‌خاکی‌ها در تابستان 1394 با استفاده از تله چسبان انجام شد و نمونه‌های ماده صیدشده، ابتدا مونته شده و تعیین گونه شدند. پس از شناسایی پشه‌خاکی‌ها، DNA انگل جدا شد و سپس با استفاده از تکثیر ژن ITS-1 و با استفاده از روش RFLP-PCR اقدام به شناسایی انگل موجود در پشه‌خاکی‌ها گردید.

یافته‌ها: در این مطالعه از مجموع 460 عدد پشه‌خاکی جمع‌آوری‌شده، 380 پشه‌خاکی مربوط به مناطق حیوانی و 80 پشه‌خاکی مربوط به مناطق انسانی بودند. از مجموع 110 پشه‌خاکی ماده، Phlebotomus sergenti با فراوانی 42/59% و Sergentomyia sintoni با فراوانی 25/7% گونه غالب منطقه گزارش شدند، همچنین در قسمت جداسازی انگل از پشه‌خاکی‌ها، یک مورد پشه‌خاکی Ph. sergenti آلوده به انگل شناسایی شد که با استفاده از تکنیک RFLP-PCR و روش هضم آنزیمی، انگل Leishmania tropica تشخیص داده شد.

نتیجه‌گیری: با توجه به حضور انگل L. tropica در منطقه و آلودگی پشه‌خاکی‌های Ph. sergenti به این انگل، شبکه بهداشت این شهرستان باید مراقبت‌های لازم در جهت کنترل بیماری لیشمانیازیس جلدی را مدنظر قرار دهد.

واژه‌های کلیدی: پشه‌خاکی، لیشمانیا، لیشمانیوز جلدی، زیرکوه

مقدمه

لیشمانیازیس از مهم‌ترین بیماری‌های انگلی است که سازمان بهداشت جهانی (WHO) آن را جزو شش بیماری مهم مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری دنیا قرار داده و بخش بیماری‌های گرمسیری آن (TDR)، بیماری لیشمانیازیس را در گروه بیماری‌های نوپدید و کنترل‌نشده طبقه‌بندی کرده است [2-1]. لیشمانیازیس هم‌اکنون در 98 کشور در قاره‌های آفریقا، آسیا، اروپا، آمریکای شمالی و جنوبی وجود دارد و 350 میلیون نفر در معرض خطر این بیماری قرار دارند. به‌طورکلی، 12 میلیون نفر در سرتاسر جهان به این بیماری مبتلا هستند که شامل افراد علامت‌دار و بی‌علامت می‌گردد [3]. لیشمانیازیس جلدی شایع‌تر از انواع دیگر بوده به‌طوری‌که سالانه حدود 5/1 میلیون مورد جدید آن گزارش می‌شود. بیش از 90 درصد این موارد در افغانستان، الجزایر، ایران، عراق، عربستان سعودی، سوریه، برزیل و پرو رخ می دهد [4].

عامل بیماری لیشمانیازیس، یک انگل داخل سلولی اجباری است که ماکروفاژهای دخیل در سیستم ایمنی بدن را مورد حمله قرار می‌دهد. این انگل تاژک‌دار متعلق به جنس لیشمانیا، خانواده تریپانوزماتیده و زیرشاخه کینتوپلاستیدا است که برحسب محیط زندگی خود به دو شکل بی‌تاژک (آماستیگوت) و تاژک‌دار (پروماستیگوت) دیده می‌شود [8-5]. ناقل بیماری، دوبالان خانواده Psycodidae (جنس Phlebotomus در دنیای قدیم و Lutzomyia در دنیای جدید)، معروف به پشه‌خاکی، می‌باشند. 81 گونه و زیرگونه از پشه‌خاکی در انتقال حدود 30 گونه انگل لیشمانیا به پستانداران دخیل هستند [9، 1]. در ایران تاکنون 42 گونه پشه‌خاکی از 2 جنس فلبوتوموس و سرژنتومیا شناسایی شده است. ناقلین این بیماری در کانون شمال غرب کشور پشه‌خاکی‌های فلبوتوموس پرفیلیوی (Phlebotomus perfiliewi) و فلبوتوموس کاندلاکی (Ph. kandelakii)، در کانون جنوب کشور فلبوتوموس الکساندری (Ph. alexandri)، فلبوتوموس ماژور (Ph. major) و فلبوتوموس کشیشیانی (Ph.keshishiani)، در کانون‌های مرکز کشور فلبوتوموس پاپاتاسی (Ph. papatasi) و در کانون شرق کشور فلبوتوموس سرژنتی (Ph. sergenti) هستند [10].

ایران یکی از کانون‌های مهم لیشمانیازیس جلدی در دنیا تلقی می‌شود. در کشور ما، دو فرم لیشمانیازیس جلدی روستایی با عامل Leishmania major و لیشمانیازیس جلدی شهری با عامل L. tropica مشاهده می‌شود. این بیماری در حدود 15 استان کشور به‌عنوان مشکل بهداشتی مطرح بوده و علی‌رغم اقدامات انجام‌شده برای کنترل آن، همچنان شاهد بروز این بیماری و افزایش کانون‌های آن در شهرهای مختلف کشور هستیم. کانون‌های شناخته‌شده نوع روستایی این بیماری از شهرهای اصفهان، ترکمن‌صحرا، نطنز، سرخس، لطف‌آباد، خوزستان، خراسان، شیراز و کاشان گزارش شده است و نوع شهری آن از شهرهای تهران، شیراز، کرمان، بم، مشهد، نیشابور، سبزوار، رفسنجان و خمینی‌شهر گزارش شده است [11].

در سال‌های اخیر مطالعات متعددی در کشور ایران به روش مولکولی برای تشخیص و جداسازی انگل در پشه‌خاکی‌ها انجام گرفته است. به‌عنوان‌مثال عشاقی و همکاران، در سال 1387 در یک مطالعه مقطعی در ارزوئیه استان کرمان از مجموع 172 عدد پشه‌خاکی ماده صیدشده، 92 عدد (77%) آنها را Ph. papatasi گزارش کردند و با تکنیک  Semi-Nested-PCR انگل L. major را در 6 عدد پشه‌خاکی (5/6% آلودگی پشه‌خاکی‌های آن منطقه) گزارش کردند [12]. همچنین در مطالعه دیگری که کثیری و همکاران در سال 1391 در شهرستان چابهار انجام دادند، با استفاده از تکنیک PCR توانستند از تعداد 667 پشه‌خاکی Ph. papatasi و 465 عدد پشه‌خاکی Ph. salehi، به ترتیب تعداد 14 و 5 عدد پشه‌خاکی آلوده به انگل L. major را شناسایی و تشخیص دهند [13].

گونه‌های مختلف انگل لیشمانیا بیماری‌زایی و درمان متفاوتی دارند؛ ازاین‌رو، تشخیص سریع و دقیق گونه‌های مختلف انگل به‌منظور درمان مؤثرتر و اتخاذ روش‌های کنترلی مناسب‌تر، اهمیت فوق‌العاده‌ای دارد [14]. روش‌های مختلفی جهت شناسایی انگل لیشمانیا وجود دارد که از مهم‌ترین آنها مشاهده مستقیم انگل در ترشحات زخم، تعیین ایزوآنزیم‌ها، استفاده از آنتی‌بادی مونوکلونال و بررسی ژنوم انگل با استفاده از روش‌های مولکولی می‌باشد [15]. استفاده از روش مولکولی در مطالعات مختلف برای تشخیص گونه انگل در سراسر دنیا رو به افزایش است و ما نیز در این مطالعه از این روش برای شناسایی و تعیین گونه انگل لیشمانیا در پشه‌خاکی‌های منطقه تحت مطالعه استفاده کردیم.

به‌منظور اجرای تدابیر کنترلی در منطقه جهت کاهش بروز بیماری، شناسایی دقیق گونه‌های ناقل بیماری، میزان آلودگی و پیک فعالیت پشه‌خاکی‌ها در طول سال اهمیت زیادی دارد [16]. شناخت دقیق فون پشه‌خاکی‌های منطقه تحت مطالعه و همچنین نوع گونه انگل موجود در آنها در اتخاذ روش‌های کنترل مناسب‌تر بیماری، نقش بسزایی دارد و بستر مناسبی جهت مطالعات اپیدمیولوژیکی در منطقه ایجاد می‌کند. ازاین‌رو، این مطالعه به‌منظور بررسی فون ناقلین بیماری لیشمانیازیس جلدی در شهرستان زیرکوه و تعیین گونه انگل آلوده‌کننده آنها به روش RFLP-PCR انجام گرفت تا یافته‌های این تحقیق برای برنامه‌های درمان بیماری و کنترل ناقلین لیشمانیازیس جلدی در سطح استان مورد استفاده قرار گیرد.

مواد و روش‌ها

منطقه مورد مطالعه

این یک مطالعه توصیفی به‌صورت مقطعی است که در مردادماه سال 1394 به‌منظور تعیین تنوع گونه‌ای پشه‌خاکی‌های فلبوتومینه و انگل لیشمانیای آلوده‌کننده آنها در شهرستان زیرکوه استان خراسان جنوبی انجام گرفت. شهرستان زیرکوه به مرکزیت شهر حاجی‌آباد، در شمال شرقی استان خراسان جنوبی واقع شده است (شکل 1) و از دو قسمت دشتی و کوهستانی تشکیل شده است. این شهرستان دارای طول جغرافیایی 20 درجه و 60 دقیقه و عرض جغرافیایی 33 درجه و 23 دقیقه و ارتفاع از سطح دریای 1330 متر است. شهرستان زیرکوه از شمال به شهرستان خواف، از شرق به کشور افغانستان، از غرب به شهرستان قاین و از جنوب به شهرستان درمیان محدود می‌شود. جمعیت این شهرستان بالغ بر 41240 نفر می‌گردد. این شهرستان، دارای ۲ شهر (حاجی‌آباد و زهان)، ۳ بخش و ۶ دهستان و ۱۰۵ روستا است. آب‌وهوای شهرستان زیرکوه نیمه‌گرمسیری است و متوسط بارندگی آن در سال 150 میلی‌متر و حداکثر و حداقل درجه حرارت آن به ترتیب 38 و 10- درجه سانتی‌گراد است.

شکل 1- نقشه جغرافیایی استان خراسان جنوبی، شهرستان زیرکوه با فلش مشخص شده است.

صید پشه‌خاکی‌ها و تعیین گونه آنها

برای انتخاب محل‌های تله‌گذاری و صید پشه‌خاکی‌ها، ابتدا ضمن تهیه نقشه کامل و دقیق منطقه و مشورت با کارشناسان مرکز بهداشت شهرستان زیرکوه در مورد گزارش موارد ابتلا به این بیماری، مسیرها و روستاهای موردنظر انتخاب شدند. صید و جمع‌آوری پشه‌خاکی‌ها با استفاده از تله‌های چسبان آغشته به روغن کرچک و طبق پروتکل مطالعات قبلی انجام شد [17]. تله‌ها پیش از غروب آفتاب در مناطق داخلی و بیرونی منازل و محل‌های نگه‌داری احشام نصب شده و اویل صبح روز بعد جمع‌آوری می‌شدند. محل نصب تله‌ها در اماکن خارجی نظیر شکاف سنگ‌ها، حفرات حیوانات وحشی، شکاف دیوارها، لانه‌های جوندگان و  ...بود. نمونه‌های صیدشده پس از چربی‌گیری توسط استون در ویال‌های حاوی الکل 70% نگه‌داری شدند. جهت تشخیص پشه‌خاکی‌ها و برای مونتاژ دائم از محیط پوری استفاده شد. تعیین هویت گونه‌های پشه‌خاکی با بررسی آرماتورفارنژ و اسپرماتک ماده‌ها و همچنین بررسی دندان‌های سیباریوم و آرماتورهای حلقی و سایر ویژگی‌های مهم مرفولوژیک و بر اساس کلیدهای تشخیصی معتبر پشه‌خاکی‌ها صورت گرفت [19-18]. کلیه نمودارهای مربوطه با استفاده از نرم‌افزار Excel 2010 ترسیم گردید.

استخراج و تکثیر DNA انگل لیشمانیا

پس از خرد کردن کامل پشه‌خاکی‌ها به کمک هاون شیشه‌ای، DNA انگل لیشمانیا (در صورت وجود) با استفاده از کیت استخراج DNA سیناژن و طبق پروتکل شرکت سازنده استخراج شد و سپس با پرایمرهای اختصاصی  LITSRو L5.8S، بخشی از ژن ITS-1 تکثیر شد. این پرایمرها قطعه‌ای به طول حدود bp 360 را برای تمامی گونه‌های انگل لیشمانیا تکثیر می‌کنند و لذا جهت تعیین دقیق گونه انگل، از برش آنزیمی HaeIII استفاده گردید [20]. این آنزیم قطعه bp 360-300 تکثیرشده را در انگل‌های L.infantum، L. tropica و L. major به ترتیب به قطعات (bp 200، 80 و 60)، (bp 200، 60 و 40) و (bp 220 و 140) می‌شکند [21]. برای تهیه 25 میکرولیتر مواد لازم برای واکنش PCR از 5/12 میکرولیتر مسترمیکس آماده به اضافه یک میکرولیتر از پرایمر LITSR [5'-CTGGATCATTTTCCGATG-3'] و یک میکرولیتر از پرایمر L5.8S [5'-TGATACCACTTATCGCACTT-3'] به همراه 5/7 میکرولیتر آب دیونیزه و 3 میکرولیتر از DNA استخراج‌شده، استفاده گردید. سپس میکروتیوب‌ها به‌منظور تکثیر بخشی از ژن ITS-1 انگل لیشمانیا به دستگاه ترموسایکلر (Eppendorf  مدل MultiGene™ Mini Personal ساخت کشور آلمان)، با شرایط دمایی زیر منتقل شد: الف) °C 94 به‌مدت 4 دقیقه برای جدا شدن رشته‌های الگو؛ ب) °C 95 به‌مدت 45 ثانیه؛ ج) °C 55 به‌مدت یک دقیقه؛ د) °C 72 به‌مدت یک دقیقه (مرحله ب تا د 36 بار تکرار می‌شد)؛ و هـ) °C 72 به مدت 5 دقیقه برای اطمینان از ساخت کامل تمامی قطعات. سپس محصولات PCR بر روی ژل آگارز یک درصد الکتروفورز شد.

انجام RFLP-PCR

برای انجام این واکنش طبق توصیه شرکت Fermentas، به ازای هر 30 میکرولیتر از حجم واکنش، واکنشگرهای زیر با هم مخلوط می‌شوند: الف) 10 میکرولیتر از محصول PCR؛ ب) 2 میکرولیتر از بافر مخصوص آنزیم؛ ج) 17 میکرولیتر آب مقطر؛ و د) 1 میکرولیتر از آنزیم HaeΙΙΙ  سریع‌الاثر. سپس مخلوط‌ اصلی سانتریفیوژ کوتاه شده و نمونه‌ها به‌مدت 10 دقیقه در بن‌ماری با دمای 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند.

پس از انجام واکنش RFLP برای تعیین گونه، مقدار 13 میکرولیتر از محصول RFLP با 1 میکرولیتر رنگ مخصوص لود‌کردن مخلوط شد و روی ژل آگارز 3% با ولتاژ 80 ولت، الکتروفورز شد.

نتایج

در این مطالعه از مجموع 460 نمونه پشه‌خاکی جمع‌آوری‌شده از مناطق انسانی و حیوانی، 380 پشه‌خاکی مربوط به مناطق حیوانی و 80 پشه‌خاکی مربوط به مناطق انسانی بودند. از این پشه‌خاکی‌ها 110 عدد پشه‌خاکی ماده و 350 عدد نر بودند. در این مطالعه، پشه‌خاکی‌های نر حذف شدند؛ چراکه خون‌خواری نمی‌کنند و در چرخه انتقال انگل دخالتی ندارند و در نتیجه فاقد اهمیت بیماری‌زایی‌اند. در مجموع، گونه‌های ماده شناسایی‌شده به دو جنس Phlebotomus و Sergentomyia تعلق داشتند؛ به‌طوری‌که 41/88% گونه‌ها متعلق به جنس Phlebotomus و 59/11% متعلق به جنس Sergentomyia بودند.

گونه‌های شناسایی‌شده متعلق به جنس Phlebotomus شامل Ph. sergenti، Ph. papatasi، Ph. caucasicu group، Ph. major group و Ph. alexandri بودند که در این بین Ph. sergenti با فراوانی 42/59 درصد بیشترین فراوانی را داشت و به‌عنوان گونه غالب شناسایی شد و همچنین گونه Ph. alexandri با فراوانی 45/1% کمترین فراوانی را داشت و گونه‌های Ph. papatasi با 04/13% و Ph. caucasicus group و Ph. major group هرکدام با 25/7 درصد در منطقه حضور داشتند. همچنین گونه‌های S. sintoni و S. dentata متعلق به جنس Sergentomyia هرکدام به ترتیب با فراوانی 25/7% و 35/4% در منطقه شناسایی شدند (نمودار 1). از 110 پشه‌خاکی ماده بررسی‌شده، 54/54 درصد دارای وضعیت شکمی خالی، 20% باردار، 36/6% نیمه باردار و 09/19% خون‌خورده بودند. (جدول 1 وضعیت شکمی نمونه‌های بررسی‌شده را به تفکیک نشان می‌دهد).

نمودار 1- درصد فراوانی پشه‌خاکی‌های صیدشده در شهرستان زیرکوه در سال 1394

جدول 1- وضعیت شکمی پشه‌خاکی‌های ماده بررسی‌شده در شهرستان زیرکوه در سال 1394

در این مطالعه در مجموع ۶۵ نمونه Ph. sergenti صید شد که مورد بررسی قرار گرفتند. در بین نمونه‌های بررسی‌شده تنها یک نمونه با نشان دادن باندی حدود bp 360 از نظر وجود انگل مثبت تشخیص داده شد (شکل 2). این نمونه متعلق به روستای فندخت شهرستان زیرکوه بود و از لحاظ وضعیت شکمی دارای شکم خالی بود. این روستا یکی از بزرگ‌ترین روستاهای شهرستان زیرکوه است و حدود 1430 نفر جمعیت دارد. در بین سایر پشه‌خاکی‌های صیدشده (Ph.caucasicus group، Ph. papatasi، Ph. major group، Ph. Alexandri و S. dentata و S. sintoni) نمونه آلوده به انگل یافت نشد.

شکل 2- ژل الکتروفورز محصول ITS1- Leishmania-based PCR پشه‌خاکی Ph. sergenti در منطقه روستای فندخت شهرستان زیرکوه در سال 1394

هضم آنزیمی ‌محصول ITS-1-PCR گونه
 Ph. sergenti آلوده به انگل لیشمانیا با آنزیم HaeIII انجام گرفت و الگوی برش آنزیمی‌ محصول PCR گونه Ph. sergenti آلوده به‌ انگل، با الگوی برش انگل L. tropica مطابقت دارد و باندهای bp 200، bp 60 و bp 40 به‌خوبی قابل‌مشاهده است (شکل 3).

شکل 3- ژل الکتروفورز محصول RFLP-PCR نمونه مثبت انگلی پشه‌خاکی Ph. sergenti در منطقه روستای فندخت شهرستان زیرکوه در سال 1394

بحث

مشاهده آمار مربوط به مبتلایان لیشمانیازیس جلدی در شهرستان زیرکوه در سال‌های اخیر نشان می‌دهد که هر سال حدود 20-30 نفر مبتلا به لیشمانیازیس جلدی به مرکز بهداشت این شهرستان مراجعه می‌کنند. این مطالعه به‌منظور بررسی تنوع گونه‌ای ناقلین لیشمانیازیس جلدی و آلودگی آنها به انگل لیشمانیا در شهرستان زیرکوه شکل گرفت. لازم به ذکر است که مطالعه فون پشه‌خاکی‌ها و بررسی آلودگی آنها به انگل لیشمانیا در این شهرستان برای اولین بار صورت می‌گرفت.

با توجه به اینکه انسان و حیوانات وحشی و اهلی متعددی به‌عنوان مخازن و میزبانان انگل لیشمانیا محسوب می‌شوند، تشخیص قطعی گونه‌های انگل جداشده با استفاده از روش‌های مختلف از این میزبانان و پشه‌های ناقل، نقش بسزایی در مطالعات انگل‌شناسی، بررسی‌های اپیدمیولوژیکی، درمان و کنترل بیماری دارد [23-22]. از گذشته تاکنون، به‌کارگیری روش‌های ایمونولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی جهت تشخیص گونه‌های مختلف لیشمانیا مرسوم بوده است [24]. در مطالعات مختلف، بسته به هدف مطالعه، از بخش‌های مختلف ژنوم انگل استفاده می‌شود. rDNA یکی از مناسب‌ترین بخش‌های ژنوم جهت تشخیص گونه‌های نزدیک به هم، یعنی گونه‌هایی که با استفاده از خصوصیات مورفولوژیک نمی‌توان آن‌ها را از هم تمیز داد، می‌باشد. این قطعه شامل دو بخش غیر کد‌شونده به نام ITS-1 و ITS-2 است. بر اساس مطالعات انجام‌شده، در این دو قطعه به‌ویژه ITS-1، به حد کافی تنوع در بین گونه‌های مختلف انگل لیشمانیا وجود دارد که بتوان از آنها جهت شناسایی گونه‌های انگل بهره جست [26-25]. چون هدف از این مطالعه تعیین گونه انگل لیشمانیا در پشه‌خاکی‌ها بود، از تکثیر ژن ITS-1 و هضم محصول PCR با آنزیم HaeΙΙΙ جهت تعیین گونه انگل استفاده گردید. مطالعات حشره‌شناسی این تحقیق که در سال 1394 در فصل فعالیت پشه‌خاکی‌ها صورت گرفت، منجر به صید پشه‌خاکی‌ها از 7 گونه مختلف شد. گونه غالب در جنس فلبوتوموس، گونه Ph. sergenti است که ناقل قطعی لیشمانیازیس پوستی شهری در تمام کانون‌های بیماری در ایران می‌باشد، آلودگی انگلی این پشه‌خاکی از مشهد، سبزوار، یزد، قم، زاهدان، کرمان، شیراز و بندرعباس گزارش شده است.

در مطالعه که توسط یوسف مقدم و همکاران در استان خراسان جنوبی انجام گرفته است، از مجموع 174 عدد پشه‌خاکی که از سطح برخی شهرستان‌های استان خراسان جنوبی جمع‌آوری کردند، توانستند گونه‌های Ph. sergenti،
 Ph. papatasi، S. sintoni و S. dentate را شناسایی کنند، به‌طوری‌که این یافته به علت شرایط تقریباً مشابه اکولوژیکی کل استان خراسان جنوبی با مطالعه حاضر هم‌خوانی دارد [27]. برنجی و همکاران در مطالعه‌ای که در شمال مشهد انجام دادند، گونه‌های Ph. sergenti، Ph. papatasi، S. sintoni و S. sumbarica را شناسایی کرده و گونه غالب را Ph. sergenti گزارش کردند [10]. این نتایج شباهت زیادی به نتایج مطالعه حاضر دارد و احتمالاً مهم‌ترین دلیل این شباهت گونه‌ای را می‌توان به شرایط آب‌و‌هوایی تقریباً یکسان مناطق مختلف استان خراسان جنوبی و رضوی به مناطق مورد مطالعه ما نسبت داد که این مسئله، شرایط مشابهی را در جهت ایجاد ساختار گونه‌ای یکسان در این مناطق به وجود آورده است. همچنین مهرابی توانا و همکاران نیز در مطالعه خود در شهرستان تایباد در استان خراسان رضوی در سال 1383 نشان دادند که گونه Ph. Sergenti، گونه غالب منطقه می‌باشد [28]. اما در مطالعه مشابهی که بهروان و همکاران در شهرستان ورامین انجام دادند، گونه Ph. papatasi را گونه غالب معرفی کردند [2]، همچنین کثیری و همکاران در مطالعه‌ای مشابه در شهرستان چابهار، گونه غالب منطقه را Ph. papatasi گزارش کردند [12] که این یافته‌ها با مطالعه حاضر هم‌خوانی ندارند و می‌توان این‌گونه گفت که تفاوت در فون و گونه پشه‌خاکی غالب در این مناطق می‌تواند به ‌علت تفاوت در شرایط آب‌و‌هوایی و همچنین نوع بیماری لیشمانیازیس در مناطق مذکور باشد.

در مطالعه کرمیان و همکاران که در سال 1392 بر روی نمونه‌های ضایعات جلدی بیماران مشکوک به لیشمانیازیس جلدی در شهرستان بیرجند انجام گرفت، برای شناسایی انگل توسط روش مولکولی و تعیین گونه آن به روش RFLP-PCR از ژن‌های KDNA و ITS-1 استفاده شد و از مجموع 80 بیمار مبتلا به لیشمانیازیس جلدی، 8 بیمار (10%) مبتلا به L. major (نوع روستایی) و 72 بیمار (90%) مبتلا به L. tropica (نوع شهری) بودند، همچنین آنها توصیه کردند که روش RFLP-PCR روی قطعه ITS-1 دارای حساسیت کامل است و می‌تواند برای تشخیص لیشمانیازیس و تعیین سریع گونه انگل‌های عامل بیماری به‌کاررود [29]. در همین راستا، ما نیز از ژن ITS-1 برای شناسایی انگل در پشه‌خاکی‌ها و سپس تعیین گونه آن به روش RFLP-PCR استفاده کردیم و موفق به تشخیص انگل L. tropica در بدن پشه‌خاکی Ph. sergenti که گونه غالب در شهرستان زیرکوه است، شدیم.

نتیجه‌گیری

با توجه به مقایسه نتایج مطالعه حاضر و مطالعه کرمیان و همکاران می‌توانیم نتیجه گرفت که زخم‌های بیماران مبتلا به لیشمانیازیس جلدی نوع شهری می‌تواند بر اثر انتقال بومی ‌بیماری در این شهرستان ایجاد شده باشد. اما بیمارانی که دارای زخم‌های مربوط به L. major (نوع روستایی) بودند بر اثر مسافرت به استان‌های دیگر و مناطق اندمیک نوع روستایی بیماری، مبتلا به آن شده‌اند و با توجه به درصد پایین پشه‌خاکی Ph. papatasi (95/7) در فون منطقه و فقدان انگل در بدن آنها می‌توان گفت که در شهرستان بیرجند انتقال بومی ‌انگل L. major وجود ندارد.

این بررسی اولین مطالعه مولکولی به‌منظور تعیین گونه انگل لیشمانیا در پشه‌خاکی‌های شهرستان زیرکوه استان خراسان جنوبی بود و نتایج به‌دست‌آمده در این تحقیق، نشان داد که لیشمانیازیس جلدی نوع شهری می‌تواند در آینده در این شهرستان به‌عنوان یک معضل بهداشتی مطرح شود. این امر را می‌توان به سبک زندگی روستایی مردم این شهرستان، مهاجرت افراد غیر‌مصون یا بیمار به منطقه، وجود محل‌های مناسب برای زادوولد پشه‌خاکی‌ها، وفور بالای پشه‌خاکی Ph. sergenti و رواج فعالیت‌های کشاورزی و دامداری که زمینه را برای افزایش جمعیت جوندگان و در پی آن سگ‌سانان که میزبان ثانویه انگل لیشمانیا به‌شمار می‌روند، مرتبط دانست. در پایان پیشنهاد می‌شود سیستم بهداشتی این شهرستان به‌منظور کنترل و پیشگیری از شیوع بیماری لیشمانیازیس جلدی در منطقه، مراقبت‌های لازم جهت کنترل این بیماری و همچنین آموزش بهداشت و اقدامات بهداشت محیط را مدنظر قرار دهد.

تشکر و قدردانی

بدین‌وسیله از مسئولان محترم معاونت پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی بیرجند و مسئولان آزمایشگاه تحقیقاتی این دانشگاه به خاطر مساعدت در انجام این پژوهش تقدیر و تشکر می‌شود.

References

[1] Nadim A, Javadian E, Mohebali M, Zamen Momeni A. Leishmania parasite and leishmaniasis. 3th ed. Tehran: Tehran University Publication Center: 2008. [Farsi] Moddabber F. Leishmaniasis. TDR Progress. 11th Program report: 1991-1992.

[2] Behravan MR, Hajjaran H, Abadi A, Haghighi A, Rahbarian N, Amini A, et al. Cutaneous leishmaniasis in suspected refereed patients to health centers of Varamin and determination of sand flies species during 2012-2013. Medical Journal of Tabriz university of medical sciences and health services 2015; 37(2): 6-11. [Farsi]

[3] World Health Organization. Leishmaniasis: world wide epidemiological and drug access update 2013.

[4] Hamzavi Y, Mohebali M, Edrisian GH, Foruzani A. An epidemiological study of cutaneous leishmaniasis (human being and animal reservoir) in Dashestan and Dashti districts of  Bushehr province, Iran. J Publ Hlth 2000; 29(14): 177-190. [Farsi]

[5] Desjeux P. Global control and Leishmania HIV co-infection. Clin Dermatol 1997; 17: 317-325.

[6] WHO. Report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniases 2010.

[7] Heinzel F. From oriental sore to kala azar. J. Clin Microbial 1997; 19: 121-126.

[8] Bastien P, Lachaud L, Marchergui S, Chabbert E, Dereure J, Pierr J. Comparison of six PCR method using Peripheral Blood for detection of canine visceral leishmaniasis. J. Clin Microbiolo 2002; 40(1): 310-315.

[9] Oshaghi MA, Yaghoobi-Ershadi MR, Abbassi M, Parvizi P, Akhavan AA, et al. Detection of Leishmania major in naturally infected sand flies using Semi Nested- PCR. Iranian J Publ Health 2008; 37(4): 59-64.

[10] Berenji F, Yaghoubie M, Akhavan A A, Hanafi B A, Fata A. A Study on the vectors of the cutaneous leishmaniasis in the northrnpart of mashhad Iran. Iranin journal of basic medical sciences 2006: 1-6. [Farsi]

[11] Sofizadeh A, Cherabin M, Mehravaran A. Cutaneous leishmaniasis in Gonbad Kavoos, North of Iran (2009-11): an epidemiological study. Journal of Gorgan University of Medical Sciences 2012; 14(4): 100-6. [Farsi]

[12] Kassiri H, Naddaf SR, Mohebali M, Javadian E. Molecular characterization of Leishmania infection in sand flies from Sistan Va Baluchistan province, southeastern Iran. Jundishapur J Microbiol 2012; 5(2): 430-433. [Farsi]

[13] Berman JD. Human leshmaniasis: clinical, diagnostic, and chemotherapeutic developments in the last 10 years. Clin Infect Dis 1997; 24: 684-703.

[14] Hatam GR, Ardehali S, Motazedian H, Sadjjadi SM, Fakoorziba MR. The methods of isolation and characterzation of Leishmania parasite. Shiraz. Publisher of shiraz Univercity 2006; 172. [Farsi]

[15] Killick-kendrick R. Phlepotominae vectors of leishmaniasis: a review. Med Vet Entomol 1990; 4: 1-24

[16] Parvizi P, Benlarbi M, Ready PD. Mitochondrial and Wolbachia markers for the sandfly Phlebotomus papatasi: little population differentiation between peridomestic sites and gerbil burrows in Isfahan province, Iran. Medical and veterinary entomology 2003; 17(4): 351-62.

[17] Rassi Y, Hanafi bojd AA. Sand fly, The vector of leishmaniasis. Tehran: Noavaran Elm 2006. [Farsi]

[18] Seyedi-Rashti MA, Nadim A. The genus Phlebotomus (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) of the countries of the eastern Mediterranean region. Iranian J Publ Health 1992; 21(1-4): 11-50.

[19] Lewis DJ. A taxonomic review of the genus Phlebotomus (Diptera: Psychodidae). 1982: 121-209.

[20] Al‐Jawabreh A, Schnur LF, Nasereddin A, Schwenkenbecher JM, Abdeen Z, et al. The recent emergence of Leishmania tropica in Jericho (A'riha) and its environs, a classical focus of L. major. Tropical Medicine & International Health 2004; 9(7): 812-6.

[21] Al-Nahhas SA, Kaldas RM. Characterization of Leishmania species isolated from cutaneous human samples from central region of Syria by RFLP analysis. ISRN Parasitol 2013; 3: 5-11

[22] Lainson R, Shaw JJ, Peters W, Killick-Kendrick R. Evolution, classification and geographical distribution. Academic Press 1987: 1-20.

[23] Croft SL, Yardely V, Hendrick, Drug sentivity of Leishmania species: some unresolved problems. Trans of the Royal Soci of Trop Med and Hyg 2012: 127-129.

[24] Karami M, Doudi M, Setorki M. Assessing epidemiology of cutaneous leishmaniasis in Isfahan. Iran. J Vector Borne Dis 2013; 50: 30-37.

[25] El Tai NO, Osman OF, Fari M EI, Presber W, Schonian G. Genetic heterogeneity of ribosomal internal transcribed spacer in clinical samples of Leishmania donovani spotted on filter paper as revealed by single-strand conformation polymorphisms and sequencing. Trans R Soc Trop Med Hyg 2000; 94(5): 575-79.

[26] Schonian G, Nasereddin D, Dinse N, Schweynoch C, Schallig HD, Presber W, et al. PCR diagnosis and characterization of leishmania in local and imported clinical samples. Diagn Microbiol Infect Dis 2003; 47(1): 349-58.

 [27] Mogaddam MY, Borna H, Shayesteh M, Davari A, Younesi Z, Hanafi-Bojd AA, et al. Fauna and frequency of sand flies in Southern Khorasan province. Journal of Mazandaran University of Medical Sciences (JMUMS) 2015; 25(125): 121-30. [Farsi]

[28] Mehrabi-Tavana A, Javadian E, Rassi Y, Nakhkaei H, Zahraei A, Khoobdel M, et al. Ecological characteristics of the sand fly, vector of cutaneous leishmaniasis in Taibad city bordering of Iran and Afghanistan. J Mil Med 2005; 6(4): 255-62.

[29] Karamian, M., Bojd, F., Sedigh, M., Hemmati, M., Saadatjoo, A., & Barati, D. A. Molecular identification of cutaneous leishmaniasis agents in Birjand, Iran. Journal of Birjand University of Medical Sciences 2013; 20(2): 183-90.‌ [Farsi]