Kasaeezadeh F, Asghari-Moghaddam N, Shahla S. The Effect of Crocin on the Expression of MMP-2 and MMP-9 Genes in the Liver Tissue of Cadmium-Treated Rats: A Short Report. JRUMS 2021; 19 (10) :1123-1130
URL:
http://journal.rums.ac.ir/article-1-5589-fa.html
کسایی زاده فاطمه، اصغری مقدم نسترن، شهلا سولماز. تأثیر کروسین بر بیان ژنهای MMP-2 و MMP-9 در بافت کبد موشهای صحرایی تیمار شده با کادمیوم: یک گزارش کوتاه. مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان. 1399; 19 (10) :1123-1130
URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-5589-fa.html
واحد تهران مرکزی، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
واژههای کلیدی: کبد،
کادمیوم،
کروسین،
MMP2،
MMP9
متن کامل [PDF 467 kb]
(635 دریافت)
|
چکیده (HTML) (1437 مشاهده)
متن کامل: (1227 مشاهده)
گزارش کوتاه
مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان
دوره 19، دی 1399، 1130-1123
تأثیر کروسین بر بیان ژنهای MMP-2 و MMP-9 در بافت کبد موشهای صحرایی تیمار شده با کادمیوم: یک گزارش کوتاه
فاطمه کساییزاده[1]، نسترن اصغریمقدم[2]، سولماز شهلا[3]
دریافت مقاله:29/06/99 ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح:13/07/99 دریافت اصلاحیه از نویسنده:03/08/99 پذیرش مقاله: 14/08/99
چکیده
زمینه و هدف: یکی از عوامل ایجاد سرطان کبد، فلز سنگین کادمیوم است. کروسین ترکیبی با خاصیت آنتیاکسیدانی است. هدف این مطالعه تعیین اثر کروسین بر بیان ژنهای ماتریکس متالوپروتئیناز ۲ و ۹ (MMP2 و MMP9) در سرطان کبد القاء شده توسط کادمیوم در موش صحرایی بود.
مواد و روشها: در مطالعه تجربی حاضر، ۴۰ موش صحرایی ماده به ۴ گروه کنترل، کروسین (mg/kg 15)، کادمیوم (mg/kg 20)، کروسین±کادمیوم تقسیم شدند. پس از 8 هفته تیمار از طریق گاواژ روزانه، بافت کبد بهمنظور بررسی بیان ژنها با روش Real-Time PCR جدا شد. دادهها با روش one-way ANOVA آنالیز شدند.
یافتهها: نتایج نشانداد مصرف کادمیوم بیان دو ژن MMP2 و MMP9 را در بافت کبد افزایش میدهد (۰۰۱/۰˂P). مصرف کروسین باعث کاهش قابل توجه بیان هر دو ژن در بافت کبد شد (۰۰۱/۰˂P).
نتیجهگیری: کروسین میتواند تأثیر افزاینده کادمیوم بر بیان ژنهای MMP2 و MMP9 را در بافت کبدی کاهش دهد.
واژههای کلیدی: کبد، کادمیوم، کروسین، MMP2، MMP9
مقدمه
فرآیند ایجاد بدخیمی تحت تأثیر ژنها و نیز عوامل محیطی است. ایجاد و پیشرفت سرطان رویدادی چند مرحلهای است که معمولاً 20 تا 30 سال از زمان مواجهه با عامل کارسینوژن تا ایجاد بیماری به طول میانجامد [۱]. تنوع ژنتیکی و عوامل محیطی مختلف در ایجاد آسیب دیدگی کبد نقش دارند [۲]. عوامل خطرزای محیطی شامل عفونت با ویروس هپاتیت B (HBV) و C (HCV)، مصرف الکل و سیگار، رژیم غذایی و آلایندههای محیطی مانند آفلاتوکسین، عناصری مانند آرسنیک و کادمیوم میباشند [۱]. کادمیوم یک عنصر کمیاب سنگین است و به عنوان یک سرطانزای انسانی طبقهبندی شدهاست که ریهها، کبد و کلیهها را هدف قرار میدهد و قرار گرفتن طولانیمدت در معرض کادمیوم میتواند به عملکرد این اندامها آسیب برساند و در طولانی مدت باعث رشد تومور شود [۳]. اصلیترین راه آلودگی با کادمیوم از طریق خوردن سبزیجات کشت شده در خاکهای آلوده به کادمیوم است [۲]. فلزات سنگین در عمل سوخت وساز بدن وارد شده و عمل متابولیسم را مختل مینمایند و اثرات جدی بر سیستم عصبی، کلیهها، کبد و خون میگذارند [۳]. کروکوس ساتیوس (Crocus sativus)، که به عنوان زعفران شناخته میشود گیاهی از راسته مارچوبهسانان (Asparagales) و تیره زنبقیان (Iridaceae) است. آنالیز شیمیایی زعفران نشان داده است که ترکیبات مؤثر اصلی آن شامل کروسین (ترکیبات کارتنوئیدی عامل رنگ زعفران) پیروکسین (عامل طعم) سافرانال (عامل معطر) میباشد که کروسین اثر مهاری بر سنتز اسید نوکلئیک داخل سلولی نشان داده است، فرمول شیمیایی کروسین C44H64O24 میباشد [۴]. خواص درمانی کروسین بر روی انواعی از بیماریها را به خاطر فعالیت ضدالتهابی و آنتیاکسیدانی آن میدانند. از آنجایی که استرس اکسیداتیو و التهاب و در نتیجه آن افزایش بیان انواعی از ماتریکس متالوپروتئیناز (Metalloproteinases (MMPs))) به عنوان یکی از مهمترین فاکتورهای تأثیرگذار بر آسیب سلولی ناشی از اثر کادمیوم محسوب میشوند، بنابراین مهار استرس اکسیداتیو توسط مکملهای آنتیاکسیدانی نظیر کروسین میتواند نقش مهمی در مهار یا کاهش بیان MMPs و کاهش آسیب سلولی داشته باشد. ماتریکس متالوپروتئینازها اندوپپتیدازهایی هستند که در بازسازی ماتریکس خارج سلولی نقش اساسی دارند. بیان و فعالیت MMPs در سرطانهای انسانی افزایش مییابند. دلایل انتخاب ژن MMP-2 و ژن MMP-9 با یکدیگر این است که به لحاظ ساختاری با هم مرتبط هستند. MMP-2 و MMP-9 ویژگی مشترک در دامنه اتصال را دارند، در حالت طبیعی خود کلاژنهای IV و V را کاهش میدهند و نیز سیتوکاینها را فعال میکنند [۵].
بر اساس نتایج علمی به دست آمده از اثر مهاری کروسین بر آسیب بافت کبدی، هدف از تحقیق حاضر، تعیین تأثیر کروسین بر بیان ژنهای MMP-2 و MMP-9 به عنوان ژنهای مؤثر در پیشرفت آسیب و متاستاز در بافت کبد موشهای صحرایی آسیب دیده ناشی از مصرف کادمیوم بود.
مواد و روشها
در مطالعه تحربی حاضر، ۴۰ سر موشصحرایی ماده بالغ (200-۲50 گرم) از انستیتو پاستور ایران تهیه شد. آنها تحت شرایط استاندارد (دما 23-20 درجه سانتی گراد، 5±50 درصد رطوبت و چرخه روشنایی تاریکی 12 ساعته) برای سازگاری با محیط نگهداری شدند. بعد از 7 روز موشهای صحرایی به طور تصادفی به 4 گروه تقسیم شدند. گروه یک: گروه کنترل که تیماری دریافت نکردند. گروه دوم: تیمار شده با کروسین (Sigma- Aldrich, USA) (۲۰ میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن) به مدت 8 هفته. گروه سوم: تیمار شده با کادمیوم (Germany, Alfa Aesar) ( ۱۵ میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن) به مدت 8 هفته. گروه چهارم (گروه کمپلکس): یمار شده با کادمیوم (۱۵ میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن) و کروسین (۲۰ میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن) به مدت 8 هفته. کادمیوم و کروسین به صورت حل شده در آب با روش گاواژ به حیوانات داده شد. دوزهای مصرفی از کادمیوم و کروسین براساس مطالعات پیشین انتخاب شدند [۶]. پس از 8 هفته تیمار مدلهای حیوانی، موشهای صحرایی به روش اخلاقی یوتانایز شدند و پس از باز شدن بدن، بافت کبد خارجگردید و سپس به RNA Later منتقل شد و تا زمان شروع آزمایش در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شد. آزمایشهای انجام شده روی تمامی حیوانات در شرایط کاملاً یکسان و مطابق با اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی صورت گرفته است (NIH publication n. 86-23, revised 1985). مطالعه دارای کد اخلاق به شماره IR.IAU.SRB.REC.1397.029 از دانشگاه آزاد واحد علوم و تحقیقات تهران بود.
RNA تام از بافت کبد با استفاده از کیت RiboEx (GENE ALL, South Korea) بر طبق پروتکل تولیدکننده جداشد. کمیت و کیفیت RNA با اسپکتروفوتومتری (NanoDrop ND-1000 spectrophotometer; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) و الکتروفورز آگارز ژل ۵/۱درصد ارزیابی شد. به منظور سنتز cDNA، نمونههایی با نسبت جذب ۲۸۰/۲۶۰ نانومتر ۲-۸/۱ برای بررسیهای بیشتر تعیین اعتبار شدند. واکنش رونویسی معکوس با کیت PrimScript RT Reagent Kit ((Japan Takara Corporation with proprietary code RR037A) انجام شد. پرایمرها با کمک نرمافزار Oligo 7 طراحی و برای تأیید در سایت NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) ارزیابی شدند و برای ساخت به شرکت پیشگام ارسال شدند. از ژن GAPDH به عنوان کنترل داخلی استفاده شد. واکنش PCR با استفاده از پرایمرهای طراحی شده برای ژنهای MMP2 (MMP2-F, 5'-CAAGTTCAACGGCACAGTCA-3' و MMP2-R, 5'-CCCCATTTGATGTTAGCGGG-3' )، MMP9 (MMP9-F, 5'-GAACACCATCGAGACCATGC-3' وMMP9-R, 5'-GGTCCAGGTCAGGTGTGTAA-3' ) و ژن GAPDH به عنوان کنترل داخلی (GAPDH-F, 5'-AGGATGGTCTACTGGCACAC-3' و GAPDH-R, 5'-GTGCAGGACAAATAGGAGCG-3') انجام شد.
cDNA به دست آمده به عنوان الگو برای واکنش Real-Time PCR با دستگاه Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Australia) و مسترمیکس شرکت AMPLIQON به شرح زیر استفادهشد: دناتوراسیون ابتدایی 15 دقیقه در 95 درجه سانتیگراد که با 40 سیکل تکثیر ادامه یافت: 15 ثانیه در 95 درجه سانتیگراد، 30 ثانیه در 60 درجه سانتیگراد برای MMP-2 و MMP-9 و 54 درجه سانتیگراد برای GAPDH و 30 ثانیه در 72 درجه سانتیگراد. منحنیهای تکثیر و ذوب رسم شدند. به منظور تأیید صحت محصول واکنش Real-time PCR، از آگارز ژل 2 درصد استفاده شد، تا اندازه قطعات تولید شده بر روی ژل آگارز اندازهگیری شود.
تمام آزمایشها در سه تکرار انجام شد و نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار گزارششدند. پس از تکثیر، CT (cyclic threshold) نمونهها تعیین شد و کارآیی پرایمرها با استفاده از نرم افزار LinRegPCR(11.0) ارزیابی شد. میزان بیان ژنهای MMP2 و MMP9 در مقایسه با ژن کنترل داخلی GAPDH بر اساس فرمول E-ΔΔCT ((کارآیی پرایمر)+1=E) به دست آمد (نرمافزار LinRegPCR v.10.2). آزمون آماری آنالیز واریانس یکطرفه (One-Way ANOVA) و آزمون تعقیبی Tukey مورد سنجش قرارگرفت. ۰۵/۰˂P به لحاظ آماری معنیدار در نظر گرفته شد. محاسبه آماری این مطالعه با استفاده از نرمافزار SPSS نسخه ۲۴ انجام گرفت.
نتایج
مقایسه بیان ژنهای MMP2 و MMP9 در میان گروههای شرکت کننده در این پژوهش در شکل ۱ آمده است. بیان ژن MMP2 در گروه کادمیوم در مقایسه با گروه کنترل و گروه مصرف کننده همزمان کادمیوم و کروسین، بهترتیب، به میزان 422/5 و 989/4 برابر افزایش داشت (۰۰۱/۰˂p). اختلاف میزان بیان ژن میان گروه مصرف کننده کروسین، گروه تیمار شده با کادمیوم و کروسین نسبت به گروه کنترل معنیدار نبود.
محاسبات آماری برای بررسی تغییرات میزان بیان ژن MMP9 نشان داد که بیان این ژن در گروه کادمیوم نسبت به گروه کنترل افزایش 83/3 برابر داشته است که به لحاظ آماری معنیدار بوده است (۰۰۱/۰˂p). بیان ژن MMP9 در گروه تیمار شده با کروسین و کادمیوم کاهش معنیدار 75/4 برابری را نشان داد (۰۰۱/۰˂p). اختلاف میزان بیان ژن MMP9 درگروه مصرفکننده کروسین، گروه تیمار شده با کادمیوم و کروسین نسبت به گروه کنترل معنیدار نبود.