مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

مقاله پژوهشی
مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان
دوره 20، اردیبشهت 1400، 162-147
 
اثرات حفاظتی عصاره هیدروالکلی برگ زیتون بر پارامترهای اسپرم و کیفیت کروماتین در موش سوری در معرض حشره‌کش مانکوزب:یک مطالعه تجربی
 
مریم اشکنانی^[1]، حکیمه اکبری^[2]
 
دریافت مقاله:05/09/99  ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح:06/10/99   دریافت اصلاحیه از نویسنده:18/5/01/1400 پذیرش مقاله: 16/01/1400
 
 
 
 
چکیده
زمینه و هدف: استفاده بی‌رویه از مانکوزب (Mancozeb; MZB)، منجر به صدمات دستگاه تناسلی می‌گردد. هدف مطالعه حاضر تعیین تأثیر دوزهای مختلف عصاره هیدروالکلی برگ زیتون (Olive leaf extract; OLE) بر آسیب تولید ‌مثلی در موش­های نر در معرض مانکوزب بوده است.
مواد و روش‌ها: در این مطالعه تجربی، 64 سر موش نر بالغ (10 تا 12هفته) نژاد NMRI به‌طور تصادفی در 8گروه (8تایی) شامل: گروه‌ کنترل (دریافت­کننده نرمال سالین)، گروه دریافت­کننده مانکوزب (500 میلی­گرم/کیلوگرم)، گروه‌های دریافت‌کننده هم‌زمان مانکوزب و OLE با دوزهای 200، 300 و 400 میلی­گرم/کیلوگرم و گروه‌های دریافت ‌کننده OLE با دوزهای 200 ،300 و400 میلی­گرم/کیلوگرم تقسیم شده و به مدت 35 روز یک روز در میان گاواژ شدند. سپس موش­ها با قطع نخاع گردنی کشته شده، نمونه خون قلب جهت اندازه‌گیری سطح تستوسترون سرم جدا شد و اپیدیدیم به‌منظور بررسی اسپرم­ها خارج شد. شاخص‌های آنالیز اسپرم (تعداد، تحرک و مورفولوژی)، میزان پروتامین و سلامت کروماتین هسته اسپرم‌ها بررسی شدند. داده­ها با آنالیز واریانس یک­طرفه و آزمون تعقیبی Tukey مورد تجزیه­و­تحلیل قرار گرفتند.
یافته­ها: در گروه مانکوزب کم‌ترین میزان پروتامین (001/0=P) و کم‌ترین اسپرم زنده (005/0=P) دیده شد. در گروه­های دریافتی OLE، میزان ناهنجاری سر (003/0=P) و اسپرم‌های بی‌حرکت (001/0>P) کاهش معنی‌داری داشت. در دوز 200 میلی‌گرم/کیلوگرمOLE ، بیش‌ترین سلامت کروماتین (001/0>P)، بیش‌ترین حرکات سریع اسپرم (037/0=P) و بالاترین سطح تستوسترون (001/0=P) مشاهده شد.
نتیجه‌گیری: بیش‌ترین اثربخشی  OLEدر دوز 200 میلی‌گرم/کیلوگرم دیده شد. لذا احتمالاً مصرف این عصاره در همین دوز می‌تواند به­عنوان یک ترکیب حمایتی در رژیم غذایی افراد پرخطر در معرض مانکوزب لحاظ شود.
واژه‌‌­های کلیدی: مانکوزب، اسپرم، عصاره برگ زیتون، موش سوری، ناباروری
 
 
 
 

مقدمه
ناباروری یکی از مشکلات جوامع امروزی، خصوصاً در بین زوج‌های جوان می‌باشد. درصد بالایی از زوج‌ها به اختلالات و مشکلات ناباروری مبتلا می‌باشند. امروزه 50-30 درصد علت ناباروی، مربوط به جنس‌مذکر باشد [2-1]. برخی اختلالات ناباروری در مردان در ارتباط با پارامترهای مایع‌منی و سلول‌های اسپرم می‌باشد. اختلال در پارامترهایی مانند کاهش تعداد اسپرم، عدم تولید و بلوغ اسپرم‌های طبیعی، اختلال در حرکت اسپرم‌ها و ساختار کروماتین و هسته می‌‌تواند منجر به ناباروری در مردان گردد[1]. اسپرماتوژنز فرآیندی بسیار پیچیده است که عوامل متعددی می‌تواند بر آن اثر کرده و منجر به ناباروری و یا کاهش باروری در فرد شود [3-2]. شواهد نشان می‌دهد که تماس با حشره‌کش‌ها می‌تواند ژن­های والدین را تحت تأثیر قرار داده و بر روی فرزندان و نهایتأ نسل‌های بعدی تأثیر بگذارد [4]. بیش از 80 درصد از حشره‌کش‌های قابل دسترس برای مصارف کشاورزی و خانگی، دارای ترکیبات کربامات و یا ارگانوفسفات­ها هستند که می‌توانند باعث ایجاد اختلال عملکرد اندوکرینی در موش­های صحرایی نر شوند [5]. دستگاه تولید مثل هر دو جنس، به دلیل تخریب مکانیزم‌های فیدبکی ناشی از اثرات منفی این حشره‌کش‌ها از جمله مانکوزب (Mancozeb) با فرمول شیمایی C8H12MnN4S8Zn و نام تجاری مانکوزب دیتان‌ام (Dithane M) از گروه شیمیایی (Alkylenebis dithiocarbamate)، در طول محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- گونادال نسبت به این عوامل آسیب پذیر می‌باشند [7-6]. برگ ‌‌زیتون (.L Olea europaea) به‌عنوان یک ماده خام و ارزان سرشار از ترکیبات فنولی بویژه اولئوروپین (oleuropein) می‌باشد. مطالعات متعدد آزمایشگاهی نشان‌داده است که اولئوروپین با فرمول شیمیاییC25H32O13  یکی از مهم­ترین ترکیبات فنلی موجود در برگ و میوه زیتون می‌باشد که تلخی برگ و میوه زیتون به دلیل وجود اولئوروپین در آن است. اولئوروپین، یک استر هتروسیدیک از اسید النولیک و ۴،۳- دی هیدروکسی فنیل اتانول می‌باشد که  فعالیت ضد التهابی و آنتی­اکسیدانی دارد [8]. با توجه به اثرات ضد ‌التهابی، ضد ‌میکروبی و آنتی‌اکسیدانی اولئوروپین موجود در برگ‌ زیتون [9]، هدف از این مطالعه تعیین اثر حفاظتی عصاره برگ زیتون بر اختلالات ناشی از مانکوزب در پارامترهای اسپرم موش سوری می‌باشد. با حصول نتایج مثبت می­توان از عصاره برگ زیتون در رژیم های غذایی افرادی که به طور مستقیم و مداوم با مانکوزب سروکار دارند استفاده نمود.
مواد و روش­ها
این مطالعه تجربی، بر روی 64 سر موش‌سوری نر بالغ نژاد NMRI در محدوده سنی 12-10 هفته در حیوان­خانه مرکز تحقیقات دانشکده علوم پزشکی شیراز در سال 1399 انجام شد. این موش­ها در قفس­های تمیز خانه ‌حیوانات با درجه حرارت 22 تا 24 درجه سانتی­گراد و دوره تاریکی-روشنایی 12 ساعته و رطوبت 45 درصد نگه­داری ‌شدند. هم‌چنین حیوانات به صورت آزادانه به آب و غذا دسترسی داشتند. تمام مراحل آزمایش مطابق دستورالعمل مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه بود. در طول آزمایشات از حیوان‌آزاری خودداری گردید. این مطالعه حاصل پایان‌نامه کارشناسی ارشد دانشجوی دانشگاه آزاد اسلامی‌ واحد‌ شیراز  و با کد اخلاق IR.IAU.SHIRAZ.REC.1399.027  می‌باشد.
مانکوزب مورد استفاده (CAS: 8018-01-7) با خلوص 80 درصد بود که از کمپانی ایندوفیل هندی(Indofil chemical company, India) خریداری گردید. میزان دوز 500 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن (BW (1/10 LD50)) محلول در روغن زیتون یک روز در میان گاواژ شد [10]. هشت گروه مورد آزمایش که در هر گروه 8 موش قرار داشتند، وارد مطالعه شدند. با توجه به دوره اسپرماتوژنز در موش که 35 روز می‌باشد، موش­ها به مدت 35 روز در معرض حشره‌کش مانکوزب قرار گرفته و در گروه­های درمانی عصاره برگ‌ زیتون با دوزهای مشخص هم­زمان تجویز گردید. تجویز در همه گروه­ها به صورت گاواژ، در حجم نهایی 1 میلی‌لیتر بر کیلوگرم و به صورت یک روز در میان به مدت 5 هفته بود. گروه کنترل به منظور شرایط یکسان با سایر گروه­ها و حذف اثر استرس، به میزان 1 میلی­لیتر بر کیلوگرم نرمال سالین دریافت کردند. گروه دریافتی مانکوزب با دوز 500 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن محلول در روغن زیتون BW (1/10 LD50) [10] گروه‌های 3 تا 5 علاوه بر دریافت مانکوزب با میزان دوز 500 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن محلول در روغن زیتون [10] به ترتیب 200، 300 و 400 میلی‌گرم در کیلوگرم عصاره برگ زیتون را دریافت نمودند. گروه­های 6 تا 8 به ترتیب 200، 300 و 400 میلی‌گرم در کیلوگرم عصاره برگ زیتون را دریافت نمودند [12-11]. برگ گیاه زیتون پایان مرداد ماه از سیف‌آباد کازرون تهیه شده و بعد از تأیید نام علمی گیاه  (Olea L)europaea در گروه فارماکوگنوزی دانشکده داروسازی شیراز، یک نمونه هرباریومی از گیاه، در هرباریوم دانشکده قرار گرفت (KF 1434). به طور خلاصه جهت تهیه عصاره، مقدار 200 گرم برگ زیتون بعد از خشک شدن، آسیاب (مدل A11 Basic Analytical mill از کمپانیIKA  آلمان) و عبور دادن از الک با مش 300 با روش ماسراسیون با اتانول 80 درصد عصاره­گیری شد. مدت عصاره­گیری 72 ساعت می‌باشد که هر 24 ساعت یک مرتبه بعد از جدا کردن عصاره، حلال تازه به نمونه اضافه شد. بعد از جمع‌آوری کل عصاره به وسیله دستگاه تقطیر در خلاء (مدل RV10 Control از کمپانی IKA آلمان) تغلیظ و در دمای کم‌تر از 40 درجه سانتی­گراد به مدت 24 ساعت خشک گردید. عصاره خشک و توزین شده تا زمان انجام آزمایش در دمای منفی 20 درجه سانتی­گراد نگه­داری شد. با توجه به این­که عمده ترکیبات برگ زیتون از دسته فلاونوئیدها و اسیدهای فنولیک می­باشند، لذا به منظور استانداردسازی عصاره گیاهی با انجام Thin layer کروماتوگرافی و تعیین فلاونوئید غالب گیاه،  در 1000 گرم  از این عصاره برگ زیتون، محتوای کل فلاونوئید 43/1 گرم با استفاده از منحنی کالیبراسیون روتین و محتوای فنلی کل گیاه 44/1 گرم از منحنی استاندارد اسید گالیک محاسبه شد. به این طریق عصاره برگ‌زیتون گونهOlea europaea  تهیه شد [11].  پس از 35 روز تیمار طبق تقسیم‌بندی گروه­ها، موش­های هر گروه به روش نخاعی کشته شدند. پس از جراحی و بازکردن اسکروتوم، ناحیه وازدفران چپ جدا شده و در پتری دیشی که حاوی 5/1 سی­سی نرمال سالین بود قرار داده شد و شاخص‌های ذیل مورد بررسی قرار گرفت:
بررسی تراکم اسپرم: با استفاده از لام نئوبار و بر اساس تعداد برحسب میلیون در میلی­لیتر گزارش شد. سوسپانسیون محیط حاوی اسپرم، به نسبت 1:9 با فیکساتیو فرمالین 10درصد رقیق شده و بعد از 2 دقیقه و فیکس کردن اسپرم­ها، 10 میلی­لیتر از سوسپانسیون حاوی اسپرم بر روی لام نئوبار قرار داده شده و یک لامل به ابعاد 22×22 میلی­متر روی آن قرار گرفت. ضخامت مایعی که در زیر لامل پخش می­شود 20 میکرومتر در نظر گرفته شده و لام با بزرگنمایی 40 ارزیابی شد [13].
بررسی تحرک اسپرم: حرکات اسپرم بر اساس معیار سازمان بهداشت جهانی به 4 نوع تقسیم شد:
A: اسپرم­هایی با حرکت سریع و جلو رونده،B : اسپرم‌هایی با حرکت آهسته و جلو رونده، C: اسپرم­هایی با حرکت غیر پیش رونده یا درجا و D: اسپرم های بی حرکت تقسیم شد [14].  
بررسی شکل اسپرم: یک قطره از سوسپانسیون حاوی اسپرم روی لام کشیده شده و پس از خشک شدن توسط رنگ آمیزی ائوزین Y و چسباندن لامل روی نمونه، ارزیابی اسپرم‌ها زیر میکروسکوپ نوری (Nikon TS-100, Japan) با بزرگنمایی 1000 صورت گرفت [15]. بررسی درصد اسپرم‌های غیرطبیعی: جهت بررسی تغییرات شکلی اسپرم از معیار استاندارد Turk et al (2007) استفاده شد. در این روش اسپرم­ها با رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین مطالعه شد. سپس اسلایدها زیر میکروسکوپ نوری (Nikon TS-100, Japan) با بزرگنمایی 400 مشاهده شد. برای هر گروه 300 اسپرم در هر اسلاید مطالعه گردید [16]. جهت بررسی کمبود پروتامین اسپرم با رنگ آمیزی کرومومایسین(Chromomycin A3; CMA3)  ابتدا مایع استخراجی از انتهای وازدفران، پس از 3 بار شستشو  باPBS  (300 دور به مدت 5 دقیقه) از اسپرم­ها جدا شدند، سپس از اسپرم­های شسته شده جهت رنگ آمیزی CMA3 استفاده شد. به اسپرم­های شسته شده، حجم مساوی از محلول فیکساتیو کارنوی (متانول و اسیداستیک به نسبت 3 به 1) اضافه شده و به مدت 5 دقیقه در حرارت 4 درجه سانتی­گراد قرار گرفت. پس از تهیه اسمیر از نمونه، هر اسلاید با 100 میکرولیتر محلول 25 درصد از کرومومایسین در بافر مک الوین با 7=pH به مدت 20 دقیقه در محیط تاریک رنگ شده سپس اسلایدها با PBS شسته و با لامل مونت گردید. با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس (Japan-Nikon-Eclipse600) و بزرگ‌نمایی 100 تعداد 200 اسپرم در هر اسلاید شمارش شد. اسپرم­های درخشان، CMA3 مثبت و اسپرم­های فاقد درخشندگی، CMA3 منفی در نظر گرفته شد [17]. ارزیابی تخریب DNA به روش SCD (sperm chromatin dispersion) یا تفرق کروماتین: برطبق روش Fernandez مقدار 30 میکرو لیتر از نمونه اسپرمی آماده شده به روش گرادیان خالص اسپرم (غلظت 5 تا 10 میلیون در هر میلی­لیتر) با 70 میکرو لیتر از آگاروز با درجه ذوب پایین (low Melting Agarus) دردمای 37 درجه سانتی­گراد مخلوط شد. سپس  نمونه مخلوط شده برروی لامی که از قبل با آگاروز 65/0 درصد پوشیده شده، قرار گرفت. با گذاشتن یک لامل روی آن، به مدت 4 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد گذاشته شد. سپس با دقت لامل از سطح لام جدا شده و هر لام به صورت افقی در محلول اسید کلریدریک 08/0 نرمال به مدت 7 دقیقه در دمای اتاق و در تاریکی قرار داده شد و در درجه حرارت اتاق، به مدت 10 دقیقه در محلول تجزیه‌ کننده اول (5/7=pH) با محتوی: (تریز اسیدی 4/0 مولار، دومرکاپتواتانول 8/0 مولار، اس دی اس (SDS) یک درصد، اتیلن دی امید تترا استیک اسید (EDTA) 50 میلی مولار) و به دنبال آن در محلول تجزیه‌ کننده دوم (5/7=pH) با محتوی: (تریز 4/0 مولار، کلرید سدیم 2 مولار و اس دی اس (SDS) یک درصد) به مدت 5 دقیقه  قرار گرفت. لام در بافر تریز بورات (5/7=pH) با محتوی: (تریز بورات 09/0 مولار و اتیلن دی امید تترا استیک اسید (EDTA) 002/0 مولار) به مدت 2 دقیقه شستشو شده و به ترتیب در الکل 70، 90 و 100 درصد، هرکدام به مدت 2 دقیقه آب‌گیری شده و بعد از خشک شدن، با محلول رنگ دیفکوئیک رنگ‌آمیزی شده و توسط میکروسکوپ نوری (Olympus BH-2, Japan) بررسی شد. با استفاده از این روش می­توان میزان فراگمانتاسیون DNA را با توجه به وجود هاله اطراف هسته و اندازه آن بررسی نمود. در اسپرم­های با فراگمانتاسیون DNA (هسته اسپرم با هاله کوچک و بدون هاله به عنوان اسپرم تخریب شده) و هسته اسپرم بدون فراگمانتاسیون DNA (هسته اسپرم با هاله بزرگ و هاله متوسط) تعیین شد [18]. جهت بررسی سطح تستوسترون حدود 2 سی­سی خون از قلب حیوان تهیه شده و پلاسمای آن برای آنالیز در دمای 20- درجه سانتی­گراد ذخیره شد، سپس سطح تستوسترون با استفاده از کیت (ETE126)IBL اندازه­گیری شد [11].  داده­های جمع­آوری شده با استفاده از نرم­افزار SPSS نسخه 21 مورد تحلیل قرار گرفت. نتایج به صورت "انحراف معیار ± میانگین" گزارش شد. به منظور بررسی نرمال بودن توزیع داده­ها، از آزمون ناپارامتریKolmogorov-Smirnov  استفاده شد و فرض نرمال بودن برقرار بود (05/0<P). همگنی واریانس‌ها توسط آزمونLevene  بررسی شد و فرض همگنی واریانس گروه­ها نیز پذیرفته شد (05/0<P). میانگین گروه­ها با استفاده از آنالیز واریانس یک­طرفه و به دنبال آن آزمون تعقیبی Tukey مورد مقایسه قرار گرفت. سطح معنی­داری در آزمون­ها 05/0 در نظر گرفته شد.
نتایج
پارامترهای اسپرم شامل درصد اسپرم­های زنده، انواع حرکات، ناهنجاری‌های ظاهری، کمبود پروتامین اسپرم، میزان تفرق کروماتین و میزان هورمون تستوسترون بررسی گردید. بر طبق جدول 1، بیش‌ترین تعداد اسپرم­های زنده در گروه دریافت‌کننده 200 میلی‌گرمی عصاره برگ زیتون دیده شد و کمترین میزان آن در گروه دریافت‌کننده مانکوزب دیده شد (005/0=P).   بر اساس جدول 1: حرکات نوع سریع (A)، کند (B) و بی‌حرکت (D) در گروه­های مورد مطالعه اختلاف آماری معنی‌دار داشت (05/0˂P). کم‌ترین درصد حرکات نوع سریع و کند در گروه دریافت‌کننده مانکوزب دیده شد. بیش‌ترین حرکت نوع D و غیر پیش­رونده (C) در گروه مانکوزب دیده شد. از طرفی، حرکت نوع C که همان حرکات درجای اسپرم می‌باشد از نظر آماری اختلاف معنی‌داری را نشان نداد (431/0=P) (جدول1).

 
جدول 1- اثر مانکوزب و دوزهای مختلف عصاره برگ زیتون بر درصد اسپرم‌های زنده و انواع حرکات اسپرم در موش سوری پس از 5 هفته درمان
 

متغیر   گروه­های مطالعه	اسپرم­های زنده (درصد) انحراف معیار ± میانگین	حرکت سریع (درصد) انحراف معیار ± میانگین	حرکت کند (درصد) انحراف معیار ± میانگین	حرکت درجا (درصد) انحراف معیار ± میانگین	بی­حرکت (درصد) انحراف معیار ± میانگین
کنترل (تعداد=8)	53/11 ± 75/41	94/11 ± 12/53	79/7 ±  12/20	99/9 ±  25/15	01/5 ±  50/11
مانکوزب(تعداد=8)	a96/10 ±  50/30	22/8 ±  38/41a	16/3 ±  50/11a	41/8 ±  25/22	64/6 ±  88/24a
مانکوزب+200‌ میلی‌گرم عصاره برگ زیتون (تعداد=8)	b61/4 ±  12/44	20/6 ± 25/53	61/6 ±  01/26b	e60/6 ±  88/13	24/1 ±  88/6b
مانکوزب+300میلی‌گرم عصاره برگ زیتون (تعداد=8)	b81 /5 ±  80/42	58/8 ±  01/51	83/5 ±  17/25b	79/6 ±  60/13	87/2 ±  90/7b
مانکوزب+‌400میلی‌گرم عصاره برگ زیتون (تعداد=8)	b 19/7 ±  50/38	37/8 ±  88/52	95/6 ±  88/24b	71/6 ± 75/13	02/3 ±  50/8b
200میلی‌گرم عصاره برگ زیتون (تعداد=8)	32/8 ±  88/43b	25/9 ±  88/56b	20/4 ±  50/20	28/10 ± 12/14	72/2 ±  50/8b
300میلی‌گرم عصاره برگ زیتون (تعداد=8)	68/8 ±  02/34a	43/7 ±  80/53	78/5 ± 14/22	85/8 ± 11/16	13/7 ±  70/8b
400میلی‌گرم عصاره برگ زیتون (تعداد=8)	12/8 ±  50/32a	c69/13 ±  75/46	d48/7 ±  62/18	c49/10 ±  25/18	b85/9 ±  38/16
مقدار p	005/0	037/0	001/0>	434/0	001/0>

 
آنالیز واریانس یک­طرفه و آزمون تعقیبی Tukey، 05/0>P اختلاف معنی­دار. همه روش­های تجویز خوراکی یک روز در میان و به مدت 5 هفته بود. در هر متغیر، a تفاوت آماری معنی­دار با گروه کنترل، b تفاوت آماری معنی­دار با گروه مانکوزب،c تفاوت آماری معنی­دار با گروه 200میلی‌گرم عصاره برگ زیتون، dتفاوت آماری معنی­دار با گروه 300میلی‌گرم عصاره برگ زیتون ،e تفاوت آماری معنی­دار با گروه 400میلی‌گرم عصاره برگ زیتون.

بیش‌ترین کمبود پروتامین اسپرم، در گروه مانکوزب و کم‌ترین میزانش در گروه کنترل دیده شد (001/0=P). هرچه اسپرم میزان پروتامین کم‌تری داشته باشد کمبود پروتامین آن بیش‌تر گزارش می‌شود (جدول 2). هم­چنین در اسپرم­های زنده درصد ناهنجاری­های ساختاری در اسپرم در سه ناحیه سر، گردن و دم بررسی شد که در جدول 2 نشان داده شد. اختلالات ساختاری اسپرم (در ناحیه سر، گردن و دم) در بین گروه­های مورد مطالعه به طور معنی‌داری با هم تفاوت داشت (05/0˂P). بیش‌ترین ناهنجاری سر اسپرم، در گروه مانکوزب بود و کم‌ترین میزان آن در گروه دریافت‌ کننده 200 میلی‌گرمی عصاره برگ‌ زیتون دیده شد (003/0=P). بیش‌ترین ناهنجاری گردن اسپرم، در گروه مانکوزب دریافت ‌کننده 400 میلی‌گرمی عصاره برگ زیتون دیده شد و کم‌ترین میزان آن در گروه کنترل دیده شد (005/0=P). بیش‌ترین ناهنجاری دم اسپرم، در گروه کنترل دیده شد و کم‌ترین میزان آن در گروه مانکوزب دیده شد (002/0=P) (جدول 2). میزان کمبود پروتامین و اختلالات ظاهری در ناحیه سر، گردن و دم اسپرم در جدول 2 نشان داده شده است.

 
جدول 2- اثر مانکوزب و دوزهای مختلف عصاره هیدروالکی برگ زیتون بر کمبود پروتامین و درصد اختلالات ساختاری اسپرم در موش سوری پس از 5 هفته درمان

متغیر   گروه­های مطالعه	ناهنجاری سر اسپرم(درصد) انحراف معیار ± میانگین	ناهنجاری گردن اسپرم(درصد) انحراف معیار ± میانگین	ناهنجاری دم اسپرم(درصد) انحراف معیار ± میانگین	کمبود پروتامین(درصد) انحراف معیار ± میانگین
کنترل(تعداد=8)	18/6 ± 01/18	49/5 ± 75/45	68/8 ± 25/36	78/10 ±  50/26
مانکوزب(تعداد=8)	90/5 ± 50/24a	22/7 ± 12/54	38/7 ±  38/21a	29/14 ±  88/50a
مانکوزب+200‌میلی‌گرم عصاره برگ زیتون (تعداد=8)	87/5 ± 38/15b	88/10 ±  12/54	96/6 ±  50/30 d	73/7 ± 88/29b
مانکوزب+300میلی‌گرم عصاره برگ زیتون (تعداد=8)	17/3 ± 10/17 e	42/6 ± 20/55	17/7 ± 70/27	44/9 ± 07/28b
مانکوزب+‌400میلی‌گرم عصاره برگ زیتون (تعداد=8)	78/3 ± 50/17	30/6 ± 49/57a	98/4 ± 11/25a	73/9 ± 88/29b
200میلی‌گرم عصاره برگ زیتون(تعداد=8)	01/4 ± 88/14a	98/6 ± 25/55	43/7 ± 88/29	29/10 ± 62/28b
300میلی‌گرم عصاره برگ زیتون (تعداد=8)	42/5 ± 10/15b	74/8 ± 10/56	87/6 ± 80/28	28/8 ± 14/29b
400میلی‌گرم عصاره برگ زیتون(تعداد=8)	98/4 ± 62/22a	c 99/6 ± 88/47	54/7 ± 50/29	63/16 ± 88/36
مقدار p	003/0	005/0	002/0	001/0

 
آنالیز واریانس یک­طرفه و آزمون تعقیبی Tukey، 05/0>P اختلاف معنی­دار. همه روش­های تجویز خوراکی یک روز در میان و به مدت 5 هفته بود. در هر متغیر، a تفاوت آماری معنی­دار با گروه کنترل، b تفاوت آماری معنی­دار با گروه مانکوزب،c  تفاوت آماری معنی­دار با گروه 200 میلی‌گرم عصاره برگ زیتون، dتفاوت آماری معنی­دار با گروه 300 میلی‌گرم عصاره برگ زیتون ،e تفاوت آماری معنی­دار با گروه 400 میلی‌گرم عصاره برگ زیتون.
 

جهت بررسی سلامت DNA هسته اسپرم، با این روش رنگ آمیزی، هاله اطراف سر اسپرم هر چه بزرگ­تر و پر رنگ­تر باشد نشان­دهنده سلامت DNA هسته اسپرم می‌باشد و هر چه اندازه هاله کوچک­تر و کم رنگ­تر باشد نشان­دهنده تفرق و از هم گسیختگی ساختار هسته است. میانگین تست تفرق کروماتین اسپرم و تستوسترون به تفکیک هر گروه در جدول 3 نشان داده شده است. تست تفرق کروماتین SCD1، SCD3 و SCD4 در گروه­های مورد مطالعه اختلاف آماری معنی‌دار داشت (05/0˂P). کم‌ترین درصد حرکات نوع SCD1 و بیش‌ترین SCD3 در گروه دریافت‌کننده مانکوزب دیده شد. در حالی­که بیش‌ترین درصد حرکات نوع SCD1 و کم‌ترین SCD3 در گروه دریافت‌ کننده 200 میلی‌گرمی عصاره برگ زیتون دیده شد (جدول3).
براساس جدول 3، کم‌ترین میزان تستوسترون درگروه
مانکوزب دیده شد و بیش‌ترین میزان آن در گروه دریافتی200 میلی‌گرمی عصاره برگ زیتون دیده شد که از نظر آماری اختلاف معنی‌داری را نشان داد (001/0=P).

 
جدول 3- اثر مانکوزب و دوزهای مختلف عصاره هیدروالکی برگ زیتون  بر درجات تفرق کروماتین اسپرم و میزان تستوسترون در موش سوری پس از 5 هفته درمان

متغیر    گروه­های مطالعه	(درصد)SCD1 انحراف معیار ± میانگین	(درصد)SCD2 انحراف معیار ± میانگین	(درصد)SCD3 انحراف معیار ± میانگین	(درصد)SCD4 انحراف معیار ± میانگین	تستوسترون (نانوگرم/میلی لیتر) انحراف معیار ± میانگین
کنترل(تعداد=8)	64/7 ± 71/40a	69/7 ± 12/28	61/8 ± 12/21	29/3 ± 04/10	33/0 ± 75/2a
مانکوزب(تعداد=8)	37/6 ± 50/21	49/6 ± 12/28	96/9 ± 75/27	46/7 ± 62/22a	43/0 ± 83/1a
مانکوزب+200‌میلی‌گرم عصاره برگ زیتون (تعداد=8)	82/7 ± 12/40b	56/8 ± 62/25	95/8 ± 12/19 e	44/8 ± 12/15	47/0 ± 40/2b
مانکوزب+300میلی‌گرم عصاره برگ زیتون (تعداد=8)	23/6 ± 70/38b	c 85/7 ± 30/25	22/6 ± 20/17	90/4 ± 80/18	32/0 ± 35/2b
مانکوزب+‌400میلی‌گرم عصاره برگ زیتون (تعداد=8)	39/2 ± 50/39b	22/6 ± 25/26	41/3 ± 75/13b	42/5 ± 50/20 d	74/0 ± 16/2
200میلی‌گرم عصاره برگ زیتون (تعداد=8)	37/4 ± 11/43b	25/6 ± 75/29	42/5 ± 51/13b	15/3 ± 62/13b	38/0 ± 95/2b
300میلی‌گرم عصاره برگ زیتون (تعداد=8)	65/4 ± 28/41b	13/6 ± 88/28	65/4 ± 12/16	64/3 ± 72/13b	41/0 ± 74/2b
400میلی‌گرم عصاره برگ زیتون  (تعداد=8)	17/7 ± 38/33	86/2 ± 75/27	22/9 ± 75/14b	55/5 ± 38/23a	49/0 ± 49/2b
مقدار p	001/0>	91/0	013/0	001/0>	001/0

 
آنالیز واریانس یک­طرفه و آزمون تعقیبی Tukey، 05/0>P اختلاف معنی­دار. همه روش­های تجویز خوراکی یک روز در میان و به مدت 5 هفته بود. در هر متغیر، ^a تفاوت آماری معنی­دار با گروه کنترل، ^b تفاوت آماری معنی­دار با گروه مانکوزب،^c تفاوت آماری معنی­دار با گروه 200میلی‌گرم عصاره برگ زیتون، dتفاوت آماری معنی­دار با گروه 300میلی‌گرم عصاره برگ زیتون ،eتفاوت آماری معنی­دار با گروه 400میلی‌گرم عصاره برگ زیتون.
 

بحث
بر اساس نتایج مطالعه حاضر، در گروه دریافتی مانکوزب، میانگین اسپرم­های زنده وکیفیت حرکات اسپرم کاهش یافت. هم­چنین ناهنجاری­های ساختاری در اسپرم افزایش یافت، در حالی­که تجویز عصاره برگ زیتون باعث افزایش قابلیت حیات، بهبود شاخصه‌های حرکتی وکاهش ناهنجاری­های ساختاری در اسپرم شد. تحقیقات نشان دادند کیفیت کروماتین و هم‌چنین تعداد اسپرم یکی از فاکتورهای مستقیم اثرگذار بر فرآیند باروری است. اگر بیضه‌ها موفق به تولید اسپرم­های کافی و سالم نباشند، ناباروری با علت مردانه غیر ‌قابل اجتناب خواهد بود [19]. از بین دوزهای 200، 300 و400 میلی‌گرم از عصاره برگ زیتون، دوز 200 میلی‌گرم بر بهبود پارامترهای اسپرمی مؤثرتر بود. هم­چنین کمبود پروتامین در این دوز کم‌تر دیده شد که نشان‌دهنده سلامت کروماتین اسپرم می‌باشد [20]. در دوز 200 میلی‌گرم عصاره برگ زیتون، بیش‌ترین حرکات نوع A و کمترین ناهنجاری در ناحیه سر اسپرم دیده ‌شد. به طور‌کلی در ‌طی مراحل اسپرماتوژنز، رشته‌های کروماتین در هسته اسپرم فشرده شده و به جای هیستون‌ها در ساختار نوکلئوزومی سلول‌های سوماتیک، پروتامین‌ها که غنی از آرژنین هستند جایگزین می‌شوند. در مجموع 85 درصد از هیستون­ها به وسیله پروتامین­ها جایگزین می‌شوند. تصور می‌شود که این تراکم و به هم فشردگی هسته اسپرم برای محافظت ژنوم اسپرم از استرس­های خارجی نظیر اکسیداسیون یا درجه حرارت بالا مهم باشد [20].  از میان گروه‌های مورد مطالعه، سلامت کروماتین هسته‌ اسپرم، در گروه‌های دریافت‌کننده عصاره برگ زیتون بیش‌تر بود و از میان دوزهای مختلف عصاره برگ زیتون، در دوز 200 میلی‌گرم، بیش‌ترین  SCD1و SCD2 و کم‌ترین میانگین SCD3 دیده شد. هم­چنین بیش‌ترین میزان تستوسترون در دوز 200 میلی‌گرم عصاره برگ زیتون دیده شد. مطالعات دیگر محققین، نشان دادند که در نمونه‌هایی که درصد CMA3 مثبت آن­ها بیش از 30 درصد باشد، میزان لقاح پایین‌تر است [21-17]. نتایج این مطالعه نیز نشان داده که رابطه معنی‌داری بین کمبود پروتامین و مورفولوژی اسپرم وجود دارد، به نحوی که هر چه میزان کمبود پروتامین بیش‌تر باشد، ناهنجاری­های ساختاری در سر و گردن اسپرم بیش‌تر می‌شود [22]. گروه مانکوزب دارای کم‌ترین میزان اسپرم­های زنده بود. هم­چنین اختلالات ساختاری در ناحیه سر اسپرم در گروه مانکوزب بیش‌تر از دیگر گروه­ها بود. نتایج این مطالعه نشان داد که رابطه پارامترهای مورفولوژیکی و تحرک اسپرم، با کمبود پروتامین معنی‌دار است و هرچه کمبود پروتامین کم‌تر باشد، شاخصه‌های باروری اسپرم بهتر شده و حرکات رو به جلو اسپرم بیش‌تر می‌شود که تأیید کننده مطالعات قبلی است [22]. هم­چنین حضور اسپرم با مورفولوژی غیرطبیعی، بیانگر این واقعیت است که اسپرماتوزوا نتوانسته است فرآیند اسپرماتوژنز را تکمیل کند، لذا عامل تأثیرگذار بر فرآیند اسپرمیوژنز علاوه بر میزان تراکم کروماتین، مورفولوژی اسپرم را هم تحت تأثیر قرار می­دهد [23]. در نتیجه افزایش ناهنجاری‌های ساختاری در اسپرم، احتمالاً با کمبود پروتامین همراه است [24]. در این مطالعه هم بیش‌ترین میزان کمبود پروتامین در گروه مانکوزب دیده شد که بیش‌ترین اختلالات ساختاری و تفرق کروماتین را نیز داشت. از طرفی، بیش‌ترین تعداد اسپرم­های زنده، بیش‌ترین حرکات نوع A و کم‌ترین حرکات نوع D در گروه مانکوزب دریافت‌کننده 200 میلی‌گرم عصاره برگ زیتون گزارش شد.
 در این تحقیق بین کمبود پروتامین و حرکات نرمال اسپرم نیز رابطه معنی‌دار از نوع معکوس وجود داشت که با مطالعه Fallah و همکاران همخوانی داشت [24] و عنوان نمودند با افزایش میزان کمبود پروتامین در اسپرم، حرکات طبیعی و پیش­رونده اسپرم کاهش می­یابد و بدین نحو باروری فرد را تحت تأثیر قرار می دهد. Ray و همکارانش عنوان کردند که اختلالات فلاژل (ناحیه دم اسپرم) پیش آگهی خوبی دارند ولی اختلالات ناحیه آکروزوم اسپرم و ناحیه گردن اسپرماتوزئید، به شدت موفقیت باروری را کاهش می دهد، لذا به وضوح نقش اختصاصی قسمت‌های مختلف اسپرم را تشریح می‌کند [25]. میانگین تستوسترون در گروه مانکوزب دارای کم‌ترین میزان بود. اختلالات در میزان هورمون تستوسترون و آسیب DNA اسپرم یا ساختار کروماتین آن می‌تواند در هر مرحله از اسپرماتوژنز رخ دهد که در نهایت می­تواند بر قابلیت باروری اسپرم اثرگذار باشد [26]. آسیب DNA در اسپرماتوزوای بالغ می‌تواند به ‌علت نقایصی در بسته‌بندی کروماتین باشد که ممکن است از شکستگی‌های آندروژنی در DNA، روند آپوپتوز قبل از انزال اسپرم‌ها و یا تولید بالای رادیکال­های آزاد اکسیژن باشد که باعث صدمه به DNA اسپرم شده باشد [27]. از آن­جایی که آسیب یا شکست در DNA اسپرم وابسته به مقدار پروتامین هسته می‌باشد، هرچه اسپرم، میزان پروتامین بیش‌تری داشته باشد در مقابل شکست  DNAمقاوم­تر می‌باشد [20]. در این پژوهش مصرف مانکوزب میزان کمبود پروتامین اسپرم را افزایش داد، لذا می‌توان نتیجه گرفت که مانکوزب به عنوان تولید کننده رادیکال آزاد اکسیژن می‌تواند تغییراتی را در DNA ایجاد نماید که تأییدی بر مطالعات پیشین است [28]. در نهایت یکی از علل مهم ناباروری در مردان، وجود رادیکال­های آزاد در مایع ‌سمینال می­باشد که باعث اکسیداسیونDNA  اسپرم و تغییر بازهای آلی در ساختمان هسته می‌گردد و هم­چنین موجب کاهش قدرت حرکتی و باروری یا تخریب اسپرم می­شود [29]. لذا در این مطالعه به امتحان این فرضیه پرداختیم که آیا استفاده از عصاره برگ ‌زیتون به عنوان یک درمان حمایتی، قادر به کاهش آسیب احتمالی مانکوزب بر روی پارامترهای اسپرم و شاخصه‌های باروری موش سوری می‌باشد یا خیر؟ و هم­چنین در چه دوزی می‌تواند بیش‌ترین اثر بخشی را داشته باشد؟ درمان‌های زیادی مبنی بر استفاده از این گیاهان انجام شده است، در مطالعه­ایLee  و همکارانش نشان دادند که برگ زیتون در مقابله علیه نیترات­ها با دارا بودن ترکیبات فنولی فراوان و خاصیت آنتی‌اکسیدانی و ضد میکروبی، برای سلامت انسان­ها مفید و وجود آن­ها در داروهای پزشکی می‌تواند بسیار مؤثر باشد. در حقیقت ترکیبات فنولی باعث شکستن زنجیره‌های رادیکال­های آزاد می‌شوند [8]. نشان داده شده که گیاه زیتون به دلیل داشتن ترکیبات فنولی می‌تواند با مهار فعالیت اکسیدها،  التهاب را سرکوب کرده و در سلامت سیستم تولید مثلی مؤثر واقع شود [12-11]. در این مطالعه میزان فنول تام بر اساس گالیک اسید و فلاونوئید بر اساس روتین تعیین مقدار شد. مطالعات متنوعی به بررسی ترکیبات موجود در عصاره برگ ‌زیتون و اثراتش بر سیستم تولید‌مثل پرداخته اند؛ از جمله، Alirezaei و همکاران با بررسی اولئوروپین مشتق از برگ زیتون و بررسی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی گلوتاتیون (Glutathione) و سوپر‌اکسید‌دسموتاز (Superoxide dismutase) مشاهده کردند که اثرات منفی اکسید‌های ایجاد شده توسط الکل بر سیستم تولید‌مثلی موش‌صحرایی نر، با اولئوروپین کاهش می‌یابد [30]. هم­چنین Moienie و همکاران نیز با مشاهده کاهش سطح هورمون‌های جنسی و سلول‌های اسپرماتوگونی در موش‌های دیابتی، پی بردند که اثرات جانبی دیابت با استفاده از برگ‌ زیتون در دوز 500 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن بهبود می‌یابد [31]. دوز 200 میلی‌گرم عصاره برگ زیتون، در این مطالعه بهترین حفاظت اسپرمی را ایجاد نمود در حالی­که دوز 300 و 400 میلی‌گرم چندان پارامترهای اسپرم را بهبود نبخشید. در مطالعه Hakemi و همکاران نیز تجویز دوزهای 250 و 500 میلی‌گرم عصاره برگ‌زیتون بر اثرات تجویز بوسولفان مؤثر بود، در حالی­که دوز 750 میلی‌گرم اثرات مخربی بر پارامترهای اسپرم داشت [11]. همسو با نتایج این مطالعه، تحقیقات Heilman و همکاران نشان داد که عصاره‌های گیاهان ممکن است در دوز های بالاتر اثر تخریبی داشته باشند از جمله برگ ‌زیتون که آن نیز در غلظت‌های بالا تأثیر مخرب دارد [32]. از محدودیت­های این مطالعه این­که مکانیسم‌های مولکولی درگیر در روند حفاظتی عصاره برگ‌زیتون بررسی نشد لذا نیاز به مطالعات بیش‌تری دارد. هم­چنین ارزیابی و اندازه‌گیری آنزیم­های آنتی‌اکسیدانی موجود در عصاره برگ ‌زیتون و تعیین اثرات حفاظتی آن بر سمیت‌های کبدی و کلیوی ناشی از مانکوزب و یا سایر آلکیله‌کننده‌ها جهت مطالعات آتی پیشنهاد می‌شود.
نتیجه‌گیری
بر‌اساس نتایج مطالعه حاضر، تیمار با دوز 200 میلی‌گرم بر کیلو‌گرم عصاره برگ‌زیتون، اثرات مثبتی بر روند اسپرماتوژنز، پروتامین و سلامت کروماتین هسته اسپرم موش­های در معرض مانکوزب داشت، در حالی­که دوز 300 و400 میلی‌گرم این عصاره چندان بهبود مناسبی را در شاخصه‌های اختصاصی اسپرم‌ها ایجاد نکرد. لذا به نظر می‌رسد تجویز عصاره برگ‌ زیتون با دوز 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم احتمالاً بتواند جهت حفاظت و بهبود وضعیت اسپرماتوژنز افرادی که به ‌ناچار در معرض مانکوزب یا سایر آلکیله‌کننده‌ها قرار می‌گیرند مؤثرتر باشد.
تشکر و قدردانی
این مطالعه حاصل پایان‌نامه دانشجوی مقطع کارشناسی ارشد رشته بیوشیمی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شیراز بوده، لذا از معاونت محترم پژوهشی جهت حمایت مالی پایان‌نامه و اساتید محترم گروه جهت ثبت پایان­نامه کمال تشکر و قدردانی به عمل می­آید.

 

 
References
 
 

[1] Alahmar AT. Role of oxidative stress in male infertility: An updated review. J Hum Reprod Sci 2019; 12(1): 4–18.
[2] Agarwal A, Mulgund A, Hamada A, Chyatte MR. A unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol 2015; 13(1): 1-9.
[3] Rajender S, Avery K, Agarwal A. Epigenetics, spermatogenesis and male infertility. Mutat Res Rev Mutat Res 2011; 727(3): 62-71.
[4] Mathur N, Pandey G, Jain GC. Pesticides: A review of the male reproductive toxicity. J Herbal Med Toxicol 2010; 4(1): 1-8.
[5] Kwon D, Chung HK, Shin WS, Park YS, Kwon SC, Song JS, et al. Toxicological evaluation of dithiocarbamate fungicide mancozeb on the endocrine functions in male rats. Mol Cell Toxicol 2018; 14(1): 105-12.
[6] Neto FT, Bach PV, Najari BB, Li PS, Goldstein M. Spermatogenesis in humans and its affecting factors. Semin Cell Dev Biol 2016; 59: 10-26.
[7] Mehrpour O, Karrari P, Zamani N, Tsatsakis AM, Abdollahi M. Occupational exposure to pesticides and consequences on male semen and fertility: a review. Toxicol Lett 2014; 230(2): 146-56.
[8] Lee OH, Lee BY. Antioxidant and antimicrobial activities of individual and combined phenolics in Olea europaea leaf extract. Bioresour Technol 2010; 101(10): 3751-4.
[9] Sangi SM, Bawadekji A, Alotaibi NM, Aljalaud NA. Preventive and Curative Effects of Metformin, Nigella sativa, Punica granatum and Zingiber officinale on Male Reproductive Dysfunction in Diabetic Rats. Int J Pharm Res Allied Sci 2019; 8(2): 48-57.
[10] Saddein E, Haghpanah T, Nematollahi-Mahani SN, Seyedi F, Ezzatabadipour M. Preventative effects of vitamin E on testicular damage and sperm parameters in the first-generation mice pups due to pre-and postnatal mancozeb exposure. J Toxicol 2019; 1: 1-12.
[11] Hakemi SG, Sharififar F, Haghpanah T, Babaee A, Eftekhar-Vaghefi SH. The effects of olive leaf extract on the testis, sperm quality and testicular germ cell apoptosis in male rats exposed to busulfan. Int J Fertil Steril 2019; 13(1): 57–65.
[12] Yaghoubi A, Shahedi A, Akbari H, Nematollahi-Mahani SN. Do insulin replacement and omega3 protect the male reproductive function of the streptozotocin-induced diabetic mice?. J Nutr Metab 2017; 2: 6-12.
[13] Bakos HW, Mitchell M, Setchell BP, Lane M. The effect of paternal diet‐induced obesity on sperm function and fertilization in a mouse model. Int J Androl 2011; 34(5): 402-10.
[14] Maggavi RR, Pujari SA, Vijaykumar CN. Motility Analysis with Morphology: Study Related to Human Sperm. Procedia Comput Sci 2019; 152: 179-85.
[15] Mangiagalli MG, Cesari V, Cerolini S, Luzi F, Toschi I. Effect of lycopene supplementation on semen quality and reproductive performance in rabbit. Qom Univ Med Sci J 2012; 20(3): 141-8. [Farsi]
[16] Ni K, Spiess AN, Schuppe HC, Steger K. The impact of sperm protamine deficiency and sperm DNA damage on human male fertility: a systematic review and meta‐analysis. Andrology 2016; 4(5): 789-99.
[17] Fernandez JL, Muriel L, Rivero MT, Goyanes V, Vazquez R, Alvarez JG. The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation. J Androl 2003; 24(1): 59-66.
[18] Ammar O, Houas Z, Mehdi M. The association between iron, calcium and oxidative stress in seminal plasma and sperm quality. Environ Sci Pollut Res Int 2019; 26(14): 14097-105.
 [19] Akbari H, Saleh M, Heidari MH, Ghaffari Novin M, Azargashb E. Evaluation of sperm parameters and chromatin abnormalities in male infertility using CASA and chromatin dispersion test. Research in Medicine 2013; 36(4): 176-83. [Farsi]
[20] Nasr‐Esfahani MH, Naghshizadian N, Imani H, Razavi S, Mardani M, Kazemi S, et al. Can sperm protamine deficiency induce sperm premature chromosomal condensation?. Andrologia 2006; 38(3): 92-8.
[21] Akbari H, Forouzandeh H, Ghavamizadeh M. Protective Effects of Zinc Supplement on Chromatin Deficiency and Sperm Parameters in Streptozotocin-Induced Diabetic Rats. Intern Med J 2020; 27(5): 1-5.
[22] Salehi M, Akbari H, Heidari MH, Molouki A, Murulitharan K, Moeini H, et al. Correlation between human clusterin in seminal plasma with sperm protamine deficiency and DNA fragmentation. Mol Reprod Dev 2013; 80(9): 718-24.
[23] Zini A, Albert O, Robaire B. Assessing sperm chromatin and DNA damage: clinical importance and development of standards. Andrology 2014; 2(3): 322-5.
[24] Fallah A, Mohammad-Hasani A, Colagar AH. Zinc is an essential element for male fertility: a review of Zn roles in men’s health, germination, sperm quality, and fertilization. J Reprod Infertil 2018; 19(2): 69–81.
[25] Ray PF, Toure A, Metzler‐Guillemain C, Mitchell MJ, Arnoult C, Coutton C. Genetic abnormalities leading to qualitative defects of sperm morphology or function. Clin Genet 2017; 91(2): 217-32.
[26] Rathke C, Baarends WM, Awe S, Renkawitz-Pohl R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochim Biophys Acta 2014; 1839(3): 155-68.
[27] Ménézo Y, Dale B, Cohen M. DNA damage and repair in human oocytes and embryos: a review. Zygote 2010; 18(4): 357-65.
[28] Cardoso JP, Cocuzza M, Elterman D. Optimizing male fertility: oxidative stress and the use of antioxidants. World J Urol 2019; 37(6): 1029-34.
[29] Almeer RS, Abdel Moneim AE. Evaluation of the protective effect of olive leaf extract on cisplatin-induced testicular damage in rats. Oxid Med Cell Longev 2018; 7(6): 13-8.
[30] Alirezaei M, Kheradmand A, Heydari R, Tanideh N, Neamati S, Rashidipour M. Oleuropein protects against ethanol-induced oxidative stress and modulates sperm quality in the rat testis. Med J Nutrition Metab2012; 5(3): 205-11.
[31] Moienie F, Mokhtari M, Sharifi E. The effect of hydro-alcoholic leaf extract of olea europaea on the levels of gonadotropins, sex hormones and spermatogenesis in diabetic rat. J Anim Physiol Dev 2014; 5: 11-6.
[32] Heilman J, Anyangwe N, Tran N, Edwards J, Beilstein P, López J. Toxicological evaluation of an olive extract, H35: subchronic toxicity in the rat. Food Chem Toxicol 2015; 84: 18-28..

---