جلد 21، شماره 2 - ( 2-1401 )
جلد 21 شماره 2 صفحات 220-207 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Nikasa M, Noruzinia M, Farshdousti Hagh M. Evaluation of Changes in Global DNA Methylation during Osteoblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells: A Laboratory Study. JRUMS 2022; 21 (2) :207-220
URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-6327-fa.html
URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-6327-fa.html
نیک آسا مینا، نوروزی نیا مهرداد، فرش دوستی حق مجید. ارزیابی تغییرات متیلاسیون تام ژنوم در طول تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی: یک مطالعه آزمایشگاهی. مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان. 1401; 21 (2) :207-220
گروه ژنتیک، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تبریز، تبریز، ایران
متن کامل [PDF 546 kb]
(708 دریافت)
| چکیده (HTML) (925 مشاهده)
شکل 1- رنگ آمیزی آلیزارین رد. (الف) سلول‌های تمایز‌یافته استئوبلاستی تیمار‌شده با محیط تمایزی در روز 21 تمایز. (ب) سلول‌های تمایز یافته استئوبلاستی تیمار شده با زولدرونیک اسید در روز 21 تمایز. (ج) سلول‌های بنیادی مزانشیمی.
References
Evaluation of Changes in Global DNA Methylation during Osteoblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells: A Laboratory Study
Mina Nikasa[4], Mehrdad Noruzinia[5], Majid Farshdousti Hagh[6]
Received: 11/12/21 Sent for Revision: 04/01/22 Received Revised Manuscript: 24/04/22 Accepted: 25/04/22
Background and Objectives: Control processes in osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells are not yet fully understood. Epigenetic mechanisms, especially the methylation of CpG Islands in the promoter of genes, are considered as one of the most important control mechanisms in stem cell differentiation. In the process of differentiation, it is debated whether only the methylation of specific genes changes or the methylation of global DNA. Therefore, in the present study, the state of global DNA methylation was evaluated during osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells by differentiation medium and also in treatment by zoledronic acid.
Materials and Methods: In this laboratory study, after isolation and proliferation of mesenchymal stem cells, induction of osteoblastic differentiation was done using differentiating medium and zoledronic acid. DNA extraction was performed at differentiation weeks 1, 2, and 3 as well as from undifferentiated mesenchymal stem cells. Global DNA methylation status was assessed by antibodies against 5-methyl cytosine. Repeated measurement design test was used to analyze the data.
Results: Global DNA methylation status of the genome did not change during osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells (p=0.093). Also, treatment with zoledronic acid had no effect on global DNA methylation (p=0.057).
Conclusion: Osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells by differentiation medium and also in treatment with zoledronic acid is not associated with altered global methylation of the genome. Therefore, the differentiation process of mesenchymal stem cells to osteoblasts is a unique pathway, and possibly other genetic and epigenetic mechanisms play a role in controlling it.
Key words: Osteoblast, Mesenchymal stem cells, Differentiation, Global DNA methylation, Zoledronic acid
Funding: This study was funded by Tabriz University of Medical Sciences.
Conflict of interest: None declared.
Ethical approval: The Ethics Committee of Tabriz University of Medical Sciences approved the study (IR.TBZMED.VCR.REC.1398.242).
How to cite this article: Nikasa Mina, Noruzinia Mehrdad, Farshdousti Hagh Majid. Evaluation of Changes in Global DNA Methylation during Osteoblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells: A Laboratory Study. J Rafsanjan Univ Med Sci 2022; 21 (02): 207-20. [Farsi]
متن کامل: (556 مشاهده)
مقاله پژوهشی
مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان
دوره 21، اردیبهشت 1401، 220-207
ارزیابی تغییرات متیلاسیون تام ژنوم در طول تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی: یک مطالعه آزمایشگاهی
مینا نیک‌آسا[1]، مهرداد نوروزی‌نیا[2]، مجید فرش‌‌‌‌‌دوستی حق[3]
دریافت مقاله: 20/09/1400 ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 14/10/1400 دریافت اصلاحیه از نویسنده: 04/02/1401 پذیرش مقاله: 05/02/1401
چکیده
زمینه و هدف: فرآیندهای کنترلی در تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی هنوز به طور کامل شناخته نشده است. مکانیسم‌های اپی ژنتیک مخصوصاً متیلاسیون جزایر CpG در پروموتر ژن‌ها به عنوان یکی از مهم‌ترین مکانیسم‌های کنترلی در تمایز سلول‌های بنیادی مطرح است. این‌که در فرآیند تمایز تنها متیلاسیون برخی از ژن‌های خاص تغییر می‌یابد یا متیلاسیون تام ژنوم دست‌خوش تغییرات می‌گردد، مورد بحث است. لذا در این تحقیق وضعیت متیلاسیون تام ژنوم در طول تمایز استئوبلاستیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی با محیط تمایزی و هم‌چنین در تیمار با داروی زولدرونیک اسید مورد ارزیابی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها: در این پژوهش آزمایشگاهی پس از کشت و تکثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی، القاء تمایز استئوبلاستی با استفاده از محیط تمایزی و داروی زولدرونیک اسید صورت گرفت. استخراج DNA در هفته اول، دوم و سوم تمایز و هم‌چنین از سلول‌های بنیادی مزانشیمی تمایز نیافته صورت گرفت. وضعیت متیلاسیون تام ژنوم با استفاده از آنتی بادی بر علیه 5-متیل سیتوزین ارزیابی شد. برای تحلیل داده از آزمون طرح اندازه‌گیری مکرر استفاده شد.
یافته‌ها: در طول تمایز استئوبلاستیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی وضعیت متیلاسیون تام ژنوم تغییر پیدا نکرد (093/0=p). هم‌چنین تیمار با داروی زولدرونیک اسید بر روی متیلاسیون تام ژنوم تأثیر نداشت (057/0=p).
نتیجه‌گیری: تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی با استفاده از محیط تمایزی و نیز در تیمار با داروی زولدرونیک اسید، با تغییر متیلاسیون تام ژنوم همراه نیست. بنابراین فرآیند تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی به استئوبلاست‌ها یک مسیر منحصر به فرد بوده و احتمالاً سایر مکانیسم‌های ژنتیکی و اپی‌ژنتیکی در کنترل آن ایفای نقش می‌نماید.
واژه‌های کلیدی: استئوبلاست، سلول‌های بنیادی مزانشیمی، تمایز، متیلاسیون تام ژنوم، زولدرونیک اسید
مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان
دوره 21، اردیبهشت 1401، 220-207
ارزیابی تغییرات متیلاسیون تام ژنوم در طول تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی: یک مطالعه آزمایشگاهی
مینا نیک‌آسا[1]، مهرداد نوروزی‌نیا[2]، مجید فرش‌‌‌‌‌دوستی حق[3]
دریافت مقاله: 20/09/1400 ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 14/10/1400 دریافت اصلاحیه از نویسنده: 04/02/1401 پذیرش مقاله: 05/02/1401
زمینه و هدف: فرآیندهای کنترلی در تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی هنوز به طور کامل شناخته نشده است. مکانیسم‌های اپی ژنتیک مخصوصاً متیلاسیون جزایر CpG در پروموتر ژن‌ها به عنوان یکی از مهم‌ترین مکانیسم‌های کنترلی در تمایز سلول‌های بنیادی مطرح است. این‌که در فرآیند تمایز تنها متیلاسیون برخی از ژن‌های خاص تغییر می‌یابد یا متیلاسیون تام ژنوم دست‌خوش تغییرات می‌گردد، مورد بحث است. لذا در این تحقیق وضعیت متیلاسیون تام ژنوم در طول تمایز استئوبلاستیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی با محیط تمایزی و هم‌چنین در تیمار با داروی زولدرونیک اسید مورد ارزیابی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها: در این پژوهش آزمایشگاهی پس از کشت و تکثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی، القاء تمایز استئوبلاستی با استفاده از محیط تمایزی و داروی زولدرونیک اسید صورت گرفت. استخراج DNA در هفته اول، دوم و سوم تمایز و هم‌چنین از سلول‌های بنیادی مزانشیمی تمایز نیافته صورت گرفت. وضعیت متیلاسیون تام ژنوم با استفاده از آنتی بادی بر علیه 5-متیل سیتوزین ارزیابی شد. برای تحلیل داده از آزمون طرح اندازه‌گیری مکرر استفاده شد.
یافته‌ها: در طول تمایز استئوبلاستیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی وضعیت متیلاسیون تام ژنوم تغییر پیدا نکرد (093/0=p). هم‌چنین تیمار با داروی زولدرونیک اسید بر روی متیلاسیون تام ژنوم تأثیر نداشت (057/0=p).
نتیجه‌گیری: تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی با استفاده از محیط تمایزی و نیز در تیمار با داروی زولدرونیک اسید، با تغییر متیلاسیون تام ژنوم همراه نیست. بنابراین فرآیند تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی به استئوبلاست‌ها یک مسیر منحصر به فرد بوده و احتمالاً سایر مکانیسم‌های ژنتیکی و اپی‌ژنتیکی در کنترل آن ایفای نقش می‌نماید.
واژه‌های کلیدی: استئوبلاست، سلول‌های بنیادی مزانشیمی، تمایز، متیلاسیون تام ژنوم، زولدرونیک اسید
مقدمه
تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی (Mesenchymal Stem Cells; MSCs) به استئوبلاست‌ها یک پروسه تکاملی به شدت کنترل شده‌ای می‌باشد که تعداد زیادی از عوامل بیرونی مثل هورمون‌ها، فاکتورهای رشد، مسیرهای پیام رسان و فاکتورهای رونویسی و غیره در آن دخالت دارند. فهم مکانیسم‌های دخیل در تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی به سلول‌های استئوبلاست از بحث‌های مهمی در بیولوژی استخوان بوده و اهداف درمانی جدید را در درمان بیماری‌های استخوانی پیش روی محققیق قرار می‌دهد ]1[.
تکثیر و تمایز استئوبلاست‌ها توسط فاکتورهای نسخهبرداری زیادی شامل فاکتورهای نسخهبرداری از خانواده پروتئین‌های مارپیچ-حلقه-مارپیچ (Helix-Loop-Helix)، پروتئین‌های انگشت روی (Zinc Finger)، پروتئین‌های قیچی لوسین (Lucine Zipper) و پروتئین‌های حاوی دومن Runt، و هم‌چنین پروتوانکوژن‌هایی همانند C-myc، C-jun و C-fos تحت کنترل و تنظیم است. قابلیت تمایز MSCs به رده‌های مختلف سلولی از جمله استئوبلاست به دلیل پتانسیل بیان ژن‌ها یا فاکتورهای نسخهبرداری اختصاصی دخیل در تمایز می‌باشد. دو فاکتور نسخهبرداری اختصاصی رده استئوبلاستیک شامل RUNX2 و OSTERIX (SP7) می‌باشد ]3-2[. این فاکتورهای نسخهبرداری ژن‌های اختصاصی استئوبلاستی شامل استئوکلسین، استئوپونتین، کلاژن تایپ IαI و سیالوپروتئین استخوانی (Bone Sialoprotein) را مورد رونویسی قرار می‌دهند. سایر فاکتورهای نسخهبرداری دخیل در تمایز استئوبلاستی شامل TWIST1، ZBTB16، DLX5، MSX2، FRA1، DLX3، ATF4 و C/EBP هستند [4]. نقش تغییرات متیلاسیون ناحیه پروموتوری اکثر این ژن‌ها و نیز الگوی بیان آن‌ها در تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی مورد شناسایی قرار گرفته است و نشان دهنده تغییرات الگوی متیلاسیون ناحیه پروموتوری ژن‌های اختصاصی رده استئوبلاستی در طول تمایز اسئوبلاستیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی می‌باشد [9-5]. در عین حال اطلاعاتی که نشان دهنده تغییرات متیلاسیون تام ژنوم در طول تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی باشد می‌تواند اطلاعات تکمیل کننده‌ای را در این زمینه ارائه دهد.
زولدرونیک اسید یک آمینو بی فسفونات و مهار‌کننده قوی بازجذب استخوان و در عین حال فعال‌کننده استئوبلاست‌ها در استخوان سازی می‌باشد. از این دارو جهت پیشگیری از حوادث اسکلتی در بیمارانی که دچار بدخیمی‌های پیشرفته استخوانی شده‌اند و هم‌چنین در درمان برخی اختلالات استخوانی که با افزایش Turn over استخوان همراه‌اند مثل بیماری پاژه و استئوپروز استفاده می‌شود [11-10]. مکانیسم اصلی این دارو مهار استئوکلاست‌ها و در نتیجه مهار بازجذب کلسیم از استخوان‌ها است، اما در عین حال این دارو با تسریع در تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی باعث افزایش تعداد و نیز فعالیت استئوبلاست‌ها می‌گردد ]7[ که مکانیسم ملکولی آن هنوز به خوبی شناخته نشده است.
مکانیسم اصلی برای تغییرات اپی ژنتیک DNA ژنومی، هیپرمتیلاسیون جزایر CpG در ژن‌های اختصاصی و هیپومتیلاسیون کلی DNA می‌باشد [12]. پروسه متیلاسیون DNA شامل انتقال گروه متیل از S-آدنوزیل-L-متیونین توسط آنزیم DNA متیل ترانسفراز (DNA Methyl Transferase; DNMT) بر روی کربن شماره 5 سیتوزین می‌باشد. متیلاسیون DNA اختصاصی ناحیه (Region Specific) عمدتاً در دی نوکلئوتیدهای CpG درون پروموتر یا اگزون اول ژن‌ها یافت می‌شود که یک مسیر مهم برای مهار نسخهبرداری ژن است [13].
آنالیز متیلاسیون تام ژنوم یک تصویر کلی از تغییرات متیلاسیون DNA در گستره ژنوم ارائه می‌دهد و هم‌چنین مقایسه مناسبی بین وضعیت متیلاسیون یک ژن و وضعیت متیلاسیون تام ژنوم ایجاد می‌کند. اهمیت بررسی تغییرات متیلاسیون تام ژنوم و مقایسه آن با متیلاسیون ژن‌های اختصاصی در این است که آیا وضعیت متیلاسیون ژن‌های اختصاصی متأثر از تغییرات متیلاسیون تام ژنوم هستند یا این‌که وضعیت متیلاسیون ژن‌ها، اختصاصی بوده و مربوط به پروسه تمایز سلول‌ها است؟ از طرف دیگر بررسی متیلاسیون تام ژنوم نشان می‌دهد که آیا وضعیت متیلاسیون تام ژنوم در طول تمایز تغییر می‌کند یا نه؟ ]14[ با توجه به اهمیت پاسخ به این سؤالات، در این مطالعه سلول‌های بنیادی مزانشیمی با استفاده از محیط تمایزی استئوبلاستی و هم‌چنین در تیمار با داروی زولدرونیک اسید به سمت استئوبلاست‌ها تمایز داده شدند و تغییرات اپی‌ژنتیک به صورت تغییرات متیلاسیون تام ژنوم مورد ارزیابی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
این پژوهش آزمایشگاهی در سال 1399 با کد اخلاق IR.TBZMED.VCR.REC.1398.242 در دانشگاه علوم پزشکی تبریز انجام شد. در این مطالعه، سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان انسان از مرکز تحقیقات فناوری بن‌یاخته تهران تهیه گردید. این سلول‌ها در مرکز تحقیقات فناوری بن‌یاخته از نظر توانایی تمایز به رده‌های آدیپوژنیک، کندروژنیک و استئوژنیک مورد ارزیابی قرار گرفته و تأیید شده بودند. ماهیت سلول‌های بنیادی مزانشیمی با استفاده از تکنیک فلوسیتومتری قبلاً مورد تأیید قرار گرفته بود [15]. سلول‌های بنیادی مزانشیمی با شمارش 30000 سلول در میلی لیتر در فلاسک کشت سلول 75T به همراه 20 میلی‌لیتر محیط کشتDulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM)-low glucose (Gibco) و 10 درصد Fetal Bovine Serum (FBS) و 100 واحد بر میلی‌لیتر پنیسیلین و 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر استرپتومایسین در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد (مدل 3487، شرکت بهداد، ایران) با دی اکسید کربن 5 درصد کشت داده شدند [16]. سلول‌های کشت داده شده بعد از رسیدن به تراکم 70-60 درصد با تریپسین جدا شده و تعدادی از سلول‌ها مجدداً پاساژ داده شده و تعداد دیگر جهت القاء تمایز استئوبلاستیک و تیمار با داروی زولدرونیک اسید مورد استفاده قرار گرفتند.
تمایز استئوبلاستیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی در پاساژ دوم انجام شد. برای تهیه محیط تمایزی استئوبلاستی از محیط کشت عمومی DMEM، L-گلوتامین و 10 درصد FBS استفاده شد که به این محیط کشت فاکتورهای دگزامتازون با غلظت نهایی 10 نانومولار، بتا گلیسرول فسفات با غلظت نهایی 5 میلی مولار و آسکوربات-2-فسفات با غلظت نهایی 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر اضافه گردید. نمونه برداری از سلول‌های بنیادی مزانشیمی تمایز‌نیافته (روز 0) و سلول‌های استئوبلاستی تمایز‌یافته (هفته اول، دوم و سوم) صورت گرفت ]17[.
ویال‌های حاوی 4 میلیگرم پودر داروی زولدرونیک اسید از نمایندگی شرکت دارویی نوارتیس (Novartis pharma, Basel, Switzerland) در تهران تهیه گردید. این دارو در محیط کشت حل گردید. از غلظت نهایی 5 میکرومولار زولدرونیک اسید در محیط کشت، جهت تیمار به مدت 3 ساعت استفاده شد که اصطلاحاً تیمار ضربانی (Pulse Treatment) طبق مطالعات قبلی صورت گرفت. سپس محیط کشت تخلیه شده و با PBS شستشو داده شد. نهایتاً محیط تمایزی بر روی آن‌ها اضافه شد و به مدت 21 روز کشت داده شدند. علاوه بر سلول‌های تیمار‌شده با زولدرونیک اسید، MSCs بدون تیمار به عنوان کنترل کشت داده شدند. نمونه برداری از سلول‌های بنیادی مزانشیمی تمایز نیافته (روز 0) و سلول‌های استئوبلاستی تیمار شده در بازه زمانی هفته اول، دوم و سوم صورت گرفت [18].
رنگ‌آمیزی آلیزارین رد برای تأیید تمایز استئوبلاستی استفاده گردید. برای انجام این آزمایش سلول‌های بنیادی مزانشیمی در پلیت‌های 6 خانه‌ای کشت داده شدند. گروهی از سلول‌ها با محیط تمایزی استئوبلاستی و گروهی با داروی زولدرونیک اسید تیمار شدند و گروهی هم به عنوان کنترل بدون تیمار کشت داده شدند. رنگ آمیزی آلیزارین رد در روز 21 کشت انجام گرفت. جهت رنگ‌آمیزی در روز 21، محیط کشت تخلیه شده و سلول‌ها با PBS شستشو شدند. فرمالدهید 40 درصد جهت فیکساسیون استفاده شد و مجدد با PBS شستشو شدند. نهایتاً آلیزارین رد 1 درصد اضافه شده و به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند. سپس با آب مقطر شستشو شده و وجود یا عدم وجود رسوب‌های قرمز رنگ کلسیم در زیر میکروسکوپ معکوس (مدل CKX53، شرک الیمپوس، ژاپن) مورد ارزیابی قرار گرفتند ]19[.
تعداد 106×4-3 سلول از هر فلاسک T75 جهت استخراج DNA ژنومی سلول‌های استئوبلاستی تمایز یافته و سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با داروی زولدرونیک اسید (روز 7، 14 و 21) و نیز سلول‌های بنیادی مزانشیمی تمایز نیافته با استفاده از کیت استخراج DNA شرکت Roche طبق پروتکل مورد استفاده قرار گرفتند. کیفیت DNA استخراج شده با الکتروفورز بر روی ژل آگارز بررسی شد. مقدار DNA استخراج شده به واسطه جذب در طول موج 260 نانومتر اندازه‌گیری شد. خلوص DNA استخراج شده از طریق نسبت جذب در طول موج 260 نانومتر به 280 نانومتر سنجیده شد ]20[.
تغییرات متیلاسیون تام ژنوم در طول تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی به استئوبلاست تحت تأثیر محیط تمایزی و هم‌چنین در طول تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار‌شده با داروی زولدرونیک اسید با استفاده از کیت Methylamp Global DNA Methylation Quantification Ultra Kit (Epigentek Group Inc., NY, USA) با استفاده از تکنیک الایزا به صورت Triplicate مورد سنجش قرار گرفت. اساس کیت، استفاده از آنتی بادی اختصاصی بر علیه 5-متیل سیتوزین جهت ارزیابی متیلاسیون تام ژنوم می‌باشد. درصد متیلاسیون تام ژنوم با استفاده از فرمول زیر محاسبه می‌شود ]21[:
دادهها با استفاده از نرمافزار SPSS نسخه 26 تجزیه و تحلیل شد. به منظور رسم نمودارها از نرمافزار GraphPad Prism نسخه 9 استفاده شد. نرمال بودن دادهها با استفاده از آزمون Shapiro-Wilk مورد ارزیابی قرار گرفت و تخطی از این پیش فرض دیده نشد (050/0<p). برای تحلیل داده از آنالیز واریانس با اندازه‌گیریهای مکرر استفاده شد. سطح معنی‌داری در آزمونها 050/0 در نظر گرفته شد.
نتایج
تأیید تمایز استئوبلاستیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی به واسطه حضور رسوب قرمز رنگ توده‌های کلیسمی در این رنگ آمیزی می‌باشد. شکل 1 (الف و ب) حضور رسوب قرمز رنگ توده‌های کلسیمی را نشان می‌دهد که تأییدی بر تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی به استئوبلاست به ترتیب با استفاده از محیط تمایزی و داروی زولدرونیک اسید می‌باشد. نمونه‌گیری جهت رنگ آمیزی آلیزارین رد در این سلول‌ها در روز 21 تمایز تهیه شده است. شکل 1. (ج) عدم حضور رسوب قرمز رنگ توده‌های کلسیمی را نشان می‌دهد که بیانگر عدم تمایز استئوبلاستیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی است. نمونه‌گیری جهت رنگ‌آمیزی آلیزارین رد در این سلول‌ها در روز صفر و قبل از القاء تمایز تهیه شده است.
تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی (Mesenchymal Stem Cells; MSCs) به استئوبلاست‌ها یک پروسه تکاملی به شدت کنترل شده‌ای می‌باشد که تعداد زیادی از عوامل بیرونی مثل هورمون‌ها، فاکتورهای رشد، مسیرهای پیام رسان و فاکتورهای رونویسی و غیره در آن دخالت دارند. فهم مکانیسم‌های دخیل در تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی به سلول‌های استئوبلاست از بحث‌های مهمی در بیولوژی استخوان بوده و اهداف درمانی جدید را در درمان بیماری‌های استخوانی پیش روی محققیق قرار می‌دهد ]1[.
تکثیر و تمایز استئوبلاست‌ها توسط فاکتورهای نسخهبرداری زیادی شامل فاکتورهای نسخهبرداری از خانواده پروتئین‌های مارپیچ-حلقه-مارپیچ (Helix-Loop-Helix)، پروتئین‌های انگشت روی (Zinc Finger)، پروتئین‌های قیچی لوسین (Lucine Zipper) و پروتئین‌های حاوی دومن Runt، و هم‌چنین پروتوانکوژن‌هایی همانند C-myc، C-jun و C-fos تحت کنترل و تنظیم است. قابلیت تمایز MSCs به رده‌های مختلف سلولی از جمله استئوبلاست به دلیل پتانسیل بیان ژن‌ها یا فاکتورهای نسخهبرداری اختصاصی دخیل در تمایز می‌باشد. دو فاکتور نسخهبرداری اختصاصی رده استئوبلاستیک شامل RUNX2 و OSTERIX (SP7) می‌باشد ]3-2[. این فاکتورهای نسخهبرداری ژن‌های اختصاصی استئوبلاستی شامل استئوکلسین، استئوپونتین، کلاژن تایپ IαI و سیالوپروتئین استخوانی (Bone Sialoprotein) را مورد رونویسی قرار می‌دهند. سایر فاکتورهای نسخهبرداری دخیل در تمایز استئوبلاستی شامل TWIST1، ZBTB16، DLX5، MSX2، FRA1، DLX3، ATF4 و C/EBP هستند [4]. نقش تغییرات متیلاسیون ناحیه پروموتوری اکثر این ژن‌ها و نیز الگوی بیان آن‌ها در تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی مورد شناسایی قرار گرفته است و نشان دهنده تغییرات الگوی متیلاسیون ناحیه پروموتوری ژن‌های اختصاصی رده استئوبلاستی در طول تمایز اسئوبلاستیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی می‌باشد [9-5]. در عین حال اطلاعاتی که نشان دهنده تغییرات متیلاسیون تام ژنوم در طول تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی باشد می‌تواند اطلاعات تکمیل کننده‌ای را در این زمینه ارائه دهد.
زولدرونیک اسید یک آمینو بی فسفونات و مهار‌کننده قوی بازجذب استخوان و در عین حال فعال‌کننده استئوبلاست‌ها در استخوان سازی می‌باشد. از این دارو جهت پیشگیری از حوادث اسکلتی در بیمارانی که دچار بدخیمی‌های پیشرفته استخوانی شده‌اند و هم‌چنین در درمان برخی اختلالات استخوانی که با افزایش Turn over استخوان همراه‌اند مثل بیماری پاژه و استئوپروز استفاده می‌شود [11-10]. مکانیسم اصلی این دارو مهار استئوکلاست‌ها و در نتیجه مهار بازجذب کلسیم از استخوان‌ها است، اما در عین حال این دارو با تسریع در تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی باعث افزایش تعداد و نیز فعالیت استئوبلاست‌ها می‌گردد ]7[ که مکانیسم ملکولی آن هنوز به خوبی شناخته نشده است.
مکانیسم اصلی برای تغییرات اپی ژنتیک DNA ژنومی، هیپرمتیلاسیون جزایر CpG در ژن‌های اختصاصی و هیپومتیلاسیون کلی DNA می‌باشد [12]. پروسه متیلاسیون DNA شامل انتقال گروه متیل از S-آدنوزیل-L-متیونین توسط آنزیم DNA متیل ترانسفراز (DNA Methyl Transferase; DNMT) بر روی کربن شماره 5 سیتوزین می‌باشد. متیلاسیون DNA اختصاصی ناحیه (Region Specific) عمدتاً در دی نوکلئوتیدهای CpG درون پروموتر یا اگزون اول ژن‌ها یافت می‌شود که یک مسیر مهم برای مهار نسخهبرداری ژن است [13].
آنالیز متیلاسیون تام ژنوم یک تصویر کلی از تغییرات متیلاسیون DNA در گستره ژنوم ارائه می‌دهد و هم‌چنین مقایسه مناسبی بین وضعیت متیلاسیون یک ژن و وضعیت متیلاسیون تام ژنوم ایجاد می‌کند. اهمیت بررسی تغییرات متیلاسیون تام ژنوم و مقایسه آن با متیلاسیون ژن‌های اختصاصی در این است که آیا وضعیت متیلاسیون ژن‌های اختصاصی متأثر از تغییرات متیلاسیون تام ژنوم هستند یا این‌که وضعیت متیلاسیون ژن‌ها، اختصاصی بوده و مربوط به پروسه تمایز سلول‌ها است؟ از طرف دیگر بررسی متیلاسیون تام ژنوم نشان می‌دهد که آیا وضعیت متیلاسیون تام ژنوم در طول تمایز تغییر می‌کند یا نه؟ ]14[ با توجه به اهمیت پاسخ به این سؤالات، در این مطالعه سلول‌های بنیادی مزانشیمی با استفاده از محیط تمایزی استئوبلاستی و هم‌چنین در تیمار با داروی زولدرونیک اسید به سمت استئوبلاست‌ها تمایز داده شدند و تغییرات اپی‌ژنتیک به صورت تغییرات متیلاسیون تام ژنوم مورد ارزیابی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
این پژوهش آزمایشگاهی در سال 1399 با کد اخلاق IR.TBZMED.VCR.REC.1398.242 در دانشگاه علوم پزشکی تبریز انجام شد. در این مطالعه، سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان انسان از مرکز تحقیقات فناوری بن‌یاخته تهران تهیه گردید. این سلول‌ها در مرکز تحقیقات فناوری بن‌یاخته از نظر توانایی تمایز به رده‌های آدیپوژنیک، کندروژنیک و استئوژنیک مورد ارزیابی قرار گرفته و تأیید شده بودند. ماهیت سلول‌های بنیادی مزانشیمی با استفاده از تکنیک فلوسیتومتری قبلاً مورد تأیید قرار گرفته بود [15]. سلول‌های بنیادی مزانشیمی با شمارش 30000 سلول در میلی لیتر در فلاسک کشت سلول 75T به همراه 20 میلی‌لیتر محیط کشتDulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM)-low glucose (Gibco) و 10 درصد Fetal Bovine Serum (FBS) و 100 واحد بر میلی‌لیتر پنیسیلین و 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر استرپتومایسین در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد (مدل 3487، شرکت بهداد، ایران) با دی اکسید کربن 5 درصد کشت داده شدند [16]. سلول‌های کشت داده شده بعد از رسیدن به تراکم 70-60 درصد با تریپسین جدا شده و تعدادی از سلول‌ها مجدداً پاساژ داده شده و تعداد دیگر جهت القاء تمایز استئوبلاستیک و تیمار با داروی زولدرونیک اسید مورد استفاده قرار گرفتند.
تمایز استئوبلاستیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی در پاساژ دوم انجام شد. برای تهیه محیط تمایزی استئوبلاستی از محیط کشت عمومی DMEM، L-گلوتامین و 10 درصد FBS استفاده شد که به این محیط کشت فاکتورهای دگزامتازون با غلظت نهایی 10 نانومولار، بتا گلیسرول فسفات با غلظت نهایی 5 میلی مولار و آسکوربات-2-فسفات با غلظت نهایی 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر اضافه گردید. نمونه برداری از سلول‌های بنیادی مزانشیمی تمایز‌نیافته (روز 0) و سلول‌های استئوبلاستی تمایز‌یافته (هفته اول، دوم و سوم) صورت گرفت ]17[.
ویال‌های حاوی 4 میلیگرم پودر داروی زولدرونیک اسید از نمایندگی شرکت دارویی نوارتیس (Novartis pharma, Basel, Switzerland) در تهران تهیه گردید. این دارو در محیط کشت حل گردید. از غلظت نهایی 5 میکرومولار زولدرونیک اسید در محیط کشت، جهت تیمار به مدت 3 ساعت استفاده شد که اصطلاحاً تیمار ضربانی (Pulse Treatment) طبق مطالعات قبلی صورت گرفت. سپس محیط کشت تخلیه شده و با PBS شستشو داده شد. نهایتاً محیط تمایزی بر روی آن‌ها اضافه شد و به مدت 21 روز کشت داده شدند. علاوه بر سلول‌های تیمار‌شده با زولدرونیک اسید، MSCs بدون تیمار به عنوان کنترل کشت داده شدند. نمونه برداری از سلول‌های بنیادی مزانشیمی تمایز نیافته (روز 0) و سلول‌های استئوبلاستی تیمار شده در بازه زمانی هفته اول، دوم و سوم صورت گرفت [18].
رنگ‌آمیزی آلیزارین رد برای تأیید تمایز استئوبلاستی استفاده گردید. برای انجام این آزمایش سلول‌های بنیادی مزانشیمی در پلیت‌های 6 خانه‌ای کشت داده شدند. گروهی از سلول‌ها با محیط تمایزی استئوبلاستی و گروهی با داروی زولدرونیک اسید تیمار شدند و گروهی هم به عنوان کنترل بدون تیمار کشت داده شدند. رنگ آمیزی آلیزارین رد در روز 21 کشت انجام گرفت. جهت رنگ‌آمیزی در روز 21، محیط کشت تخلیه شده و سلول‌ها با PBS شستشو شدند. فرمالدهید 40 درصد جهت فیکساسیون استفاده شد و مجدد با PBS شستشو شدند. نهایتاً آلیزارین رد 1 درصد اضافه شده و به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند. سپس با آب مقطر شستشو شده و وجود یا عدم وجود رسوب‌های قرمز رنگ کلسیم در زیر میکروسکوپ معکوس (مدل CKX53، شرک الیمپوس، ژاپن) مورد ارزیابی قرار گرفتند ]19[.
تعداد 106×4-3 سلول از هر فلاسک T75 جهت استخراج DNA ژنومی سلول‌های استئوبلاستی تمایز یافته و سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با داروی زولدرونیک اسید (روز 7، 14 و 21) و نیز سلول‌های بنیادی مزانشیمی تمایز نیافته با استفاده از کیت استخراج DNA شرکت Roche طبق پروتکل مورد استفاده قرار گرفتند. کیفیت DNA استخراج شده با الکتروفورز بر روی ژل آگارز بررسی شد. مقدار DNA استخراج شده به واسطه جذب در طول موج 260 نانومتر اندازه‌گیری شد. خلوص DNA استخراج شده از طریق نسبت جذب در طول موج 260 نانومتر به 280 نانومتر سنجیده شد ]20[.
تغییرات متیلاسیون تام ژنوم در طول تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی به استئوبلاست تحت تأثیر محیط تمایزی و هم‌چنین در طول تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار‌شده با داروی زولدرونیک اسید با استفاده از کیت Methylamp Global DNA Methylation Quantification Ultra Kit (Epigentek Group Inc., NY, USA) با استفاده از تکنیک الایزا به صورت Triplicate مورد سنجش قرار گرفت. اساس کیت، استفاده از آنتی بادی اختصاصی بر علیه 5-متیل سیتوزین جهت ارزیابی متیلاسیون تام ژنوم می‌باشد. درصد متیلاسیون تام ژنوم با استفاده از فرمول زیر محاسبه می‌شود ]21[:
دادهها با استفاده از نرمافزار SPSS نسخه 26 تجزیه و تحلیل شد. به منظور رسم نمودارها از نرمافزار GraphPad Prism نسخه 9 استفاده شد. نرمال بودن دادهها با استفاده از آزمون Shapiro-Wilk مورد ارزیابی قرار گرفت و تخطی از این پیش فرض دیده نشد (050/0<p). برای تحلیل داده از آنالیز واریانس با اندازه‌گیریهای مکرر استفاده شد. سطح معنی‌داری در آزمونها 050/0 در نظر گرفته شد.
نتایج
تأیید تمایز استئوبلاستیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی به واسطه حضور رسوب قرمز رنگ توده‌های کلیسمی در این رنگ آمیزی می‌باشد. شکل 1 (الف و ب) حضور رسوب قرمز رنگ توده‌های کلسیمی را نشان می‌دهد که تأییدی بر تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی به استئوبلاست به ترتیب با استفاده از محیط تمایزی و داروی زولدرونیک اسید می‌باشد. نمونه‌گیری جهت رنگ آمیزی آلیزارین رد در این سلول‌ها در روز 21 تمایز تهیه شده است. شکل 1. (ج) عدم حضور رسوب قرمز رنگ توده‌های کلسیمی را نشان می‌دهد که بیانگر عدم تمایز استئوبلاستیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی است. نمونه‌گیری جهت رنگ‌آمیزی آلیزارین رد در این سلول‌ها در روز صفر و قبل از القاء تمایز تهیه شده است.
شکل 1- رنگ آمیزی آلیزارین رد. (الف) سلول‌های تمایز‌یافته استئوبلاستی تیمار‌شده با محیط تمایزی در روز 21 تمایز. (ب) سلول‌های تمایز یافته استئوبلاستی تیمار شده با زولدرونیک اسید در روز 21 تمایز. (ج) سلول‌های بنیادی مزانشیمی.
متیلاسیون تام ژنوم سلول‌های بنیادی مزانشیمی قبل از تمایز (روز 0) و بعد از تمایز با محیط تمایزی (روز 7، 14 و 21 تمایز) اندازه‌گیری شد. درصد متیلاسیون تام ژنوم در سلول‌های بنیادی مزانشیمی قبل از تمایز (روز 0) 87/1±00/20 درصد و بعد از تمایز در روز 7، 14 و 21 به ترتیب 34/1±20/20 درصد، 40/1±83/19 درصد و 70/2±20/22 درصد بود. نمودار 1 مقایسه متیلاسیون تام ژنوم در سلو‌های بنیادی مزانشیمی قبل و بعد از تمایز با محیط تمایزی را نشان می‌دهد. اختلاف معنی‌داری بین درصد متیلاسیون تام ژنوم در سلول‌های بنیادی مزانشیمی قبل از تمایز (روز 0) و بعد از تمایز (روز 7، 14 و 21) مشاهده نشد (093/0=p).
نمودار 1. سنجش متیلاسیون تام ژنوم در طول تمایز استئوبلاستی با محیط تمایزی در سلول‌های بنیادی مزانشیمی قبل از تمایز (روز 0) 87/1±00/20 درصد و بعد از تمایز در روز 7، 14 و 21 به ترتیب 34/1 ± 20/20 درصد، 40/1 ± 83/19 درصد و 70/2 ± 20/22 درصد. (093/0=p)
متیلاسیون تام ژنوم سلول‌های بنیادی مزانشیمی قبل از تیمار (روز 0) و بعد از تیمار با داروی زولدرونیک اسید (روز 7، 14 و 21 تمایز) اندازه‌گیری شد. درصد متیلاسیون تام ژنوم در سلول‌های بنیادی مزانشیمی قبل از تیمار (روز 0) 97/1±33/18 درصد و بعد از تیمار در روز 7، 14 و 21 به ترتیب 66/3±96/21 درصد، 47/2±80/17 درصد و 96/2±07/19 درصد بود. نمودار 2 مقایسه متیلاسیون تام ژنوم در سلو‌های بنیادی مزانشیمی قبل و بعد از تمایز در تیمار با داروی زولدرونیک اسید را نشان می دهد. اختلاف معنی داری بین درصد متیلاسیون تام ژنوم در سلول‌های بنیادی مزانشیمی قبل از تیمار (روز 0) و بعد از تیمار (روز 7، 14 و 21) مشاهده نشد (057/0=p).
نمودار 2- سنجش متیلاسیون تام ژنوم در سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار‌شده با زولدرونیک اسید در سلول‌های بنیادی مزانشیمی قبل از تیمار (روز 0) 97/1 ± 33/18 درصد و بعد از تیمار در روز 7، 14 و 21 به ترتیب 66/3 ± 96/21 درصد، 47/2 ± 80/17 درصد و 96/2 ± 07/19 درصد. (057/0=p)
بحث
مکانیسم‌های اپی ژنتیک ساختار کروماتین را به نحوی تغییر می‌دهند که ژن‌ها در دسترس فاکتورهای نسخهبرداری اختصاصی قرار گیرند و یا برعکس با تغییر ساختار کروماتین منجر به عدم دسترسی فاکتورهای نسخهبرداری به ژن‌های هدف می‌شوند. بر این اساس می‌توانند بیان ژن‌ها را تحت کنترل داشته باشند. Barter و همکارانش در یک تحقیق نشان دادند که تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی انسانی به کندروسیت‌ها با هیپومتیلاسیون DNA مخصوصاً در توالی‌های اختصاصی این مسیر همراه است [22]. هم‌چنین Kang و همکارانش نشان دادند که بیان ژن‌های اختصاصی رده در تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی با وضعیت هیپومتیلاسیون این ژن‌ها همراه است [23].
نقش متیلاسیون تام ژنوم در پروسه‌های ژنتیکی خاص مثل غیر فعال سازی کروموزوم جنسی X و نقش بندی ژن (Gene Imprinting) به خوبی شناخته شده است ]24[. هم‌چنین وضعیت متیلاسیون تام ژنوم می‌تواند در تعیین سرنوشت سلولی و پروسه‌های مهم سلولی همانند تکثیر و تمایز و تکامل حایز اهمیت باشد. Ivanova و همکاران نشان دادند که متیلاسیون تام ژنوم در طول لانه‌گزینی رویانی تغییر می‌کند [25]. این یافته نشان دهنده تغییرات متیلاسیون تام ژنوم در طول تکامل و تمایز می‌باشد. Maierhofer و همکاران با بررسی تأثیر اشعه ایکس بر روی متیلاسیون تام ژنوم در فیبروبلاست‌های انسانی نشان دادند که تغییر معنی‌داری در متیلاسیون تام ژنوم در این فرآیند صورت نمی‌گیرد [26]. Tsang و همکاران نشان دادند که متیلاسیون تام ژنوم در مراحل مختلف زندگی وابسته به سن و جنس می‌تواند متفاوت باشد. هم‌چنین این محققین نشان دادند که میزان متیلاسیون تام ژنوم در کودکان اوتیسم در مقایسه با کودکان سالم بیش‌تر است [27]. در مراحل اولیه ترمیم شکستگی استخوان، متیلاسیون DNA به صورت هدف‌مند افزایش پیدا می‌کند که این امر ناشی از افزایش فعالیت آنزیم DNMT3B می‌باشد که در متیلاسیون اختصاصی DNA و عمدتاً در مسیر انتقال پیام Sonic Hedgehog (SHH) اثرگذار است ]28[. در تحقیق حاضر وضعیت متیلاسیون تام ژنوم در طول تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی با استفاده از تکنیک الایزا مورد ارزیابی قرار گرفت و نشان داده شد که وضعیت متیلاسیون تام ژنوم در طول تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی تغییر پیدا نمی‌کند. هم‌چنین استفاده از داروی زولدرونیک اسید که نقش آن در تسریع تمایز استئوبلاستیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی شناخته شده است ]7[ تأثیری بر متیلاسیون تام ژنوم ندارد. در حالی‌که تحقیقات قبلی نویسندگان مقاله بر روی متیلاسیون اختصاصی ژن‌های دخیل در تمایز استئوبلاستیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی نشان‌دهنده تغییرات متیلاسیون در برخی از ژن‌ها می‌باشد [9، 5] هر چند متیلاسیون تام ژنوم تغییر نمی‌کند و یا تغییرات با تکنیک مورد استفاده قابل ارزیابی نیست.
Cao و همکارانش با استفاده از تکنولوژی میکرو‌آرایه نشان دادند که سطح متیلاسیون ژنوم در طول تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی بصورت افزایشی تغییر پیدا می‌کند به‌طوری‌که عناصر ژنومیکی متعدد در سطح متیلاسیون متوسط تا بالا قرار می‌گیرند و عناصر ژنومیکی تکراری در سطح متیلاسیون بالا قرار می‌گیرند ]29[ لذا این تفاوت می‌تواند ناشی از تکنیک‌های متفاوت مورد استفاده در دو مطالعه باشد. به هر حال، نتایج متیلاسیون تام ژنوم در این تحقیق نشان می‌دهد که بین تغییرات متیلاسیون یک ژن در طول تمایز، با تغییرات متیلاسیون تام ژنوم ارتباطی وجود ندارد که این امر می‌تواند ناشی از عمکرد آنزیم‌های متیله‌کننده ژنوم با عملکرد اختصاصی مثل آنزیم DNMT3 باشد. بنابراین فرآیند نمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی به استئوبلاست‌ها یک مسیر منحصر به فرد بوده و احتمالاً سایر مکانیسم‌های ژنتیکی و اپی‌ژنتیکی در کنترل آن ایفای نقش می‌نماید. لذا تفاوت در یافته‌های این تحقیق در مورد متیلاسیون تام ژنوم با یافته های Cao و همکاران ]29[ می‌تواند ناشی از استفاده تکنیک‌های متفاوت با حساسیت مختلف در شناسایی تغییرات سطح متیلاسیون تام ژنوم باشد که می‌تواند به عنوان محدودیت های مطالعه حاضر مطرح شود.
نتیجه‌گیری
مکانیسم‌های اپی ژنتیک مخصوصاً متیلاسیون DNA نقش مهمی در فرآیند تمایز دارد. در این تحقیق مشخص شد که در طول تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی، متیلاسیون تام ژنوم تغییر نمی‌کند. هم‌چنین استفاده از داروی زولدرونیک اسید که با تسریع تمایز استئوبلاستیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی همراه است، متیلاسیون تام ژنوم را تغییر نمی‌دهد. لذا تحقیقات بیش‌تر در این زمینه در درک بهتر مکانیسم‌های دخیل در تمایز استئوبلاستی ضروری به نظر می‌رسد.
تشکر و قدردانی
از حمایت مالی دانشگاه علوم پزشکی تبریز و همکاری دانشگاه تربیت مدرس در انجام این تحقیق و از نمایندگی شرکت نوارتیس به دلیل تامین داروی زولدرونیک اسید و از مرکز تحقیقات سلولی ملکولی و سلول‌های بنیادی صارم و مرکز تحقیقات ایمنولوژی دانشگاه علوم پزشکی تبریز به دلیل در اختیار گذاشتن آزمایشگاه و هم‌چنین از جناب آقای دکتر مرتضی قوجازاده به دلیل همکاری در آنالیز آماری دادهها نهایت تشکر و قدردانی را داریم.
.
نمودار 1. سنجش متیلاسیون تام ژنوم در طول تمایز استئوبلاستی با محیط تمایزی در سلول‌های بنیادی مزانشیمی قبل از تمایز (روز 0) 87/1±00/20 درصد و بعد از تمایز در روز 7، 14 و 21 به ترتیب 34/1 ± 20/20 درصد، 40/1 ± 83/19 درصد و 70/2 ± 20/22 درصد. (093/0=p)
متیلاسیون تام ژنوم سلول‌های بنیادی مزانشیمی قبل از تیمار (روز 0) و بعد از تیمار با داروی زولدرونیک اسید (روز 7، 14 و 21 تمایز) اندازه‌گیری شد. درصد متیلاسیون تام ژنوم در سلول‌های بنیادی مزانشیمی قبل از تیمار (روز 0) 97/1±33/18 درصد و بعد از تیمار در روز 7، 14 و 21 به ترتیب 66/3±96/21 درصد، 47/2±80/17 درصد و 96/2±07/19 درصد بود. نمودار 2 مقایسه متیلاسیون تام ژنوم در سلو‌های بنیادی مزانشیمی قبل و بعد از تمایز در تیمار با داروی زولدرونیک اسید را نشان می دهد. اختلاف معنی داری بین درصد متیلاسیون تام ژنوم در سلول‌های بنیادی مزانشیمی قبل از تیمار (روز 0) و بعد از تیمار (روز 7، 14 و 21) مشاهده نشد (057/0=p).
نمودار 2- سنجش متیلاسیون تام ژنوم در سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار‌شده با زولدرونیک اسید در سلول‌های بنیادی مزانشیمی قبل از تیمار (روز 0) 97/1 ± 33/18 درصد و بعد از تیمار در روز 7، 14 و 21 به ترتیب 66/3 ± 96/21 درصد، 47/2 ± 80/17 درصد و 96/2 ± 07/19 درصد. (057/0=p)
بحث
مکانیسم‌های اپی ژنتیک ساختار کروماتین را به نحوی تغییر می‌دهند که ژن‌ها در دسترس فاکتورهای نسخهبرداری اختصاصی قرار گیرند و یا برعکس با تغییر ساختار کروماتین منجر به عدم دسترسی فاکتورهای نسخهبرداری به ژن‌های هدف می‌شوند. بر این اساس می‌توانند بیان ژن‌ها را تحت کنترل داشته باشند. Barter و همکارانش در یک تحقیق نشان دادند که تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی انسانی به کندروسیت‌ها با هیپومتیلاسیون DNA مخصوصاً در توالی‌های اختصاصی این مسیر همراه است [22]. هم‌چنین Kang و همکارانش نشان دادند که بیان ژن‌های اختصاصی رده در تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی با وضعیت هیپومتیلاسیون این ژن‌ها همراه است [23].
نقش متیلاسیون تام ژنوم در پروسه‌های ژنتیکی خاص مثل غیر فعال سازی کروموزوم جنسی X و نقش بندی ژن (Gene Imprinting) به خوبی شناخته شده است ]24[. هم‌چنین وضعیت متیلاسیون تام ژنوم می‌تواند در تعیین سرنوشت سلولی و پروسه‌های مهم سلولی همانند تکثیر و تمایز و تکامل حایز اهمیت باشد. Ivanova و همکاران نشان دادند که متیلاسیون تام ژنوم در طول لانه‌گزینی رویانی تغییر می‌کند [25]. این یافته نشان دهنده تغییرات متیلاسیون تام ژنوم در طول تکامل و تمایز می‌باشد. Maierhofer و همکاران با بررسی تأثیر اشعه ایکس بر روی متیلاسیون تام ژنوم در فیبروبلاست‌های انسانی نشان دادند که تغییر معنی‌داری در متیلاسیون تام ژنوم در این فرآیند صورت نمی‌گیرد [26]. Tsang و همکاران نشان دادند که متیلاسیون تام ژنوم در مراحل مختلف زندگی وابسته به سن و جنس می‌تواند متفاوت باشد. هم‌چنین این محققین نشان دادند که میزان متیلاسیون تام ژنوم در کودکان اوتیسم در مقایسه با کودکان سالم بیش‌تر است [27]. در مراحل اولیه ترمیم شکستگی استخوان، متیلاسیون DNA به صورت هدف‌مند افزایش پیدا می‌کند که این امر ناشی از افزایش فعالیت آنزیم DNMT3B می‌باشد که در متیلاسیون اختصاصی DNA و عمدتاً در مسیر انتقال پیام Sonic Hedgehog (SHH) اثرگذار است ]28[. در تحقیق حاضر وضعیت متیلاسیون تام ژنوم در طول تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی با استفاده از تکنیک الایزا مورد ارزیابی قرار گرفت و نشان داده شد که وضعیت متیلاسیون تام ژنوم در طول تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی تغییر پیدا نمی‌کند. هم‌چنین استفاده از داروی زولدرونیک اسید که نقش آن در تسریع تمایز استئوبلاستیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی شناخته شده است ]7[ تأثیری بر متیلاسیون تام ژنوم ندارد. در حالی‌که تحقیقات قبلی نویسندگان مقاله بر روی متیلاسیون اختصاصی ژن‌های دخیل در تمایز استئوبلاستیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی نشان‌دهنده تغییرات متیلاسیون در برخی از ژن‌ها می‌باشد [9، 5] هر چند متیلاسیون تام ژنوم تغییر نمی‌کند و یا تغییرات با تکنیک مورد استفاده قابل ارزیابی نیست.
Cao و همکارانش با استفاده از تکنولوژی میکرو‌آرایه نشان دادند که سطح متیلاسیون ژنوم در طول تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی بصورت افزایشی تغییر پیدا می‌کند به‌طوری‌که عناصر ژنومیکی متعدد در سطح متیلاسیون متوسط تا بالا قرار می‌گیرند و عناصر ژنومیکی تکراری در سطح متیلاسیون بالا قرار می‌گیرند ]29[ لذا این تفاوت می‌تواند ناشی از تکنیک‌های متفاوت مورد استفاده در دو مطالعه باشد. به هر حال، نتایج متیلاسیون تام ژنوم در این تحقیق نشان می‌دهد که بین تغییرات متیلاسیون یک ژن در طول تمایز، با تغییرات متیلاسیون تام ژنوم ارتباطی وجود ندارد که این امر می‌تواند ناشی از عمکرد آنزیم‌های متیله‌کننده ژنوم با عملکرد اختصاصی مثل آنزیم DNMT3 باشد. بنابراین فرآیند نمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی به استئوبلاست‌ها یک مسیر منحصر به فرد بوده و احتمالاً سایر مکانیسم‌های ژنتیکی و اپی‌ژنتیکی در کنترل آن ایفای نقش می‌نماید. لذا تفاوت در یافته‌های این تحقیق در مورد متیلاسیون تام ژنوم با یافته های Cao و همکاران ]29[ می‌تواند ناشی از استفاده تکنیک‌های متفاوت با حساسیت مختلف در شناسایی تغییرات سطح متیلاسیون تام ژنوم باشد که می‌تواند به عنوان محدودیت های مطالعه حاضر مطرح شود.
نتیجه‌گیری
مکانیسم‌های اپی ژنتیک مخصوصاً متیلاسیون DNA نقش مهمی در فرآیند تمایز دارد. در این تحقیق مشخص شد که در طول تمایز استئوبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمی، متیلاسیون تام ژنوم تغییر نمی‌کند. هم‌چنین استفاده از داروی زولدرونیک اسید که با تسریع تمایز استئوبلاستیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی همراه است، متیلاسیون تام ژنوم را تغییر نمی‌دهد. لذا تحقیقات بیش‌تر در این زمینه در درک بهتر مکانیسم‌های دخیل در تمایز استئوبلاستی ضروری به نظر می‌رسد.
تشکر و قدردانی
از حمایت مالی دانشگاه علوم پزشکی تبریز و همکاری دانشگاه تربیت مدرس در انجام این تحقیق و از نمایندگی شرکت نوارتیس به دلیل تامین داروی زولدرونیک اسید و از مرکز تحقیقات سلولی ملکولی و سلول‌های بنیادی صارم و مرکز تحقیقات ایمنولوژی دانشگاه علوم پزشکی تبریز به دلیل در اختیار گذاشتن آزمایشگاه و هم‌چنین از جناب آقای دکتر مرتضی قوجازاده به دلیل همکاری در آنالیز آماری دادهها نهایت تشکر و قدردانی را داریم.
.
References
[1] Thomas S, Jaganathan BG. Signaling network regulating osteogenesis in mesenchymal stem cells. J Cell Commun Signal 2022; 16(1): 47-61.
[2] Salhotra A, Shah HN, Levi B, Longaker MT. Mechanisms of bone development and repair. Nat Rev Mol Cell Biol 2020; 21(11): 696-711.
[3] Liu Q, Li M, Wang S, Xiao Z, Xiong Y, Wang G. Recent Advances of Osterix Transcription Factor in Osteoblast Differentiation and Bone Formation. Front Cell Dev Biol 2020; 15(8): 1575.
[4] Chan WC, Tan Z, To MK, Chan D. Regulation and Role of Transcription Factors in Osteogenesis. Int J Mol Sci 2021; 22(11): 5445.
[5] Marofi F, Vahedi G, Solali S, Alivand M, Salarinasab S, Zadi Heydarabad M, et al. Gene expression of TWIST1 and ZBTB16 is regulated by methylation modifications during the osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells. J Cell Physiol 2019; 234(5): 6230-43.
[6] Marofi F, Hassanzadeh A, Solali S, Vahedi G, Mousavi Ardehaie R, Salarinasab S, et al. Epigenetic mechanisms are behind the regulation of the key genes associated with the osteoblastic differentiation of the mesenchymal stem cells: the role of zoledronic acid on tuning the epigenetic changes. J Cell Physiol 2019; 234(9): 15108-22.
[7] Zhou Y, Li J, Zhou K, Liao X, Zhou X, Shen K. The methylation of Notch1 promoter mediates the osteogenesis differentiation in human aortic valve interstitial cells through Wnt/β‐catenin signaling. J Cell Physiol 2019; 234(11): 20366-76.
[8] Rahimzadeh S, Rahbarghazi R, Aslani S, Rajabi H, Latifi Z, Hagh MF, et al. Promoter methylation and expression pattern of DLX3, ATF4, and FRA1 genes during osteoblastic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. BioImpacts 2020; 10(4): 243-9.
[9] Mashhadikhan M, Kheiri H, Dehghanifard A. DNA methylation and gene expression of sFRP2, sFRP4, Dkk 1, and Wif1 during osteoblastic differentiation of bone marrow derived mesenchymal stem cells. J Oral Biosci 2020; 62(4): 349-56.
[10] Churilla BM, Perera S, Greenspan SL, Resnick NM, Kotlarczyk MP. Zoledronic acid and bone health in older adults with cognitive impairment. Osteoporos Int 2022; 33(1): 293-8.
[11] Jeon HL, Oh IS, Baek YH, Yang H, Park J, Hong S, et al. Zoledronic acid and skeletal-related events in patients with bone metastatic cancer or multiple myeloma. J Bone Miner Metab 2020; 38(2): 254-63.
[12] Luo C, Hajkova P, Ecker JR. Dynamic DNA methylation: in the right place at the right time. Science 2018; 361(6409): 1336-40.
[13] Gujar H, Weisenberger DJ, Liang G. The roles of human DNA methyltransferases and their isoforms in shaping the epigenome. Genes 2019; 10(2): 172-9.
[14] Li S, Tollefsbol TO. DNA methylation methods: Global DNA methylation and methylomic analyses. Methods 2021; 1(187): 28-43.
[15] Mohajeri S, Hosseinkhani H, Ebrahimi NG, Nikfarjam L, Soleimani M, Kajbafzadeh AM. Proliferation and differentiation of mesenchymal stem cell on collagen sponge reinforced with polypropylene/polyethylene terephthalate blend fibers. Tissue Eng Part A 2010; 16(12): 3821-30.
[16] Mushahary D, Spittler A, Kasper C, Weber V, Charwat V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A 2018; 93(1): 19-31.
[17] Sordi MB, Curtarelli RB, da Silva IT, Fongaro G, Benfatti CA, de Souza Magini R, et al. Effect of dexamethasone as osteogenic supplementation in in vitro osteogenic differentiation of stem cells from human exfoliated deciduous teeth. J Mater Sci Mater Med 2021; 32(1): 1-9.
[18] Ebert R, Zeck S, Krug R, Meissner-Weigl J, Schneider D, Seefried L, et al. Pulse treatment with zoledronic acid causes sustained commitment of bone marrow derived mesenchymal stem cells for osteogenic differentiation. Bone 2009; 44(5): 858-64.
[19] Kameswari S, Sangeetha S, Mohanraj KG. Alizarin red S-A procedure for staining bones. Drug Invent Today 2019; 12(5): 890-2.
[20] Dong L, Yoshizawa J, Li X. Nucleic acid isolation and quality control. Biobanking 2019; pages: 325-43. https;//doi.org/10.1007/978-1-4939-8935-5_28.
[21] de Oliveira NF, de Castro Coêlho M, Viana Filho JM. ELISA analysis of global methylation levels. Epigenetics Methods 2020; 18: 83-92.
[22] Barter MJ, Bui C, Cheung K, Falk J, Gómez R, Skelton AJ, et al. DNA hypomethylation during MSC chondrogenesis occurs predominantly at enhancer regions. Sci Rep 2020; 10(1): 1-0.
[23] Kang MI, Kim HS, Jung YC, Kim YH, Hong SJ, Kim MK, Transitional CpG methylation between promoters and retroelements of tissue-specific genes during human mesenchymal cell differentiation. J Cell Biochem 2007; 102(1): 224-39.
[24] Bartolomei MS, Oakey RJ, Wutz A. Genomic imprinting: An epigenetic regulatory system. PLoS Genet 2020; 16(8): e1008970.
[25] Ivanova E, Canovas S, Garcia-Martínez, S, Romer R, Lopes JS, Rizos D, DNA methylation changes during preimplantation development reveal inter-species differences and reprogramming events at imprinted genes. Clin Epigenet 2020; 12(64): 1-18.
[26] Maierhofer A, Flunkert J, Dittrich M, Müller T, Schindler D, Nanda I, et al. Analysis of global DNA methylation changes in primary human fibroblasts in the early phase following X-ray irradiation. PLoS ONE 2017; 12(5): e0177442.
[27] Tsang SY, Ahmad T, Mat FWK, Zhao C, Xiao S, Xia K, et al. Variation of global DNA methylation levels with age and in autistic children. Hum Genomics 2016; 10(1): 1-6.
[28] Wang C, Shan S, Wang C, Wang J, Li J, Hu G, et al. Mechanical stimulation promote the osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells through epigenetic regulation of Sonic Hedgehog. Exp Cell Res 2017; 352(2): 346-56.
[29] Cao Y, Yang H, Jin L, Du J, Fan Z. Genome-wide DNA methylation analysis during osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cells Int 2018; https://doi.org/10.1155/ 2018/8238496
. .
[2] Salhotra A, Shah HN, Levi B, Longaker MT. Mechanisms of bone development and repair. Nat Rev Mol Cell Biol 2020; 21(11): 696-711.
[3] Liu Q, Li M, Wang S, Xiao Z, Xiong Y, Wang G. Recent Advances of Osterix Transcription Factor in Osteoblast Differentiation and Bone Formation. Front Cell Dev Biol 2020; 15(8): 1575.
[4] Chan WC, Tan Z, To MK, Chan D. Regulation and Role of Transcription Factors in Osteogenesis. Int J Mol Sci 2021; 22(11): 5445.
[5] Marofi F, Vahedi G, Solali S, Alivand M, Salarinasab S, Zadi Heydarabad M, et al. Gene expression of TWIST1 and ZBTB16 is regulated by methylation modifications during the osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells. J Cell Physiol 2019; 234(5): 6230-43.
[6] Marofi F, Hassanzadeh A, Solali S, Vahedi G, Mousavi Ardehaie R, Salarinasab S, et al. Epigenetic mechanisms are behind the regulation of the key genes associated with the osteoblastic differentiation of the mesenchymal stem cells: the role of zoledronic acid on tuning the epigenetic changes. J Cell Physiol 2019; 234(9): 15108-22.
[7] Zhou Y, Li J, Zhou K, Liao X, Zhou X, Shen K. The methylation of Notch1 promoter mediates the osteogenesis differentiation in human aortic valve interstitial cells through Wnt/β‐catenin signaling. J Cell Physiol 2019; 234(11): 20366-76.
[8] Rahimzadeh S, Rahbarghazi R, Aslani S, Rajabi H, Latifi Z, Hagh MF, et al. Promoter methylation and expression pattern of DLX3, ATF4, and FRA1 genes during osteoblastic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. BioImpacts 2020; 10(4): 243-9.
[9] Mashhadikhan M, Kheiri H, Dehghanifard A. DNA methylation and gene expression of sFRP2, sFRP4, Dkk 1, and Wif1 during osteoblastic differentiation of bone marrow derived mesenchymal stem cells. J Oral Biosci 2020; 62(4): 349-56.
[10] Churilla BM, Perera S, Greenspan SL, Resnick NM, Kotlarczyk MP. Zoledronic acid and bone health in older adults with cognitive impairment. Osteoporos Int 2022; 33(1): 293-8.
[11] Jeon HL, Oh IS, Baek YH, Yang H, Park J, Hong S, et al. Zoledronic acid and skeletal-related events in patients with bone metastatic cancer or multiple myeloma. J Bone Miner Metab 2020; 38(2): 254-63.
[12] Luo C, Hajkova P, Ecker JR. Dynamic DNA methylation: in the right place at the right time. Science 2018; 361(6409): 1336-40.
[13] Gujar H, Weisenberger DJ, Liang G. The roles of human DNA methyltransferases and their isoforms in shaping the epigenome. Genes 2019; 10(2): 172-9.
[14] Li S, Tollefsbol TO. DNA methylation methods: Global DNA methylation and methylomic analyses. Methods 2021; 1(187): 28-43.
[15] Mohajeri S, Hosseinkhani H, Ebrahimi NG, Nikfarjam L, Soleimani M, Kajbafzadeh AM. Proliferation and differentiation of mesenchymal stem cell on collagen sponge reinforced with polypropylene/polyethylene terephthalate blend fibers. Tissue Eng Part A 2010; 16(12): 3821-30.
[16] Mushahary D, Spittler A, Kasper C, Weber V, Charwat V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A 2018; 93(1): 19-31.
[17] Sordi MB, Curtarelli RB, da Silva IT, Fongaro G, Benfatti CA, de Souza Magini R, et al. Effect of dexamethasone as osteogenic supplementation in in vitro osteogenic differentiation of stem cells from human exfoliated deciduous teeth. J Mater Sci Mater Med 2021; 32(1): 1-9.
[18] Ebert R, Zeck S, Krug R, Meissner-Weigl J, Schneider D, Seefried L, et al. Pulse treatment with zoledronic acid causes sustained commitment of bone marrow derived mesenchymal stem cells for osteogenic differentiation. Bone 2009; 44(5): 858-64.
[19] Kameswari S, Sangeetha S, Mohanraj KG. Alizarin red S-A procedure for staining bones. Drug Invent Today 2019; 12(5): 890-2.
[20] Dong L, Yoshizawa J, Li X. Nucleic acid isolation and quality control. Biobanking 2019; pages: 325-43. https;//doi.org/10.1007/978-1-4939-8935-5_28.
[21] de Oliveira NF, de Castro Coêlho M, Viana Filho JM. ELISA analysis of global methylation levels. Epigenetics Methods 2020; 18: 83-92.
[22] Barter MJ, Bui C, Cheung K, Falk J, Gómez R, Skelton AJ, et al. DNA hypomethylation during MSC chondrogenesis occurs predominantly at enhancer regions. Sci Rep 2020; 10(1): 1-0.
[23] Kang MI, Kim HS, Jung YC, Kim YH, Hong SJ, Kim MK, Transitional CpG methylation between promoters and retroelements of tissue-specific genes during human mesenchymal cell differentiation. J Cell Biochem 2007; 102(1): 224-39.
[24] Bartolomei MS, Oakey RJ, Wutz A. Genomic imprinting: An epigenetic regulatory system. PLoS Genet 2020; 16(8): e1008970.
[25] Ivanova E, Canovas S, Garcia-Martínez, S, Romer R, Lopes JS, Rizos D, DNA methylation changes during preimplantation development reveal inter-species differences and reprogramming events at imprinted genes. Clin Epigenet 2020; 12(64): 1-18.
[26] Maierhofer A, Flunkert J, Dittrich M, Müller T, Schindler D, Nanda I, et al. Analysis of global DNA methylation changes in primary human fibroblasts in the early phase following X-ray irradiation. PLoS ONE 2017; 12(5): e0177442.
[27] Tsang SY, Ahmad T, Mat FWK, Zhao C, Xiao S, Xia K, et al. Variation of global DNA methylation levels with age and in autistic children. Hum Genomics 2016; 10(1): 1-6.
[28] Wang C, Shan S, Wang C, Wang J, Li J, Hu G, et al. Mechanical stimulation promote the osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells through epigenetic regulation of Sonic Hedgehog. Exp Cell Res 2017; 352(2): 346-56.
[29] Cao Y, Yang H, Jin L, Du J, Fan Z. Genome-wide DNA methylation analysis during osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cells Int 2018; https://doi.org/10.1155/ 2018/8238496
. .
Evaluation of Changes in Global DNA Methylation during Osteoblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells: A Laboratory Study
Mina Nikasa[4], Mehrdad Noruzinia[5], Majid Farshdousti Hagh[6]
Received: 11/12/21 Sent for Revision: 04/01/22 Received Revised Manuscript: 24/04/22 Accepted: 25/04/22
Background and Objectives: Control processes in osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells are not yet fully understood. Epigenetic mechanisms, especially the methylation of CpG Islands in the promoter of genes, are considered as one of the most important control mechanisms in stem cell differentiation. In the process of differentiation, it is debated whether only the methylation of specific genes changes or the methylation of global DNA. Therefore, in the present study, the state of global DNA methylation was evaluated during osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells by differentiation medium and also in treatment by zoledronic acid.
Materials and Methods: In this laboratory study, after isolation and proliferation of mesenchymal stem cells, induction of osteoblastic differentiation was done using differentiating medium and zoledronic acid. DNA extraction was performed at differentiation weeks 1, 2, and 3 as well as from undifferentiated mesenchymal stem cells. Global DNA methylation status was assessed by antibodies against 5-methyl cytosine. Repeated measurement design test was used to analyze the data.
Results: Global DNA methylation status of the genome did not change during osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells (p=0.093). Also, treatment with zoledronic acid had no effect on global DNA methylation (p=0.057).
Conclusion: Osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells by differentiation medium and also in treatment with zoledronic acid is not associated with altered global methylation of the genome. Therefore, the differentiation process of mesenchymal stem cells to osteoblasts is a unique pathway, and possibly other genetic and epigenetic mechanisms play a role in controlling it.
Key words: Osteoblast, Mesenchymal stem cells, Differentiation, Global DNA methylation, Zoledronic acid
Funding: This study was funded by Tabriz University of Medical Sciences.
Conflict of interest: None declared.
Ethical approval: The Ethics Committee of Tabriz University of Medical Sciences approved the study (IR.TBZMED.VCR.REC.1398.242).
How to cite this article: Nikasa Mina, Noruzinia Mehrdad, Farshdousti Hagh Majid. Evaluation of Changes in Global DNA Methylation during Osteoblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells: A Laboratory Study. J Rafsanjan Univ Med Sci 2022; 21 (02): 207-20. [Farsi]
[1]- کارشناس ارشد، گروه ژنتیک، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تبریز، تبریز، ایران
[2]- دانشیار، گروه هماتولوژی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
[3]- دانشیار، مرکز تحقیقات هماتولوژی و انکولوژی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران
تلفن: 33364665-041، دورنگار: 33364664-041، پست الکترونیکی: m.farshdousti@gmail.com
تلفن: 33364665-041، دورنگار: 33364664-041، پست الکترونیکی: m.farshdousti@gmail.com
[4]- MSc, Dept. of Genetics, Islamic Azad University, Tabriz Branch, Tabriz, Iran
[5]- Associate Prof., Dept. of Hematology, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
[6]- Associate Prof., Hematology and Oncology Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, Tabriz, Iran, ORCID: 0000-0002-2340-6594
(Corresponding Author) Tel: (041) 33364665, Fax: (041) 33364664, E-mail: m.farshdousti@gmail.com
(Corresponding Author) Tel: (041) 33364665, Fax: (041) 33364664, E-mail: m.farshdousti@gmail.com
نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله:
زيست شناسي
دریافت: 1400/9/15 | پذیرش: 1401/2/5 | انتشار: 1401/2/30
دریافت: 1400/9/15 | پذیرش: 1401/2/5 | انتشار: 1401/2/30
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
