جلد 18، شماره 5 - ( 4-1398 )                   جلد 18 شماره 5 صفحات 454-441 | برگشت به فهرست نسخه ها

XML English Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Didar Z. The Effect of Biosurfactant of Saccharomyces Cerevisiae on Biofilms Produced by Staphylococcus Aureus, Epidermidis and Saprophyticus: A Laboratory Study. JRUMS 2019; 18 (5) :441-454
URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-4492-fa.html
دیدار زهره. اثر بیوسورفکتانت ساکارومایسس سرویسیه بر بیوفیلم‌های تشکیل شده توسط استافیلوکوکوس اورئوس، اپیدرمیدیس و ساپروفیتیکوس: یک مطالعه آزمایشگاهی . مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان. 1398; 18 (5) :441-454

URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-4492-fa.html


دانشگاه آزاد اسلامی نیشابور
متن کامل [PDF 353 kb]   (1266 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (2166 مشاهده)
متن کامل:   (1052 مشاهده)
مقاله پژوهشی
مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان
دوره 18، مرداد 1398، 454-441
 
 
 
اثر بیوسورفکتانت ساکارومایسس سرویسیه بر بیوفیلم‌های تشکیل شده توسط استافیلوکوکوس اورئوس، اپیدرمیدیس و ساپروفیتیکوس:
یک مطالعه آزمایشگاهی
 
زهره دیدار [1]
 
دریافت مقاله:6/8/97      ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 12/10/97  دریافت اصلاحیه از نویسنده: 30/11/97       پذیرش مقاله: 1/12/97
 
 
 

چکیده
زمینه و هدف: بیوسورفکتانت‌ها، مولکول‌های آمفی‌فیلیک تولیدی توسط میکروارگانیسم‌ها هستند که به علت فعالیت سطحی کاربردهای مختلفی از جمله پاک‌کنندگی، امولسیون‌سازی و پراکنده‌کنندگی در صنایع مختلف دارند. هدف از این تحقیق تعیین اثر بیوسورفکتانت استخراجی ساکارومایسس سرویسیه در برابر تشکیل بیوفیلم استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1112)، استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس (PTCC 1440) و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس PTCC 1435)) است. اثر این نوع بیوسورفکتانت در خارج کردن بیوفیلم باکتری­های مذکور نیز بررسی گردید. 
مواد و روش‌ها: در این مطالعه آزمایشگاهی، پس از کشت ساکارومایسس سرویسیه جهت تولید بیوسورفکتانت و استخراج بیوسورفکتانت تولیدی، بررسی اثر بیوسورفکتانت تولیدی در جلوگیری از تشکیل بیوفیلم باکتری‌های استافیلوکوکوس اورئوس، اپیدرمیدیس و ساپروفیتیکوس با استفاده از میکروپلیت پلی استایرن 96 چاهک و قرائت جذب در طول موج 570 نانومتر توسط الایزا ریدر صورت گرفت. جهت بررسی میزان خارج کردن بیوفیلم‌های میکروبی تشکیل شده نیز از روش جذب سنجی استفاده شد. داده‌ها توسط آنالیز ANOVA انجام شد. میانگین تیمارها به روش دانکن در سطح اطمینان 99 درصد مقایسه گردیدند.
یافته‌ها: بررسی ویژگی‌های بیوسورفکتانت تولیدی ساکارومایسس سرویسیه نشان داد که این نوع بیوسورفکتانت دارای اندیس امولسیفیکاسیون حدود 55% است. میزان فعالیت بیوسورفکتانت جداسازی شده توسط تکنیک پخش روغن تعیین شد و منطقه جایگزینی روغن برابر با 5/0±5/2 سانتی‌متر‌مربع بود. با بررسی اثر بیوسورفکتانت تولیدی توسط ساکارومایسس سرویسیه در جلوگیری از تشکیل بیوفیلم مشخص گردید که بیش‌ترین اثر را بر بیوفیلم باکتری‌های استافیلوکوکوس اورئوس و استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس داشت. بیوسورفکتانت سبب خارج شدن بیوفیلم کلیه باکتری‌های مورد مطالعه گردید.
نتیجه‌گیری: بیوسورفکتانت ساکارومایسس سرویسیه اثرات ضد بیوفیلمی قوی بر روی بیوفیلم باکتری‌های استافیلوکوکوس اورئوس، اپیدرمیدیس و ساپروفیتیکوس دارد.
واژه‌های کلیدی: بیوسورفکتانت، ساکارومایسس سرویسیه، استافیلوکوکوس
 
مقدمه
سورفکتانت‌ها گروهی از ترکیبات با ساختار تشکیل شده از دو بخش آب دوست و آب گریز هستند که در حد فاصل دو فاز با قطبیت متفاوت قرار می گیرند، در نتیجه سبب کاهش کشش سطحی شده و میکروامولسیون تشکیل می‌دهند و سبب حل شدن هیدروکربن‌های نامحلول می‌شوند. این ویژگی سبب ایجاد سایر ویژگی‌ها نظیر پاککنندگی، امولسیون‌سازی، کف‌کنندگی و پراکنده‌کنندگی سورفکتانت‌ها می‌گردد [۱]. صنعت تولید سورفکتانت‌ها با روند بالایی در حال توسعه است. عملاً تمام این سورفکتانت‌ها به روش شیمیایی سنتز می‌شوند. با این وجود، در سال‌های اخیر به دلیل تجدیدپذیر بودن، قابلیت تجزیه بیولوژیکی و خصوصیات کاربردی بیوسورفاکتانت‌ها، این دسته از سورفکتانت‌ها مورد توجه قرار گرفته‌اند.
از طرف دیگر می‌توان بیوسورفکتانت‌ها را با استفاده از منابع ارزان قیمت تولید نمود و هم‌چنین می‌توان با تغییر در مواد اولیه، ساختمان و کارایی بیوسورفکتانت‌های حاصله را تغییر داد. همین‌طور بیوسورفکتانت‌ها قادر به حفظ کیفیت در دامنه وسیعی از دما،  pHو شوری هستند [2]. بیوسورفکتانت‌های اصلی شامل گلیکولیپیدها، فسفولیپیدها و اسیدهای چرب، لیپوپپتید و لیپوپروتئین‌ها، بیوسورفکتانت‌های پلیمری و بیوسورفکتانت‌های ویژه هستند.
میکروارگانیسم‌های مختلفی توانایی تشکیل بیوسورفکتانت‌هایی از جمله لاکتوباسیلوس هلویتیکوس [3]، سودوموناس آئروژنوزا [۴]، اسینتوباکتر ایندیکوس [5] وکاندیدا یوتیلیس را دارند [6].
بیوفیلم از کلنیهای میکروبی تشکیل شده است که بر روی سطوح مختلف متصل شده و رشد و تکثیر مینمایند. به دلیل مقاومت بیش‌تر باکتری‌ها در برابر ترکیبات ضد عفونی کننده در شرایط تشکیل بیوفیلم، بیوفیلمهای باکتریهای بیماریزا مشکلات زیادی از نظر ایمنی به وجود میآورند. باکتریهای بیماریزایی نظیر اشرشیاکلی، لیستریا مونوسیتوژنز، سالمونلا تیفی موریوم، کمپیلوباکتر ژژونی و یرسینیا انتروکولیتیا توانایی تشکیل بیوفیلم دارند [7]. یکی از روش‌های جلوگیری از تشکیل بیوفیلم، استفاده از بیوسورفکتانت‌ها است [8]. بیوسورفکتانت‌ها مانع از تشکیل بیوفیلم می‌شوند و یا این که تشکیل بیوفیلم را به تأخیر می‌‌ندازند که علت آن ساختار دوقطبی این ترکیبات است.
اثرات ضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت تولیدی توسط میکروارگانیسم‌های مختلف از جمله اثر ضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت باکتری‌های خانواده اسید لاکتیک در برابر بیوفیلم تولیدی توسط اشرشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس [9]، خاصیت ضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت ساکارومایسس سرویسیه در برابر کاندیدا آلبیکانس و باسیلوس سوبتلیس بررسی شده‌اند [10].
 Sunو همکاران (2018) اثر بیوسورفکتانت‌ها در خارج کردن بیوفیلم تشکیل شده باکتری اشرشیاکلی را به میزان 75% گزارش نموده‌اند [11].
 Karlapudiو همکاران در سال 2018، اثر ضد باکتریایی و ضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت استخراجی از اسینتوباکتر ایندیکوس M6 در برابر بیوفیلم‌های استافیلوکوکوس اورئوس را بررسی نموده و گزارش کردند که غلظت 200 میکروگرم در میلی­لیتر از این بیوسورفکتانت مانع از تکثیر باکتری گردید. هم­چنین عمل­آوری بیوفیلم­های تشکیل شده با میزان 50 میکروگرم در میلی­لیتر از این بیوسورفکتانت تا بیش از 5/82 درصد تجزیه بیوفیلم را نشان داد [۵].
Campos و همکاران (2015) توانایی کاندیدا یوتیلیس در تولید بیوسورفکتانت و افزودن آن در فرمولاسیون سس مایونز را بررسی نموده است و بررسی­های سم شناسی، غیر سمی بودن این ترکیب را اثبات نموده است [6].
مخمر ساکارومایسس سرویسیه از جمله گونه­های مخمری تولید کننده بیوسورفکتانت است [12].
لذا هدف از این تحقیق "تعیین اثر بیوسورفکتانت استخراجی ساکارومایسس سرویسیه در برابر تشکیل بیوفیلم استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1112)، استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس (PTCC 1440) و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس (PTCC 1435) و توانایی خارج کردن بیوفیلم آن­ها" بود.
مواد و روش‌ها
تحقیق آزمایشگاهی حاضر دارای کد اخلاق به شماره 012-1397 از دانشگاه آزاد اسلامی واحد نیشابور می‌باشد. در این تحقیق، ابتدا سویه­های میکروبی استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1112)، استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس (PTCC 1440) و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس PTCC 1435)) به صورت لیوفیلیزه از سازمان پژوهش­های علمی و صنعتی ایران تهیه گردید. ویال باکتریایی در شرایط استریل، شکسته شده و به محیط براث مناسب (تریپتوز سوی براث در مورد استافیلوکوکوس اورئوس و نوترینت براث در مورد استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس) منتقل گردید و برای مدت 24 ساعت در دمای 32 درجه سانتی گراد، گرم‌خانه گذاری شد. سلول‌های میکروبی توسط سانتریفوژ مدل ALC4232 با دور rpm 4000 جدا شدند. سپس توسط روش مک فارلند جمعیت باکتریایی تعیین شد [13] و با رقیق سازی به نسبت 01/0 توسط سرم فیزیولوژی­، جمعیت تقریبی106×5/1  باکتری در هر میلی­لیتر به دست آمد [14].
مخمر خشک از آستان قدس رضوی خریداری گردید. مراحل آماده سازی شامل انتقال مخمر بر روی محیط کشت سابارو دکستروز آگار و انکوباسیون در دمای 30 درجه سانتی­گراد به مدت 24 ساعت صورت گرفت [12].  
سپس به 25 میلی­لیتر محیط کشت   Yeast extract-peptone- glucoseبراث ( YEPGبراث) حاوی 10 گرم عصاره مخمر 20 گرم گلوکز و 20 گرم پپتون در 1000 میلی­لیتر آب مقطر انتقال داده شد و در دمای 30 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت گرم‌خانه گذاری گردید [15]. تولید بیوسورفکتانت توسط مخمر ساکارومایسس سرویسیه، به این صورت انجام شد که مقدار 500 میلی‌لیتر از محیط کشت YPEG براث آماده­سازی گردید و 2 میلی‌لیتر سوسپانسیون مخمر ساکارومایسس سرویسیه به آن اضافه شد و با سرعت 125 دور در دقیقه در دمای 30 درجه سانتی گراد به مدت 36 ساعت گرم­خانه گذاری گردید. سپس، خالص سازی بیوسورفکتانت صورت گرفت [10].
جهت تعیین میزان فعالیت بیوسورفکتانت جداسازی شده از تکنیک پخش روغن با استفاده از روغن­ خام سویا استفاده شد. 50 میلی­لیتر آب مقطر در یک پلیت بزرگ ریخته و مقدار 100 میکرولیتر از روغن­های خام بر روی سطح آب اضافه شد. سپس 10 میکرولیتر فاز بالایی حاصل از مرحله قبل به آن اضافه شد و منطقه پخش روغن اندازه گیری شد [16].
اندیس امولسیفیکاسیون نیز با برداشتن حجم معادل از کشت براث (1 میلی لیتر) و 1 میلی­لیتر پارافین که برای مدت 24 ساعت نگه­داشته شد. پس از 24 ساعت، لایه امولسیفه شده بر حسب سانتی­متر اندازه­گیری شد [17].
100 میکرولیتر از براث حاوی باکتری­های استافیلوکوکوس اورئوس، استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس در چاهک ریخته شدند. غلظت­های متفاوتی از بیوسورفکتانت ساکارومایسس سرویسیه (1، 2 و 3 میلی­گرم در میلی­لیتر) به هر یک از چاهک­های میکروپلیت حاوی میکروارگانیسم­های مورد مطالعه اضافه شد و در دمای 37 درجه سانتی­گراد به مدت 24 ساعت گرم­خانه گذاری گردید. چاهک­های حاوی محیط کشت براث استریل به تنهایی به عنوان شاهد استفاده شد. پس از گرم­خانه گذاری، محیط کشت براث تخلیه شد و هر یک از چاهک­ها سه مرتبه با 200 میکرو‌لیتر بافر فسفات حاوی نمک (فسفات هیدروژن دی سدیم 7 میلی­مول، فسفات دی هیدروژن سدیم 3 میلی‌مول و کلرید سدیم 130 میلی مول،  4/7=pH شستشو گردید تا سلول­های آزاد خارج شوند و به صورت معکوس قرار داده شد تا خشک گردد. سپس توسط اتانل 95% لایه بیوفیلم تثبیت گردید و توسط 100 میکرو­لیتر کریستال ویوله 1% به مدت 5 دقیقه رنگ آمیزی شد. باقی­مانده رنگ توسط آب مقطر استریل سه مرتبه شستشو گردید و میکروپلیت به مدت 30 دقیقه خشک گردید. سپس دانسیته نوری در طول موج 570 نانومتر توسط الایزا ریدر (مدل AWARNESS) در هر چاهک قرائت شد. میزان تشکیل بیوفیلم به این صورت دسته­بندی گردید. دانسیته نوری ˂1 ، تشکیل بیوفیلم به میزان زیاد؛ 1˂ دانسیته نوری > 1/0 تشکیل بیوفیلم متوسط؛ 1/0˂دانسیته نوری ، عدم تشکیل بیوفیلم در نظر گرفته شد[18]
جهت بررسی اثر بیوسورفکتانت استخراجی ساکارومایسس سرویسیه در خارج کردن بیوفیلم­های باکتری­های استافیلوکوکوس ابتدا جمعیت معینی (108 باکتری در هر میلی­لیتر) از هر یک از باکتری­های استافیلوکوکوس اورئوس، اپیدرمیدیس و ساپروفیتیکوس در میکروپلیت کشت داده شد و در دمای 37 درجه سانتی­گراد به مدت 24 ساعت گرم­خانه­گذاری گردید. سپس درصدهای مختلفی از بیوسورفکتانت استخراجی ساکارومایسس سرویسیه شامل (1، 2 و 3 میلی­گرم در میلی­لیتر) به هر چاهک اضافه شد و در دمای 37 درجه سانتی­گراد به مدت 150 دقیقه مجدد گرم­خانه­گذاری گردید. سپس محتویات هر چاهک تخلیه شده و سایر مراحل شستشو و رنگ­آمیزی میکروپلیت مشابه روش ذکر شده در قسمت بالا صورت گرفت [19].
جهت بررسی میزان ممانعت از تشکیل بیوفیلم از تکنیک میکروسکوپ نوری مطابق روش محمدی بازرگانی (2016) به کار برده شد. جهت تشکیل بیوفیلم، ابتدا میکروارگانیسم­های مورد مطالعه (استافیلوکوکوس اورئوس، اپیدرمیدیس و ساپروفیتیکوس) برروی لام شیشه­ای منتقل و برای مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد گرم خانه­گذاری گردید. سپس لام­های شیشه­ای حاوی باکتری­های مورد مطالعه، در مواجهه با بیوسورفکتانت استخراجی ساکارومایسس سرویسیه قرار گرفت (به جز نمونه­های شاهد). پس از انجام مراحل شستشو و رنگ آمیزی، توسط میکروسکوپ نوری مدل Olympus با بزرگ­نمایی 1000 مورد بررسی قرار گرفت [20].
اثر غلظت­های مختلف بیوسورفکتانت ساکارومایسس سرویسیه بر میزان تشکیل بیوفیلم و نیز میزان خارج کردن بیوفیلم باکتری­های مورد بررسی به صورت میانگین و خطای استاندارد میانگین (Mean±SD) ثبت شد. محاسبات آماری توسط نرم افزار SPSS نسخه 14 و با تست ANOVA انجام شد. میانگین تیمارها به روش دانکن در سطح اطمینان 99 درصد مقایسه گردیدند.

نتایج
نتایج بررسی­های انجام شده نشان داد که اندیس امولسیفیکاسیون بیوسورفکتانت استخراجی ساکارومایسس سرویسیه 55% است. هم­چنین بررسی فعالیت بیوسورفکتانتی توسط روش جایگزینی روغن نشان داد که میزان منطقه جایگزینی روغن در مورد این بیوسورفکتانت  5/0±5/2 سانتی­متر­مربع بود.
در مطالعه حاضر، اثرات ضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت استخراجی از ساکارومایسس سرویسیه در برابر بیوفیلم‌های استافیلوکوکوس اورئوس، ساپروفیتیکوس و اپیدرمیدیس مورد بررسی قرار گرفته است. نتایج نشان دهنده این است که میزان تشکیل بیوفیلم توسط هر سه گونه باکتریایی مورد مطالعه تحت تأثیر وجود بیوسورفکتانت میکروبی است و اثر ضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت ساکارومایسس سرویسیه با افزایش غلظت بیوسورفکتانت، افزایش می­یابد (01/0 p) (جدول1).
در بررسی میزان کارایی بیوسورفکتانت ساکارومایسس سرویسیه در خارج کردن بیوفیلم­های باکتریایی استافیلوکوکوس­های مختلف (استافیلوکوکوس اوئوس، استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس) مشخص گردید که غلظت بیوسورفکتانت و نوع باکتری تشکیل دهنده بیوفیلم  بر میزان خارج شدن بیوفیلم تشکیل شده ﻣﺆثر هستند (جدول2). بیوفیلم باکتری استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس بیش‌ترین مقاومت در برابر بیوسورفکتانت ساکارومایسس سرویسیه نشان داد اما بیوفیلم باکتری‌های استافیلوکوکوس اورئوس و استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس رفتار مشابهی در برابر بیوسورفکتانت ساکارومایسس سرویسیه نشان دادند (جدول2).
تصاویر میکروسکوپی (شکل 1) بیوفیلم باکتری استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس قبل از مواجهه با بیوسورفکتانت ساکارومایسس سرویسیه را با بزرگ­نمایی 1000 نشان می­دهد. بعد از مواجهه با بیوسورفکتانت ساکارومایسس سرویسیه در غلظت 3 میلی­گرم در میلی‌لیتر هیچ‌گونه اثری از وجود بیوفیلم مشاهده نگردید.
 
Description: C:UsersuserAppDataLocalMicrosoftWindowsINetCacheContent.Wordمخمر قبل.tif
 
 
 
 
 
 
 
 

شکل 1- تصویر میکروسکوپی با بزرگ­نمایی 1000 از بیوفیلم باکتری استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس. قبل از مواجهه با بیوسورفکتانت استخراجی ساکارومایسس سرویسیه.
 
 
 
 
 
جدول 1- اثر بیوسورفکتانت ساکارومایسس سرویسیه در تشکیل بیوفیلم باکتری­های جنس استافیلوکوکوس
 
 
 
تیمار دانسیته نوری در 570 نانومتر کیفیت تشکیل بیوفیلم تیمار دانسیته نوری در 570 نانومتر کیفیت تشکیل بیوفیلم تیمار دانسیته نوری در 570 نانومتر کیفیت تشکیل بیوفیلم
استافیلوکوکوس اورئوس به تنهایی 03/0 ± 254/0a متوسط استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس به تنهایی 019/0± 138/0a متوسط استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس به تنهایی 017/0± 146/0a متوسط
 
استافیلوکوکوس اورئوس همراه با mg/ml 1 بیوسورفکتانت 002/0± 01/0b عدم تشکیل استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس همراه با mg/ml 1 بیوسورفکتانت 03/0 ± 136/0b متوسط استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس همراه با mg/ml 1 بیوسورفکتانت 005/0± 064/0b عدم تشکیل
 
استافیلوکوکوس اورئوس همراه با mg/ml 2 بیوسورفکتانت 002/0± 009/0c عدم تشکیل استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس همراه با mg/ml 2 بیوسورفکتانت 02/0 ± 122/0c متوسط استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس همراه با mg/ml 2 بیوسورفکتانت 004/0 ± 04/0c عدم تشکیل
 
استافیلوکوکوس اورئوس همراه با mg/ml 3 بیوسورفکتانت 003/0± 002/0d عدم تشکیل استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس همراه با mg/ml 3 بیوسورفکتانت 003/0± 116/0d عدم تشکیل استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس همراه با mg/ml 3 بیوسورفکتانت 003/0± 027/0d عدم تشکیل
               
نتایج آزمون آنالیز آماری به صورت خطای استاندارد میانگین ± میانگین. میانگین‌ها با حروف مشابه در هر ستون فاقد اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد هستند (آزمون چند دامنه دانکن).
 
جدول 2- اثر بیوسورفکتانت ساکارومایسس سرویسیه در خارج کردن بیوفیلم باکتری­های جنس استافیلوکوکوس
 
تیمار دانسیته نوری در 570 نانومتر کیفیت تشکیل بیوفیلم تیمار دانسیته نوری در 570 نانومتر کیفیت تشکیل بیوفیلم تیمار دانسیته نوری در 570 نانومتر کیفیت تشکیل بیوفیلم
استافیلوکوکوس اورئوس به تنهایی 03/0 ± 254/0a متوسط استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس به تنهایی 019/0± 138/0a متوسط استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس به تنهایی 017/0± 146/0a متوسط
 
بیوفیلم استافیلوکوکوس اورئوس در مواجهه با mg/ml 1 بیوسورفکتانت 003/0 ± 02/0b عدم تشکیل بیوفیلم استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس در مواجهه با mg/ml 1 بیوسورفکتانت 005/0± 027/0b عدم تشکیل بیوفیلم استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس در مواجه با mg/ml 1  بیوسورفکتانت 007/0± 024/0b عدم تشکیل
 
بیوفیلم استافیلوکوکوس اورئوس در مواجهه با mg/ml 2 بیوسورفکتانت 004/0 ± 015/0c عدم تشکیل بیوفیلم استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس در مواجهه با mg/ml 2  بیوسورفکتانت 006/0± 02/0c عدم تشکیل بیوفیلم استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس در مواجهه با mg/ml 2  بیوسورفکتانت 006/0± 019/0c عدم تشکیل
 
بیوفیلم استافیلوکوکوس اورئوس در مواجهه با mg/ml 3 بیوسورفکتانت 003/0 ± 011/0d عدم تشکیل بیوفیلم استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس در مواجهه با mg/ml 3 بیوسورفکتانت 004/0± 012/0d عدم تشکیل بیوفیلم استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس در مواجهه با mg/ml 3 بیوسورفکتانت 005/0± 011/0d عدم تشکیل
 
 
نتایج آزمون آنالیز آماری به صورت خطای استاندارد میانگین ± میانگین. میانگین‌ها با حروف مشابه در هر ستون فاقد اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد هستند (آزمون چند دامنه دانکن).
 
بحث
بررسی­ها در خصوص ویژگی­های بیوسورفکتانت استخراجی ساکارومایسس سرویسیه نشان داد این ماده دارای خاصیت بیوسورفکتانتی حدود 55% بود و منطقه جایگزینی روغن که به منظور بررسی میزان خاصیت بیوسورفکتانتی صورت گرفت برابر با 5/0±5/2 سانتی­متر مربع بود.
نتایج جذب سنجی نشان دهنده توانایی تشکیل بیوفیلم توسط هر سه گونه استافیلوکوکی مورد مطالعه است به طوری که میزان دانسیته جذب نوری در طول موج 570 نانومتر مربوط به استافیلوکوکوس اورئوس، اپیدرمیدیس و ساپروفیتیکوس به ترتیب مقادر 254/0، 138/0 و 146/0 بود که نشان­گر تشکیل بیوفیلم به میزان متوسط در هر سه گونه باکتریایی است (جدول1). توانایی تشکیل بیوفیلم توسط استافیلوکوکوس اورئوس و اپیدرمیدیس در سایر گزارشات نیز اشاره شده است [21].
در مورد بیوفیلم استافیلوکوکوس اورئوس و ساپروفیتیکوس، مواجهه با غلظت­های 1، 2 و 3 میلی­گرم در میلی­لیتر از بیوسورفکتانت ساکارومایسس سرویسیه، میزان دانسیته نوری در 570 نانومتر کم­تر از 1/0 بود که نشان دهنده عدم تشکیل بیوفیلم در این شرایط است ولی در مورد بیوفیلم استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس فقط در غلظت 3 میلی­گرم در میلی­لیتر، میزان دانسیته نوری در 570 نانومتر کم‌تر از 1/0 بود که به معنای عدم تشکیل بیوفیلم است، ولی در غلظت­های 1 و 2 میلی­گرم در میلی­لیتر، تشکیل بیوفیلم به میزان متوسط اندازه­گیری شد (جدول 1).
اثر ضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت­های میکروبی در سایر تحقیقات گزارش شده است از جمله Karlapudi و همکاران (2018) اثر ضد باکتریایی و ضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت استخراجی از اسینتوباکتر ایندیکوس M6 در برابر بیوفیلم­های استافیلوکوکوس اورئوس را بررسی نموده است و گزارش کرده است که غلظت 200 میکروگرم در میلی­لیتر از این بیوسورفکتانت مانع از تکثیر باکتری گردید [5].
Merghni و همکاران در سال 2017، اثرات ضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت تولیدی توسط لاکتوباسیلوس کازئی را بر روی بیوفیلم­های استافیلوکوکوس اورئوس بررسی نموده اند. مطابق این تحقیق بیوسورفکتانت استخراجی این باکتری اثرات ضد اتصالی بیوفیلم و هم­چنین اثرات ضد بیوفیلمی در برابر استافیلوکوکوس اورئوس داشته است [22].
تعدادی از میکروارگانیسم­ها ترکیبات بیوسورفکتانت را به منظور ایجاد تغییر در خصوصیات سطحی نظیر قابلیت مرطوب شدن، کاهش کشش سطحی و توانایی تشکیل میکروامولسیون تولید می­کنند [1] و در نتیجه سبب جلوگیری از اتصال بعضی سلول­های میکروبی و تشکیل بیوفیلم می­شود. هم­چنین در خارج کردن بیوفیلم از روی سطوح مختلف می­توانند ﻣﺆثر باشند.
نتایج حاصل از برررسی اثر بیوسورفکتانت ساکارومایسس سرویسیه در خارج کردن بیوفیلم تشکیل شده باکتری­های جنس استافیلوکوکوس نشان داد که مواجهه بیوفیلم­های استافیلوکوکوس­های مورد مطالعه در تمامی غلظت­های بیوسورفکتانت ساکارومایسس سرویسیه (3-1 میلی گرم در میلی­لیتر) دانسیته نوری در 570 نانومتر کم‌تر از 1/0 بودند که این نشان دهنده عدم وجود بیوفیلم است، در نتیجه بیوسورفکتانت ساکارومایسس سرویسیه در تمام غلظت­های 3-1 میلی­گرم در میلی­لیتر به طور کامل بیوفیلم تشکیل شده توسط باکتری­های استافیلوکوکوس اورئوس، اپیدرمیدیس و ساپروفیتیکوس را خارج نموده است (جدول2).
بیوسورفکتانت سنتزی در مطالعه انجام شده توسط Sun و همکاران (2018) سبب خارج شدن بیوفیلم باکتری اشرشیاکلی به میزان 75٪ در غلظت 125 میلی­گرم در میلی­لیتر گردیده است [11].
Sriram و همکاران (2011) اثرات ضد بیوفیلمی بیوسورفکتانت لیپوپپتیدی تولیدی توسط باسیلوس سرئوس را در برابر بیوفیلم­های باکتری سودوموناس آئروژنوزا و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس بررسی نموده و گزارش کردند که این نوع بیوسورفکتانت تا حدود 57٪ از تشکیل بیوفیلم جلوگیری می­کند [23].
نتیجه‌گیری
ساکارومایسس سرویسیه توانایی تشکیل بیوسورفکتانت با قدرت بیوسورفکتانتی 55 درصد را دارد. بیوسورفکتانت تولیدی توسط ساکارومایسس سرویسیه اثرات ضد بیوفیلمی بر بیوفیلم باکتری­های استافیلوکوکوس اورئوس، استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس دارد. هم­چنین این ماده قابلیت تخریب و خارج کردن بیوفیلم باکتری­های استافیلوکوکوس اورئوس، استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و ساپروفیتیکوس را دارد.
تشکر و قدردانی
از آزمایشگاه میکروبیولوژی و صنایع غذایی دانشگاه آزاد اسلامی واحد نیشابور جهت فراهم نمودن امکانات انجام این تحقیق، تشکر و قدردانی می­گردد
 
 
 
 
 
References
 
 
[1] Banat IM, De Rienzo M A D. Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents. Appl Microbiol Biotechnol 2014; 98(24): 9915-29.
[2] Kosaric N. Biosurfactants in industry. Pur Appl  Chem 1993; 6: 1731-7.
[3] Sharma D, Singh Saharan B. Functional characterization of biomedical potential of biosurfactant produced by Lactobacillus helveticus. Biotechnol Rep 2016;  11: 27–35.
[4] Amani H, Müller MM, Syldatk C, Hausmann R. Production of microbial rhamnolipid by Pseudomonas aeruginosa MM1011 for ex situ enhanced oil recovery. Appl Biochem Biotechnol 2013; 170 (5): 1080-93.
[5] Karlapudi A P, Venkateswarulu T C, Srirama K, Krishna Kota R, Mikkili I,Kodali V P. Evaluation of anti-cancer, anti-microbial and anti-biofilm potential of biosurfactant extracted from an Acinetobacter M6 strain. J King Saud Univ Sci 2018 https://doi.org/10.1016/ j.jksus. 2018.04.007.
[6] Campos J M, Stamford T L M, Rufino R D, Luna J M, Stamford T C M, Sarubbo L A. Formulation of mayonnaise with the addition of a bioemulsifier isolated from Candida utilis. Toxicol Rep 2015;  2: 1164–70.
[7] Didar  Z. Novel hygienic issues in food industry. Islamic azad university publication. 2018. pp: 5-8. .[Farsi].
[8] de Freitas Ferreira J, Alan Vieira E, Nitschke M. The antibacterial activity of rhamnolipid biosurfactant is pH dependent. Food. Res Int 2018. https://doi.org/10.1016/j.foodres. 2018.09. 005.
[9] Kaur S, Amrita Kaur P,  Ravinder Nagpal R. In vitro biosurfectant production and biofilm inhibition by lactic acid bacteria isolated from fermented food products.  Int J Probiotics Prebiotics 2015; 10(1): 17-22.
[10] Johny JM. Inhibitory effect of biosurfactant purified from probiotic yeast against biofilm producers. IOSR J Environ Sci Toxicol Food Technol 2013; 6(1): 51-5. 
[11] Sun W, Wang Y, Zhang W, Ying H, Wang P. Novel surfactant peptide for removal of biofilms. Colloids Surf B 2018;  172: 180–186.
[12] Nibras Nazar Mahmood. 2018. Effect of biosurfactants purified from Saccharomyces cerevisiae against Corynebacterium urealyticum. J Pharm Sci & Res 2018;  10(3): 481-6.
[13] Mohammadi N, Mirhosseini M, Shirzad M, Dehghan Hamdan A, Yazdani N. Synthesizing Zno Nanoparticles by High-Energy Milling and Investigating Their Antimicrobial Effect. J Shahid Sadoughi Uni Med Sci 2015;  23(4): 2070-82. [Farsi].
[14] Moradian Eivari A K, Salehi M, Malek Jafarian M. Antimicrobial Activity of Rosmarinus Officinalis on Vancomycin –Resistant Staphylococcus aureus Isolated from Imam Reza Hospital Patients of Mashhad. J Neyshabur Uni Med Sci 2015; 3(3): 39-45.[Farsi].
[15] Dhivya H, Balaji S, Madhan Rand Srv A. Production of amphiphilic surfactant molecule from Saccharomyces cerevisiae Mtcc 181 and its protagonist in nanovesicle synthesis. Int J Pharma Sci 2014; 11:16-23.
[16] Rodrigues LR,  Teixeira J A, Mei H C. Physicochemical and functional characterization of a biosurfactant produced by Lactococcus lactis 53. Colloids Surf B 2006; 49: 78-85.
[17] Bodour A A, Miller R M. 2004. Biosurfactant types, screening, methods, and applications. In: Bitton, G. (Ed.), Encyclopedia of Environmental Microbiology, first ed. John Wiley and Sons, Inc., Hoboken, NJ, pp. 750–770.
 [18] Noumi E, Snoussi M,  Merghni A, Nazzaro F,  Quind G. Akdamar G, et al.  Phytochemical composition, anti-biofilm and anti-quorum sensing potential of fruit, stem and leaves of Salvadora persica L. methanolic extracts. Microb Pathog 2017;109 : 169-176.
[19] Todorov S D, de Paula O A L, Camargo A C, Lopes D A, Nero L A. Combined effect of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum ST8SH and vancomycin, propolis or EDTA for controlling biofilm development by Listeria monocytogenes. Rev Argent Microbiol 2018; 50(1):48-55.
 [20] Mohammadi Bazargani M, Rohloff  J. Antibiofilm activity of essential oils and plant extracts against Staphylococcus aureus and Escherichia coli biofilms.  Food Control  2016; 61: 156-64.
 [21] Izano EA, Amarante M A, Kher  WB, Kaplan J B. Differential Roles of Poly-N-Acetylglucosamine Surface Polysaccharide and Extracellular DNA in Staphylococcus aureus  and Staphylococcus epidermidis Biofilms. Appl. Environ. Microbiol 2008. 74(2): 470-6.
[22] Merghni A.  Dallel I. Noumi E. Kadmi Y. Hentati H. Tobji S.  Mastouri M.   Antioxidant and antiproliferative potential of biosurfactants
isolated from Lactobacillus casei and their anti-biofilm effect in oral Staphylococcus aureus strains. Microb Pathog 2017;104: 84-9.
[23] Sriram MI, Kalishwaralal K, Deepak V, Gracerosepat R, Srisakthi K, Gurunathan S. Biofilm inhibition and antimicrobial action of lipopeptide biosurfactant produced by heavy metal tolerant strain Bacillus cereus NK1. Colloids Surf B Biointerfaces 2011; 85(2):174-81

 
The Effect of  Biosurfactant of Saccharomyces Cerevisiae on Biofilms Produced by Staphylococcus Aureus, Epidermidis and Saprophyticus: A Laboratory Study
Z. Didar [2]
 
Received: 28/10/2018  Sent for Revision: 02/01/2019    Received Revised Manuscript: 19/02/2019              Accepted: 20/02/2019
 
Background and Objectives: Biosurfactants are amphiphilic molecules produced by microorganisms that due to  surfactant activity, have several applications in different industries such as cleaning, emulsification, foaming and dispersion. The aim of this study was to investigate the effect of biosurfactant extracted from saccharomycess cerevisiae on biofilm formation of staphylococcus aureus (PTCC 1112), staphylococcus saprophyticus (PTCC 1440) and staphylococcus epidermidis (PTCC 1435). The effect of this biosurfactant on the removal of the mentioned bacteria’s biofilms was also assessed.
Materials and Methods: In this laboratory study, after Saccharomycess cerevisiae cultivation for producing biosurfactant  and extraction of the produced biosurfactant , the effect of the extracted biosurfactant in preventing the formation of biofilms of staphylococcus aureus, staphylococcus saprophyticus and staphylococcus epidermidis was assessed using  96-well polystyrene microplate and absorbance reader at 570nm by ELISA reader. The same method was used for determining the ability of biosurfectant in removal of biofilms. Statistical analysis was performed by ANOVA. The means of treatments were compared with Duncan's method at a confidence level of 99%.
Results: The results showed that biosurfactant of saccharomycess cerevisiae had an emulsification index equal to 55%. The biosurfactant activity was determined via  the oil displacement method and the area of displaced oil was 2.5±0.5 cm2. The results showed  the biosurfactant produced by saccharomycess cerevisiae had the most effect on preventing biofilm formation by staphylococcus aureus and staphylococcus saprophyticus. Biosurfactant caused the all tested bacteria’s biofilms to be removed. 
Conclusion: Biosurfactant produced by saccharomycess cerevisiae has strong  anti-biofilm activity against biofilms of Staphylococcus aureus, epidermidis and saprophyticus.
Key words: Biosurfactant, Saccharomycess cerevisiae, Staphylococcus
.
Funding: This study did not have any funds.
Conflict of interest: None declared.
Ethical approval: This protocol was registered at IR.IAU.NEYSHABUR.REC.1397.012 at the I.R. Iran Islamic Azad University. The Ethics Committee of the Islamic Azad University has approved this protocol.
 
How to cite this article: Didar Z. The Effect of Biosurfactant of Saccharomyces Cerevisiae on Biofilms Produced by Staphylococcus Aureus, Epidermidis and Saprophyticus: A Laboratory Study. Rafsanjan Univ Med Sci 2019; 18 (5): 441-54. [Farsi]
 
 
 
[1]- ( نویسنده مسئول) استادیار گروه صنایع غذایی، واحد نیشابور، دانشگاه آزاد اسلامی، نیشابور، ایران
تلفن: 42621905-051، دورنگار:  42615472-051، پست الکترونیکی: z_didar57@yahoo.com
 
[2]- Assistant Prof., Dept. of Food Sciences, Islamic Azad University, Neyshabur Branch, Neyshabur, Iran, ORCID: 0000-0001-6268-6376.
 (Corresponding Author): Tel: (051) 42621905, Fax: (051) 42615472, E-mail: z_didar57@yahoo.com
نوع مطالعه: پژوهشي | موضوع مقاله: ميكروبيولوژي
دریافت: 1397/8/2 | پذیرش: 1397/12/1 | انتشار: 1398/4/24

ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
CAPTCHA

ارسال پیام به نویسنده مسئول


بازنشر اطلاعات
Creative Commons License این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است.

کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق

© 2024 CC BY-NC 4.0 | Journal of Rafsanjan University of Medical Sciences

Designed & Developed by : Yektaweb