جلد 24، شماره 1 - ( 1-1404 )                   جلد 24 شماره 1 صفحات 46-19 | برگشت به فهرست نسخه ها

Ethics code: با توجه به ماهیت بیوانفورماتیکی مقاله ارسالی و قوانین

XML English Abstract Print

Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Ehsasatvatan M, Baghban Kohnehrouz B, Nejad Iran Nejad F. Immunoinformatics Design of a Multi-Epitope Vaccine Candidate via Poxin-Schlafen Protein of Monkeypox Virus. JRUMS 2025; 24 (1) :19-46
URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-7594-fa.html
احساسات وطن مریم، باغبان کهنه‌روز بهرام، نژاد ایران نژاد فدرا. طراحی ایمونوانفورماتیکی کاندید واکسن چند اپی‌توپی علیه ویروس آبله میمون از پروتئین پوکسین-شلافن. مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان. 1404; 24 (1) :19-46

URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-7594-fa.html

طراحی ایمونوانفورماتیکی کاندید واکسن چند اپی‌توپی علیه ویروس آبله میمون از پروتئین پوکسین-شلافن
مریم احساسات وطن ، بهرام باغبان کهنه‌روز ، فدرا نژاد ایران نژاد
دانشگاه تبریز
واژه‌های کلیدی: آبله میمون، ایمونوانفورماتیک، پوکسین-شلافن، کاندید واکسن
متن کامل [PDF 1383 kb]   (127 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (359 مشاهده)
متن کامل:   (158 مشاهده)
مقاله پژوهشی
مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان
دوره 23، فروردین 1404، 46-19

طراحی ایمونوانفورماتیکی کاندید واکسن چند اپی‌توپی علیه ویروس آبله میمون از پروتئین پوکسین-شلافن


مریم احساسات‌وطن[1]، بهرام باغبان کهنه‌روز[2]، فدرا نژاد ایران‌نژاد[3]





دریافت مقاله: 25/09/1403    ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 30/01/1403    دریافت اصلاحیه از نویسنده: 11/12/1403     پذیرش مقاله: 14/12/1403


چکیده
زمینه و هدف: ویروس آبله میمون، از خانواده Poxviridae، ویروسی با DNA دو رشته‌ای و عامل ایجاد آبله میمون در انسان است. ویروس‌های آبله یک نوکلئاز غیرمعمول به‌نام پوکسین دارند که دی‌نوکلئوتید حلقوی '3-'2-cGAMP به‌عنوان پیام‌رسان ثانویه مهم در مسیر سیگنال‌دهی cGAS-STING (Cyclic GMP-AMP Synthase-Stimulator of Interferon Genes) را می‌شکافد. با وجود داروها و واکسن‌های مختلف برای عفونت‌های ویروس‌های ارتوپاکس، شیوع آبله میمون نگرانی‌های جهانی را برانگیخته است. در مطالعه حاضر، پروتئین پوکسین-شلافن ویروس آبله میمون به‌عنوان هدف بالقوه برای ایجاد کاندید واکسن چند اپی‌توپی استفاده شد.
مواد و روش‌ها: این تحقیق به‌صورت تحلیل داده‌های بیوانفورماتیکی انجام شد. اپی‌توپ‌های انتخاب شده از نظر حساسیت‌زایی، غیرسمی بودن و ظرفیت تحریک پاسخ سلول‌های T و B ارزیابی شدند. پس از ارزیابی برهم‌کنش بین واکسن و گیرنده شبه‌تول-4 (Toll-like receptor-4; TLR-4) توسط Cluspro، مجموعه داکینگ با استفاده از شبیه‌سازی‌های دینامیک مولکولی و ایمنی تأیید شد.
یافته‌ها: کاندید واکسن طراحی‌شده بسیار آنتی‌ژنیک، غیرحساسیت‌زا، دارای خواص فیزیکوشیمیایی قابل قبول با قابلیت بیان به‌صورت محلول بود. ساختار سه‌بعدی واکسن و برهم‌کنش بالقوه آن با گیرنده TLR-4 تأیید شد. شبیه‌سازی دینامیک مولکولی پایداری مجموعه واکسن-TLR4 را تأیید کرد. طبق نتایج شبیه‌سازی ایمنی کاندید واکسن قادر به ایجاد پاسخ‌های ایمنی محافظتی در بدن انسان بود.
نتیجه‌گیری: در مطالعه حاضر، مؤثرترین اپی‌توپ‌ها از پروتئین پوکسین-شلافن ویروس آبله میمون انتخاب شدند. نتایج این مطالعه تأثیر بالقوه کاندید واکسن در تحریک پاسخ‌های ایمنی را نشان داد. مطالعه حاضر می‌تواند نقطه عطفی در توسعه واکسن بر‌علیه ویروس آبله میمون باشد. با این‌حال، مطالعات in vitro و in vivo بیشتری نیاز است.
واژه‌های کلیدی: آبله میمون، ایمونوانفورماتیک، پوکسین-شلافن، کاندید واکسن

ارجاع: احساسات‌وطن م، باغبان کهنه‌روز ب، ایران‌نژاد ف‌ن. طراحی ایمونوانفورماتیکی کاندید واکسن چند اپی‌توپی بر علیه ویروس آبله میمون از پروتئین پوکسین-شلافن. مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان، سال 1404، دوره 24 شماره 1، صفحات: 46-19.
.
 
مقدمه
ویروس آبله میمون (Monkeypox virus; MPXV) عامل ایجاد یک بیماری مشترک بین انسان و دام به نام آبله میمون (Mpox) است. این ویروس دارای DNA دو رشته‌ای (dsDNA) متعلق به جنس Orthopoxvirus (OPXV)، خانواده Poxviridae و زیرخانواده Chordopoxvirinae است (1). سایر اعضای این جنس عبارتند از ویروس Variola (VARV)، ویروس آبله گاوی (CPXV)، ویروس Vaccinia (VACV)، ویروس آبله شتر (CMLV)، ویروس Taterapox (TATV) و ویروس Ectromelia (ECTV). MPXV به کلاد I و II تقسیم می‌شود که کلاد II نیز به دو زیر دسته IIa و IIb طبقه‌بندی می‌شود (2). در پنج دهه اخیر، MPXV بومی غرب و مرکز آفریقا بوده (3) و انتقال ویروس به مناطق غیر بومی بسیار نادر بود (1). با این حال، از سال 2017 بروز Mpox در خارج از مناطق آندمیک افزایش یافته و مشخصات اپیدمیولوژیک این بیماری در مناطق آندمیک تغییر کرده است (4).
از اوایل سال 2022، چندین عفونت مرتبط با ویروس آبله میمون در انسان و در سراسر جهان گزارش شده و این ویروس را تبدیل به یک تهدید نوپدید برای جمعیت انسانی کرده است (5). ویروس آبله میمون می‌تواند از طریق ارتباط نزدیک با ضایعات پوستی، قطرات تنفسی بزرگ و احتمالاً از طریق فومیت‌های آلوده از فردی به فرد دیگر سرایت کند (6). در اکثر موارد، تب علامت اولیه بیماری است و اغلب با ظهور ضایعات پاپولوپوستولار، وزیکولوپوستولار و زخمی روی صورت و بدن، علاوه بر لنفادنوپاتی شدید همراه است (7). عوارض ناشی از این بیماری می‌تواند شامل عفونت‌های ثانویه، التهاب حاد نایژه، سپسیس، التهاب مغز و عفونت قرنیه همراه با کاهش بینایی باشد (8). سازمان بهداشت جهانی نرخ مرگ و میر ناشی از ویروس آّبله میمون را در سال‌های اخیر حدود 3 تا 6 درصد گزارش کرده است که این میزان گاهی به 11 درصد نیز رسیده است (5). در حال حاضر هیچ روش درمانی برای آبله میمون در انسان وجود ندارد. با این حال، دو دارو، برینسیدوفوویر و تکوویریمات، که هر دو به صورت خوراکی در دسترس هستند، توسط سازمان غذا و داروی آمریکا (U.S. Food and Drug Administration; USFDA) برای مدیریت آبله تأیید شده‌اند (10، 9). هیچ یک از داروها برای اثربخشی آن در آزمایشات بالینی انسانی آزمایش نشده‌اند. با این حال، مطالعات حیوانی برای هر دو دارو نشان داده است که آن­ها در برابر سایر ویروس‌های ارتوپاکس نیز مؤثر هستند. با توجه به میزان نسبی مرگ میر و عوارض ناشی از این ویروس، طراحی و تولید یک واکسن مؤثر بر علیه ویروس آبله میمون ضروری به نظر می‌رسد (4).
تولید واکسن با استفاده از روش‌های سنتی زمان‌بر و نسبتاً پر هزینه است (11). طراحی واکسن با بهره‌گیری از مطالعات محاسباتی می‌تواند برای تولید یک واکسن جدید بر علیه ویروس آبله میمون استفاده شود (12). استراتژی طراحی واکسن مبتنی بر اپی‌توپ به­طور غیرقابل انکاری وسوسه انگیز است، چرا که یک توالی کوچک اما مهم از نظر ایمنی، اغلب قادر به تحریک سیستم دفاعی در برابر یک بیماری مهم و پیچیده است. در طراحی واکسن‌های چند اپی‌توپی از اطلاعات ژنتیکی بر اساس داده‌های تجربی برای انتخاب مؤثرترین اپی‌توپ‌های آنتی‌ژن استفاده می‌شود (13). واکسن‌های چند اپی‌توپی می‌توانند منجر به محافظت در برابر انواع اهداف آنتی‌ژن، سویه‌ها و یا پاتوژن‌ها شوند (15، 14).
ویروس‌های آبله دارای یک آنزیم نوکلئاز نسبتاً غیرمعمول به نام پوکسین هستند که در ویروس‌های آبله پستانداران از جمله پاتوژن‌های انسانی ویروس آبله میمون و ویروس آبله گاوی حفظ شده است (17، 16). سوبسترای این آنزیم، ´2، ´3- گوانوزین مونوفسفات-آدنوزین مونوفسفات حلقوی (cGAMP) است. cGAMP یک دی‌نوکلئوتید حلقوی است که از واحدهای AMP و GMP تشکیل شده و از طریق پیوندهای ´5- ´3 و ´5- ´2 حلقوی می‌شود. پوکسین‌ها پیوند ´5- ´3 در cGAMP را می‌شکافند و به­طور مؤثر آن را از سیتوپلاسم حذف می‌کنند (18، 16). این عمل برای بقاء ویروس مهم است، زیرا cGAMP به عنوان پیام‌رسان ثانویه توسط cGAMP سنتاز تولید می‌شود، آنزیمی که در سیتوپلاسم قرار دارد و با حضور DNA فعال شده و بخشی از دفاع در برابر ویروس‌های DNA است که در سیتوپلاسم تکثیر می‌شوند (19). با فعال شدن cGAMP سنتاز، cGAMP تولید شده و به STING (محرک ژن‌های اینترفرون) متصل می‌شود و باعث ایجاد تغییر ساختاری و فعال کردن سیگنال‌های وابسته به STING می‌شود. این فرآیند اغلب به‌عنوان مسیر سیگنالینگ cGAS-STING شناخته می‌شود و پوکسین‌ها قادر هستند به طور مؤثر این مسیر را قطع ‌کنند (20). پوکسین گاهی اوقات به یک دمین شلافن در انتهای کربوکسیلی متصل می‌شود که همولوژی بالایی با شلافن انسانی داشته و توسط اینترفرون‌ها (Interferons; IFNs) تنظیم می‌شود (21). با این حال، عملکرد شلافن در اتصال با پوکسین هنوز معلوم نیست. بنابراین، هدف این تحقیق طراحی ایمونوانفورماتیکی یک کاندید واکسن جدید چند اپی‌توپی با استفاده از اپی‌توپ‌های بسیار ایمنی‌زا از پروتئین پوکسین-شلافن (B4R) است که قادر به ایجاد پاسخ ایمنی هومورال و سلولی علیه آبله میمون در انسان باشد. پروتئین پوکسین-شلافن با توجه به ویژگی‌های برتر ایمنی‌زایی برای پیش‌بینی مؤثرترین اپی‌توپ‌ها در نظر گرفته شد.
مواد و روش‌ها
این تحقیق به صورت تحلیل داده‌های بیوانفورماتیکی در سال 1403 در آزمایشگاه مهندسی ژنتیک دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز اجرا شد.
بازیابی توالی‌ پروتئین B4R سویه‌های شایع ‌و بررسی حفاظت شدگی توالی
توالی آمینواسیدی پروتئین B4R با شماره دسترسی Q8V4S4 از داده پایگاه UniProt در قالب FASTA بازیابی شد. برای طراحی یک واکسن مؤثر در برابر ویروس آبله میمون، حفاظت‌شدگی توالی آمینواسیدی پروتئین B4R در سویه‌های شایع ویروس آبله میمون با استفاده از ابزار Clustal Omega (22) بررسی شد.
پیش‌بینی اپی‌توپ‌های خطی سلول‌های B
از سرورهای BepiPred 3.0
(https://services.healthtech.dtu.dk/services/BepiPred-3.0/) (23)، ABCpred (http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/) (24) و ابزار پیش‌بینی دسترسی سطحی Emini از سرور IEDB برای پیش‌بینی اپی‌توپ‌های خطی سلول‌های B استفاده شد. در BepiPred 3.0 مقدار آستانه روی 15/0، اختصاصیت روی 57/0 و حساسیت روی 58/0 تنظیم شد. ABCpred اپی‌توپ‌ها را با استفاده از شبکه طبیعی و با دقت 93/65 درصد پیش‌بینی می‌کند. در این سرور، مقادیر نزدیک به یک با احتمال بالاتری اپی‌توپ خواهند بود. در روش Emini نیز مقدار آستانه بر روی 1 تنظیم شد. در نهایت، نواحی که توسط هر سه سرور به عنوان اپی‌توپ شناسایی شده بودند برای بررسی‌های بیشتر انتخاب شدند.
پیش‌بینی اپی‌توپ‌های سلول‌ T کشنده (Cytotoxic T lymphocyte; CTL)
از ابزار MHC I از سرور IEDB (http://tools.iedb.org/mhci/) و روش پیشنهاد شده توسط سرور (NetMHCpan 4.1 EL) (25) برای پیش‌بینی اپی‌توپ‌های سلول‌های T کشنده استفاده شد. پارامترهای پیش‌بینی شامل گونه منبع MHC، آلل‌های MHC (Major histocompatibility complex) و طول اپی‌توپ به‌ترتیب گونه انسان، مجموعه مرجع آلل HLA (Human leukocyte antigen) و 9 تا 10 اسیدآمینه انتخاب شد. پپتیدهای با صدک کمتر از 5/0 برای بررسی‌های بیشتر انتخاب شدند (26).
پیش‌بینی اپی‌توپ‌های سلول‌ T کمک کننده (Helper T lymphocyte; HTL)
از ابزار پیش‌بینی MHC-II سرور IEDB (http://tools.immuneepitope.org/mhcii/) (27) و سرور NetMHCIIPan نسخه 4 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetMHCIIpan/) (28) برای پیش‌بینی اپی‌توپ‌های سلول T کمک‌کننده استفاده شد. در سرور IEDB از روش پیشنهاد شده NetMHCIIPan 4.1 EL و پارامترهای پیش‌بینی گونه منبع MHC انسان، مجموعه مرجع 7 آلل HLA و طول اپی‌توپ 12 تا 18 اسیدآمینه استفاده شد. اپی‌توپ‌های با صدک پایین‌تر تمایل اتصال بالاتری دارند، بنابراین اپی‌توپ‌هایی با صدک کمتر از 1 برای بررسی‌های بیشتر انتخاب شدند.
بررسی آنتی‌ژنیسیته، ایمونوژنیسیته حساسیت‌زایی، سمیت و حفاظت شدگی اپی‌توپ‌های انتخاب شده
از سرور VaxiJen نسخه 0/2 (http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html) (29) برای پیش‌بینی آنتی‌ژنیسیته اپی‌توپ‌های انتخاب شده استفاده شد. مقدار آستانه در این سرور روی 4/0 تنظیم و اپی‌توپ‌هایی با امتیاز بالاتر از 4/0 برای بررسی‌های بیشتر انتخاب شدند. از سرور Class I Immunogenicity (http://tools.iedb.org/immunogeni_ city/)) (30) برای بررسی ایمونوژنیسیته اپی‌توپ‌های آنتی‌ژن سلول T کشنده استفاده شد. از سرور IFN-γ Epitope (webs.iiitd.edu.in/raghava/ifnepitope/index.php) و با روش ترکیبی Motif و SVM و مدل IFN-γ در برابر غیر IFN-γ برای پیش‌بینی توان القاء اینترفرون گاما توسط اپی‌توپ‌های آنتی‌ژن سلول‌های T کمک کننده استفاده شد. از سرورهای Allergen FP نسخه 1.0 (http://ddg-pharmfac.net/AllergenFP/) (31) و AllerTOP نسخه 2.0 (http://ddg-pharmfac.net/AllerTOP/) (32) برای بررسی عدم حساسیت‌زایی و از ToxinPred2 (webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred2/index.html) (33) برای بررسی عدم سمیت اپی‌توپ‌های انتخاب شده استفاده شد. حفاظت‌شدگی اپی‌توپ‌های انتخاب شده با استفاده از ابزار حفاظت اپی‌توپ از سرور IEDB (http://tools.immuneepitope.org /tools/conservancy/) بررسی شد. اپی‌توپ‌های با حفاظت‌شدگی 100 درصد انتخاب شدند.
واکنش متقابل با آنتی‌ژن‌های میزبان
پاسخ‌های ایمنی نامطلوب ممکن است به دلیل واکنش متقابل با آنتی‌ژن‌های میزبان ایجاد شود. در نتیجه، بررسی پپتیدهای انتخاب شده در مرحله اولیه برای شباهت با پروتئوم موش و انسان بسیار مهم است. برای انجام این کار، از ابزار BLASTp از سرور NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) (34) استفاده شد.
بررسی پوشش جمعیتی اپی‌توپ‌های انتخاب شده
ابزار پوشش جمعیت از سرور IEDB (http://tools.iedb.org/population/) (35) برای ارزیابی نرخ پوشش جمعیت برای اپی‌توپ‌های انتخاب شده CTL و HTL، همراه با آلل‌های HLA (Human leukocyte antigen) متناظر آن­ها مورد استفاده قرار گرفت. آنالیز بر روی کل جمعیت جهانی با حفظ پارامترهای پیش‌فرض انجام شد. ارزیابی برای هر دو کلاس I و II از آلل‌های HLA انجام شد.
طراحی سازه کاندید واکسن چند اپی‌توپی
یک واکسن کاندید چند اپی‌توپی با اتصال اپی‌توپ‌های خطی سلول‌های B، سلول‌های T کشنده و سلول‌های T کمک کننده پیش‌بینی شده از پروتئین B4R ویروس آبله میمون با استفاده از لینکرهای مختلف طراحی شد. از لینکر KK برای اتصال اپی‌توپ‌های سلول B استفاده شد، چرا که این لینکر منجر به تثبیت ساختار پروتئین شده و فعالیت ایمنی اپی‌توپ‌های واکسن را حفظ می‌کند (36, 37). از لینکرهای AAY و GPGPG با توجه به مزایای آن­ها در رابطه با طول توصیه شده، انعطاف‌پذیری و توانایی تسریع پردازش و ارائه ایمنی به ترتیب برای اتصال اپی‌توپ‌های CTL و HTL استفاده شد (38-40). علاوه بر این، توالی زیرواحد B سم وبا (CTB) با توالی آمینواسیدی TPQNITDLCAEYHNTQIYTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGAIFQVEVPGSQHIDSQK KAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMAN به دلیل توانایی آن برای بهبود ارائه آنتی‌ژن و پاسخ ایمنی به عنوان ادجوانت با استفاده از لینکر EAAAK به انتهای کربوکسیلی کاندید واکسن چند اپی‌توپی متصل شد. برای تسهیل تشخیص و خالص‌سازی پروتئین یک برچسب هیستیدینی شامل 6 اسیدآمینه در انتهای آمینی کاندید واکسن چند اپی‌توپی تعبیه شد (26).
پیش‌بینی آنتی‌ژنیسیته، حساسیت‌زایی، سمیت و حلالیت کاندید واکسن‌ چند اپی‌توپی
آنتی‌ژنیسیته کاندید واکسن چند اپی‌توپی با استفاده از VaxiJen نسخه 0/2 (با مقدار آستانه 5/0) و ANTIGENpro (http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) ارزیابی شد. ANTIGENpro آنتی‌ژنیسیته کل پروتئین را مستقل از پاتوژن، مبتنی بر توالی و بدون هم‌ردیفی پیش‌بینی می‌کند. از سرورهای Allergen FP نسخه 1.0 و AllerTOP نسخه 0/2 برای آنالیز حساسیت‌زایی کاندید واکسن استفاده شد. Allergen FP آلرژن‌ها را با دقت 88 درصد و AlllerTOP با دقت 3/85 درصد از غیرآلرژن‌ها تشخیص می‌دهد. سمیت کاندید واکسن چند اپی‌توپی با استفاده از سرور ToxinPred2 با مدل یادگیری ماشین Random Fores و بر اساس ترکیب اسیدهای آمینه و با مقدار آستانه 5/0 پیش‌بینی شد. در نهایت، حلالیت کاندید واکسن با استفاده از سرور Protein-Sol (https://protein-sol.manchester.ac.uk/) (41) پیش‌بینی شد. مقدار پیش‌بینی شده بیشتر از 45/0 نشان می‌دهد که بر اساس مجموعه داده‌های حلالیت تجربی، پروتئین کاندید حلالیت بهتری نسبت به میانگین پروتئین­های محلول E.coli دارد.
بررسی ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی و پیش‌بینی ساختار ثانویه کاندید واکسن
ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی واکسن چند اپی‌توپی شامل ترکیب اسیدهای آمینه، وزن مولکولی، ترکیب اتمی، نقطه ایزوالکتریک نظری (pI)، شاخص ناپایداری، شاخص آلیفاتیک، نیمه عمر تخمینی و میانگین کل هیدروپاتیک (GRAVY) با استفاده از ابزار Protparam از سرور Expasy (https://web.expasy.org/protparam/) (Gasteiger et al., 2005) پیش­بینی شد. سرورهای Prabi (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_gor4.html) (42) و PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) (43) برای پیش‌بینی ساختار ثانویه کاندید واکسن چند اپی‌توپی مورد استفاده قرار گرفتند.
پیش‌بینی، بهینه‌سازی و تعیین کیفیت ساختار سوم کاندید واکسن
AlphaFold2 (44) که یک روش یادگیری ماشین پیشرفته برای پیش‌بینی ساختار پروتئین است و تقریباً کل پروتئوم انسانی (5/98 درصد از پروتئین‌های انسانی) را در بر می‌گیرد برای پیش‌بینی مدل سه‌بعدی کاندید واکسن چند اپی‌توپی استفاده شد.
پس از آن، مدل پیش‌بینی‌شده با بالاترین رتبه انتخاب و با استفاده از سرور GalaxyRefine (https://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type=REFINE) (45) بهینه‌سازی شد. برای ارزیابی ساختاری مدل پیش‌بینی شده و آنالیزهای استریوشیمیایی نمودار راماچانداران از سرور Procheck (46) رسم و از ابزار ERRAT از سرور SAVES (47) نسخه 0/6 و سرور ProSA-Web (48) استفاده شد. نمودار راماچاندران یک نمایش بصری از توزیع باقی­مانده‌های اسیدهای آمینه در مناطق مطلوب، مجاز و دورتر ارائه می‌دهد و به عنوان یک ابزار ضروری برای اعتبارسنجی و ارزیابی کیفیت مدل‌های پیش‌بینی شده از پروتئین عمل می‌کند. در ساختار پیش‌بینی ‌شده، سرور ERRAT برهم‌کنش‌های غیر پیوندی بین انواع مختلف اتم را با مقایسه آن‌ها با ساختارهای بهینه شده ارزیابی می‌کند. امتیاز بالاتر در این سرور نشان دهنده یک مدل با کیفیت بالاتر است. علاوه بر این، ProSA Z-score با تخمین انرژی کل سازه از توزیع انرژی تولید شده از رونوشت‌های تصادفی ارزیابی کاملی از کیفیت کلی مدل ارائه می‌کند.
پیش‌بینی اپی‌توپ‌های ساختاری سلول B
اغلب اپی‌توپ‌های سلول B ماهیت ساختاری دارند و شامل 1 تا 5 بخش خطی از باقی‌مانده‌های اسید آمینه هستند. اپی‌توپ‌های ساختاری سلول B ناپیوسته بوده و در موقعیت‌های دور از هم و به صورت پراکنده در توالی پروتئین قرار دارند، که در صورت تاخوردگی صحیح پروتئین نزدیک هم قرار می‌گیرند. با این حال، این اپی‌توپ‌ها از نظر فضایی نزدیک به هم هستند و به عنوان مکان‌هایی برای واکنش با آنتی‌بادی عمل می‌کنند (49). اپی‌توپ‌های ساختاری سلول‌های B با استفاده از سرور ElliPro (http://tools.iedb.org/ellipro/) که یک ابزار پیش‌بینی اپی‌توپ‌های غیرخطی سلول B است و به طور گسترده برای پیش‌بینی اپی‌توپ‌های ناپیوسته مورد استفاده قرار می‌گیرد پیش‌بینی شد. این سرور دارای بالاترین سطح دقت برای محاسبه اپی‌توپ‌های سلول B برای هر پروتئین شناخته شده‌ای است. مدل‌هایی با امتیاز بیشتر از 5/0 به عنوان اپی‌توپ‌های ساختاری سلول B در نظر گرفته می‌شوند.
داکینگ مولکولی
پاسخ ایمنی مؤثر زمانی رخ می‌دهد که کاندید واکسن با میل ترکیبی بالا به سلول‌های ایمنی هدف متصل شود. بر این اساس، بهترین ساختار از کاندید واکسن طراحی شده به عنوان مولکول هدف‌گیر و TLR-4 (شماره دسترسی در داده پایگاه پروتئینی: 4G8A) به عنوان مولکول‌ هدف برای انجام آنالیز داکینگ مولکولی استفاده شدند. فرآیند داکینگ بین این پروتئین‌ها با استفاده از سرور ClusPro 2.0 (50) انجام گرفت. این سرور قادر به پیش‌بینی میان‌کنش‌های پروتئین-پروتئین می‌باشد. بهترین مدل از این سرور انتخاب و با استفاده از سرور GalaxyRefine بهینه‌سازی شد. از سرور PRODIGY (51) برای محاسبه انرژی آزاد اتصال (ΔG) در آنالیزهای داکینگ مولکولی استفاده شد. بهترین ساختار با منفی‌ترین انرژی اتصال و در نتیجه بیشترین تمایل برای اتصال به گیرنده توسط نرم‌افزار PyMOL تصویرسازی و اسیدهای آمینه درگیر در برهم­کنش بین پروتئینی از جمله پیوندهای هیدروژنی، پل‌های نمکی و اتصالات غیرپیوندی با استفاده از نرم‌افزار LigPlot نسخه 5/2/2 (52) مورد بررسی قرار گرفت و نمودار دو بعدی برهم‌کنش‌ها ترسیم گردید.
شبیه‌سازی دینامیک مولکولی
شبیه‌سازی دینامیک مولکولی برای داشتن درک جامعی از پویایی و پایداری مجموعه کاندید واکسن-گیرنده با استفاده از نرم‌افزار GROMACS (نسخه 2/2019) (53) و میدان نیروی CHARMM27 انجام شد. هر سیستم در یک جعبه تری‌کلینیک با فاصله 1 نانومتر از لبه جعبه در تمام جهات در محلول آبی با فرمت شارژ نقطه‌ای ساده (Simple Point Charge; SPC) قرار گرفت. بار کلی هر سیستم با استفاده از مقادیر مناسبی از یون‌های سدیم و کلر خنثی گردید. از الگوریتم Steepest Descent برای به حداقل رساندن انرژی در مراحل اولیه آماده‌سازی سیستم‌ها استفاده شد. شبیه‌سازی تحت شرایط مرزی و با حجم و فشار ثابت (NVT/NPT) برای هر سیستم به مدت 50 نانوثانیه در دمای 300 کلوین و فشار ثابت 1 بار انجام شد. پیکربندی سیستم‌ها در هر 2/0 ثانیه ذخیره‌سازی شد. برای اطمینان از صحت نتایج، سه شبیه‌سازی مستقل برای هر سیستم و هر کدام به مدت 50 نانوثانیه انجام شد. مسیرهای ذخیره شده در شبیه‌سازی برای آنالیزهای انحراف جذر میانگین مربعات (Root Mean Square Deviation; RMSD) برای کربن آلفا، جذر میانگین مربعات نوسانات (Root Mean Square Fluctuation; RMSF)، شعاع چرخش (Radius of Gyration; Rg)، سطح قابل دسترسی با حلال (Solvent Accessible Surface Area; SASA) و برهمکنش‌های پیوند هیدروژنی استفاده شد. نتایج حاصل از شبیه‌سازی توسط نرم‌افزار MS Excel مورد ارزیابی قرار گرفت (54).
شبیه‌سازی پاسخ ایمنی
ویژگی‌های ایمونوژنیک کاندید واکسن چند اپی‌توپی طراحی شده با استفاده از سرور C-ImmSim (http://150.146.2.1/CIMMSIM/index.php) شبیه‌سازی شد. این سرور یک مدل کامپیوتری مبتنی بر عامل است که از یک ماتریس امتیازدهی خاص موقعیت (Position-Specific Scoring Matrix; PSSM) برای پیش‌بینی اپی‌توپ‌های ایمنی و واکنش‌های ایمنی استفاده می‌کند و به طور هم­زمان سه جزء اصلی سیستم عملکردی پستانداران (تیموس، غدد لنفاوی و مغز استخوان) را شبیه‌سازی می‌نماید. برای انجام شبیه‌سازی ایمنی، پارامترهای حجم شبیه‌سازی و مراحل شبیه‌سازی به ترتیب بر روی 10 میکرولیتر و 1050 تنظیم شدند. 3 تزریق به فاصله‌ چهار هفته با 1000 مولکول واکسن بدون لیپوپلی‌ساکارید (LPS) انجام شد. بدین ترتیب، مراحل زمانی دنبال شده برای 3 تزریق 1، 84، 168 تعیین شد که هر مرحله‌ برابر با 8 ساعت است.
نتایج
بازیابی و همردیفی توالی آمینواسیدی پروتئین B4R
توالی آمینواسیدی پروتئین B4R از سویه‌های شایع ویروس آبله میمون با شماره دسترسی Q8V4S4 از داده پایگاه UniProt بازیابی شد. هم­ردیفی توالی‌ آن پروتئین B4R از سویه‌های شایع ویروس آبله میمون برای تعیین نواحی حفاظت شده با استفاده از ابزار Clustal Omega انجام شد. بر اساس نتایج همردیفی و با توجه به تشابه بیش از 97 درصدی توالی‌های هم­ردیف شده، نواحی حفاظت شده پروتئین B4R در سویه‌های شایع ویروس آبله میمون برای پیش‌بینی و انتخاب اپی‌توپ‌های آنتی‌ژنیک برای طراحی واکسن چند اپی‌توپی بر علیه ویروس آبله میمون انتخاب شدند.
پیش‌بینی اپی‌توپ‌های خطی سلول‌های B
اپی‌توپ‌های خطی سلول‌های B با استفاده از سرورهای BepiPred، ABCpred و ابزار پیش‌بینی دسترسی سطحی Emini از سرور IEDB پیش‌بینی شدند. آنتی‌ژنیسیته اپی‌توپ‌ها با استفاده از سرور VaxiJen نسخه 0/2 بررسی شده و اپی‌توپ‌هایی با امتیاز بیشتر از 4/0 به عنوان اپی‌توپ‌های آنتی‌ژنیک انتخاب شدند. پس از بررسی حفاظت شدگی، عدم حساسیت‌زایی و عدم سمیت، تعداد 6 اپی‌توپ خطی سلول‌ B از پروتئین B4R ویروس آبله میمون انتخاب شدند (جدول 1). اپی‌توپ‌های انتخاب شده واکنش متقابل با آنتی‌ژن‌های انسان و موش نداشتند.
 
جدول 1- اپی‌توپ‌های خطی سلول‌های B
نیمه‌عمر GRAVY حفاظت‌شدگی حساسیت‌زایی سمیت آنتی‌ژنیسیته توالی
بیش از 10 ساعت 675/0- 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن QMDSMEALEYLSELKE
2 دقیقه 044/1- 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن YSTIKEKAKEMNALKP
بیش از 10 ساعت 925/0- 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن EYLQIGDPIHDLEGNQ
بیش از 10 ساعت 556/0- 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن HVLETGNAVYGKVQHE
بیش از 10 ساعت 606/0- 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن GESVKFGNSINVKHTS
3 دقیقه 571/1- 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن KVQHEYSTIKEKAKEMN

 
پیش‌بینی اپی‌توپ‌های سلول‌های T کشنده
با استفاده از ابزار MHC-I از سرور IEDB اپی‌توپ‌های متصل شونده به آلل‌های کلاس یک MHC پیش‌بینی شدند. آنتی‌ژنیسیته و ایمونوژنیسیته اپی‌توپ‌های پیش‌بینی شده به ترتیب با VaxiJen نسخه 0/2 و Class I Immunogenicity بررسی شده و اپی‌توپ‌هایی با امتیاز بیشتر از 4/0 در VaxiJen و بالاتر از صفر برای Class I Immunogenicity برای بررسی‌های بیشتر انتخاب شدند. در نهایت تعداد 14 اپی‌توپ آنتی‌ژنیک، ایمونوژن، غیر سمی، غیر حساسیت‌زا و با حفاظت شدگی 100 درصد به عنوان اپی‌توپ‌های سلول‌های T کشنده انتخاب شدند (جدول 2).
 
جدول 2- اپی‌توپ‌های انتخاب شده سلول‌های T کشنده
نیمه‌عمر GRAVY ایمنی‌زایی حفاظت‌شدگی حساسیت‌زایی سمیت آنتی‌ژنیسیته توالی
بیش از 10 ساعت 856/0- 09819/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن ETGNAVYGK
بیش از 10 ساعت 122/0- 07579/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن NQISIVTYR
3 دقیقه 71/1- 08822/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن KPGDETTSTY
بیش از 10 ساعت 122/0- 0757/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن NQISIVTYR
3 دقیقه 71/1- 08822/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن KPGDETTSTY
3 دقیقه 71/1- 08822/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن KPGDETTSTY
بیش از 10 ساعت 122/0- 07579/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن NQISIVTYR
بیش از 10 ساعت 133/0- 18164/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن ISIVTYRHK
3 دقیقه 71/1- 08822/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن KPGDETTSTY
بیش از 10 ساعت 144/0- 15375/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن DSMEALEYL
30 دقیقه 15/0- 13428/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن GNQISIVTYR
3 دقیقه 71/1- 08822/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن KPGDETTSTY
بیش از 10 ساعت 33/0- 19942/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن QVTTVDVHGK
بیش از 10 ساعت 111/0- 28546/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن NSGGGTIEV
 


پیش‌بینی اپی‌توپ‌های سلول‌های T کمک کننده
اپی‌توپ‌های متصل شونده به آلل‌های کلاس دو MHC با استفاده از از ابزار MHC-II از سرور IEDB و سرور NetMHCIIPan نسخه 0/4 پیش‌بینی شدند. اپی‌توپ‌های با امتیاز بیشتر از 4/0 در VaxiJen نسخه 0/2 به عنوان اپی‌توپ‌های آنتی‌ژن انتخاب شده و برای توان القاء اینترفرون گاما بررسی شدند. اپی‌توپ‌های با امتیاز مثبت در IFN-γ برای بررسی‌های بیشتر انتخاب شدند. در نهایت تعداد 13 اپی‌توپ آنتی‌ژن، غیر سمی، غیر حساسیت‌زا و با حفاظت‌شدگی 100 درصد به عنوان اپی‌توپ‌های سلول‌های T کمک‌کننده انتخاب شدند (جدول 3).
 
جدول 3- اپی‌توپ‌های انتخاب شده سلول‌های T کمک کننده
نیمه‌عمر GRAVY ایمنی‌زایی حفاظت‌شدگی حساسیت‌زایی سمیت آنتی‌ژنیسیته توالی
بیش از 10 ساعت 027/0- 127615/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن AFPGISSTVANDVRK
بیش از 10 ساعت 020/0- 06893/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن HAFPGISSTVANDVR
2 دقیقه 773/0- 142281/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن RKYSVVSVYNKKYNI
بیش از 10 ساعت 067/1- 09538/0 100% غیرحسایت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن SVYNKKYNIVKNKYM
بیش از 10 ساعت 913/0- 25193/0 100% غیرحسایت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن VSVYNKKYNIVKNKY
بیش از 10 ساعت 547/0- 19969/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن VVSVYNKKYNIVKNK
بیش از 10 ساعت 067/1- 09535/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن SVYNKKYNIVKNKYM
3 دقیقه 193/0- 01168/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن KYSVVSVYNKKYNIV
3 دقیقه 193/0- 01168/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن KYSVVSVYNKKYNIV
بیش از 10 ساعت 34/0- 07693/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن SVVSVYNKKYNIVKN
2 دقیقه 773/0- 14228/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن RKYSVVSVYNKKYNI
بیش از 10 ساعت 98/0- 19794/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن GNQISIVTYRHKNYY
بیش از 10 ساعت 027/0- 12761/0 100% غیرحساسیت‌زا غیرسمی آنتی‌ژن AFPGISSTVANDVRK
 
پیش‌بینی پوشش جمعیتی کاندید واکسن طراحی شده
ارزیابی پوشش جمعیت جهانی اپی‌توپ‌های انتخابی CTL و HTL و ارزیابی هم­زمان آلل‌های HLA متناظر آن‌ها در میان قومیت‌ها و مناطق جغرافیایی مختلف، پوشش 74/99% درصدی را برای مجموع دو کلاس و با میانگین 49/4 نشان داد (شکل 1). این یافته‌ها نشان می‌دهد که کاندید واکسن چند اپی‌توپی طراحی شده در این تحقیق پتانسیل تشخیص و کاربرد گسترده را داشته و تعداد قابل توجهی از افراد را در سراسر جهان شامل می‌شود.
 


شکل 1- پوشش جمعیت جهانی برای مجموع آلل‌های MHC-I و MHC-II. ستون‌ها نشان دهنده پوشش جمعیت برای هر اپی‌توپ بوده و درصد تجمعی پوشش جمعیت با نمودار خطی (-o-) نشان داده شده است.
 
طراحی سازه واکسن چند اپی‌توپی
اپی‌توپ‌های انتخاب شده از اپی‌توپ‌های خطی سلول B، CTL و HTL از پروتئین B4R ویروس آبله میمون به ترتیب با استفاده از لینکرهای KK، AAY و GPGPG برای ساخت یک واکسن کاندید چند اپی‌توپی به هم متصل شدند. هم­چنین، از لینکر EAAKK برای اتصال ادجوانت به انتهای کربوکسیلی استفاده شد. برچسب هیستیدینی به منظور تسهیل تشخیص و خالص‌سازی پروتئین در انتهای آمینی توالی واکسن تعبیه شد. توالی آمینواسیدی و استراتژی ساخت واکسن کاندید چند اپی‌توپی بر علیه آبله میمون در شکل 2 نشان داده شده است.
 


شکل 2- A) توالی آمینواسیدی و B) آرایش کلاس‌های اپی‌توپی در کاندید واکسن بر علیه ویروس آبله میمون با استفاده از پروتئین B4R
 
آنتی‌ژنیسیته، حساسیت‌زایی و سمیت کاندید واکسن چند اپی‌توپی
ابزارهای مختلفی برای ارزیابی آنتی‌ژنیسیته و حساسیت‌زایی واکسن چند اپی‌توپی طراحی شده به کار گرفته شد. با توجه به نتایج VaxiJen و ANTIGENpro، امتیاز آنتی‌ژنیسیته واکسن چند اپی‌توپی طراحی شده به ترتیب 5986/0 و 6981/0 بود. علاوه بر این، Allergen FP و AllerTop نشان دادند که کاندید واکسن غیر حساسیت‌زا بود. هم­چنین، نتایج ToxinPred2 عدم سمیت کاندید واکسن را نشان داد (جدول 4). این یافته‌ها نشان می‌دهند که واکسن چند اپی‌توپی طراحی شده در این تحقیق می‌تواند گزینه امیدوارکننده‌ای برای واکسیناسیون علیه عفونت‌های ویروس آبله میمون باشد.
خواص فیزیکوشیمیایی و پیش‌بینی ساختار ثانویه کاندید واکسن چند اپی‌توپی
کاندید واکسن چند اپی‌توپی طراحی شده شامل 197 اسید آمینه با وزن مولکولی 42/22 کیلو دالتون و نقطه ایزوالکتریک 30/9 بود. امتیاز GRAVY برای کاندید واکسن طراحی شده 608/0-، شاخص ناپایداری 67/28 و شاخص آلیفاتیک 22/81 بود. نیمه عمر کاندید واکسن 5/3 ساعت در رتیکولوسیت‌های انسانی (در شرایط آزمایشگاهی)، 10 دقیقه در مخمر، و بیش از 10 ساعت در E.coli (در شرایط آزمایشگاهی) پیش‌بینی شد (جدول 4). حلالیت کاندید واکسن چند اپی‌توپی 606/0 بود که نشان می‌دهد واکسن می‌تواند به صورت محلول بیان شود (شکل 3، A) ساختار ثانویه پیش‌بینی شده با استفاده از سرورهای Prabi و PSIPRED نشان داد که کاندید واکسن طراحی شده شامل 50/33% مارپیچ آلفا، 89/25% رشته‌های توسعه یافته، و 61/40% کویل‌های تصادفی است (شکل 3، B).
 
جدول 4- ویژگی‌های پیش‌بینی شده برای واکسن چند اپی‌توپی طراحی شده
آنتی‌ژنیسیته حساسیت‌زایی سمیت حلالیت GRAVY تعداد اسیدهای آمینه وزن مولکولی (Da) نقطه ایزوالکتریک شاخص آلیفاتیک نیمه عمر
a5986/0
b6981/0		 غیر حساسیت‌زا غیر-سمی 606/0 608/0- 197 54/22422 3/9 22/81 5/3 ساعتc
10 دقیقه d
<10 ساعتe
a آنتی ژنیسیته پیش‌بینی شده با VaxiJen                        b آنتی ژنیسیته پیش‌بینی شده با ANTIGENpro
c رتیکولوسیت پستانداران (در شرایط آزمایشگاهی)          d مخمر (در شرایط آزمایشگاهی)
e اشرشیا کولی (در شرایط آزمایشگاهی)

شکل 3- A) حلالیت پیش‌بینی شده توسط سرور Protein-Sol برای کاندید واکسن چند اپی‌توپی طراحی شده، B) ساختار ثانویه پیش‌بینی شده از کاندید واکسن چند اپی‌توپی طراحی شده.
 
پیش‌بینی، بهینه‌سازی و اعتبارسنجی ساختار سه بعدی کاندید واکسن چند اپی‌توپی
ساختار سه بعدی کاندید واکسن چند اپی‌توپی با استفاده از سرور AlphaFold2 پیش‌بینی شد. از بین پنج مدل تولید شده در این سرور، مدل برتر برای بهینه‌سازی بیشتر انتخاب شد. از سرور GalaxyRefine برای بهبود نتایج پیش‌بینی، اصلاح لوپ‌ها و به حداقل رساندن انرژی مدل استفاده شد. پارامترهای کلیدی از جمله امتیاز RMSD، GDT-HA و MolProbity در پنج مدل حاصل ارزیابی شد. مقادیر بیشتر GDT-HA نشان دهنده ساختارهای دقیق‌تر و مقادیر کمتر MolProbity مربوط به مدل‌های با کیفیت بهتر است. بنابراین، مدلی با بالاترین مقدار GDT-HA و کمترین امتیاز MolProbity و RMSD در بین پنج مدل بهینه شده برای بررسی‌های بیشتر انتخاب شد (شکل 4، A).
از سرورهای PROCHECK، ERRAT و ProSA برای ارزیابی و تأیید کیفیت و خطاهای احتمالی مدل سه بعدی بهینه شده استفاده شد. امتیاز Z برای کاندید واکسن چند اپی‌توپی 64/4- (شکل 4، B) و ضریب کیفیت کلی ERRAT 16/97 پیش‌بینی شد. پلات راماچاندران نشان داد که 5/95% از باقی‌مانده‌ها در مناطق مطلوب، 9/3% در مناطق مجاز و 6/0% در مناطق غیرمجاز قرار دارند (شکل 4، C). نتایج تأیید کننده کیفیت کلی ساختار سه بعدی پیش‌بینی شده برای کاندید واکسن چند اپی‌توپی طراحی شده با استفاده از پروتئین B4R بر علیه ویروس آبله میمون بود.
 

شکل 4- پیش‌بینی و اعتبار سنجی ساختار سوم کاندید واکسن چند اپی‌توپی A) ساختار مدل سه بعدی کاندید واکسن که با استفاده از AlphaFold2 پیش‌بینی و با استفاده از GalaxyRefine بهینه‌سازی شده است. B) نمودار امتیاز Z پیش‌بینی شده توسط سرور ProSA. C) پلات راماچاندران کاندید واکسن چند اپی‌توپی، نواحی مختلف در پلات به صورت زیر مشخص شده‌اند: [A، B، L]: باقی‌مانده‌ها در نواحی مطلوب، [a، b، l، p]: باقی‌مانده‌ها در نواحی مجاز، [a~، ~b، l~، ~p]: باقی‌مانده‌ها در نواحی کمتر مجاز. نواحی سفیدرنگ شامل نواحی غیر مجاز می‌باشند. باقی‌مانده‌ گلایسین به شکل مثلث نشان داده شده‌ است.
 
اپی‌توپ‌های ساختاری سلول B مستقر در کاندید واکسن چند اپی‌توپی طراحی شده
با توجه به نتایج سرور ElliPro، 64 باقی­مانده از کاندید واکسن چند اپی‌توپی طراحی شده با امتیاز 98/0 تا 644/0 در 6 اپی‌توپ ساختاری سلول B توزیع شده‌اند (شکل 5). اندازه اپی‌توپ‌ها از 3 تا 31 باقی‌مانده اسید آمینه متفاوت بود. جزئیات اپی‌توپ‌های ساختاری برای کاندید واکسن چند اپی‌توپی، همراه با امتیازات مربوط به آنها، در جدول 5 ارائه شده است.
 


شکل 5- نمایش گرافیکی اپی‌توپ‌های ناپیوسته سلول B در مدل سه بعدی واکسن چند اپی‌توپی. ساختار واکسن و اپی‌توپ‌های ناپیوسته سلول B به ترتیب به رنگ خاکستری و زرد نشان داده شده‌اند.

جدول5- اپی‌توپ‌های ساختاری سلول‌های B پیش‌بینی شده توسط سرور ElliPro
#
اپی‌توپ ساختاری سلول B
تعداد باقی‌مانده‌ها
امتیاز
1
A:H1, A:H2, A:H4
3
98/0
2
A:V48, A:T49, A:Y50, A:R51, A:H52, A:K53, A:K54, A:K55, A:H56, A:V57, A:L58, A:E59, A:T60, A:G61
14
764/0
3
A:H107, A:N108, A:Q110, A:N183, A:N184
5
737/0
4
A:G22, A:P23, A:G24, A:P25, A:G26, A:V27, A:N32, A:K33, A:K34, A:Y35, A:N36, A:I37, A:V38, A:I82, A:H83, A:D84, A:L85, A:E86, A:G87, A:N88, A:Q89, A:E90, A:A91, A:A92, A:A93, A:T95
26
72/0
5 A:N115, A:D116, A:K117, A:F119, A:S120, A:T122, A:E123, A:S124, A:L125, A:A126, A:G127, A:K128, A:R129, A:T135, A:K137, A:N138, A:G139, A:A140, A:I141, A:P147, A:G148, A:S149, A:Q150, A:H151, A:I152, A:T172, A:E173, A:A174, A:K185, A:T186, A:P187
31
683/0
6
A:K39, A:N40, A:K41, A:A42, A:A43, A:V68, A:Q69, A:H70, A:K72, A:E74
10
644/0
 
داکینگ مولکولی بین کاندید واکسن چند اپی‌توپی و TLR-4
برهم­کنش‌های آنتی‌ژن-گیرنده ایمنی برای انتقال مولکول‌های آنتی‌ژن و فعال شدن سیستم ایمنی حیاتی است. داکینگ مولکولی با استفاده از سرور ClusPro نسخه 0/2 برای ارزیابی انرژی اتصال و برهم­کنش‌های مولکولی بین گیرنده‌ ایمنی TLR-4 و کاندید واکسن چند اپی‌توپی طراحی شده انجام شد. از بین 30 حالت پیش‌بینی‌شده، بهترین مجموعه گیرنده-واکسن که نشان‌دهنده اتصال کارآمد سازه‌ واکسن در دمین اتصال گیرنده بود انتخاب شد. برهم­کنش‌های مولکولی قوی، از جمله پیوندهای هیدروژنی، پل‌های نمکی، و برهم­کنش‌های غیر پیوندی برای این مجموعه مشاهده شد. بین کاندید واکسن و TLR-4، 15 پیوند هیدروژنی، 7 پل نمکی و 206 برهم­کنش غیرپیوندی مشاهده شد (شکل 6).  
 


شکل 6- داکینگ مولکولی بین کاندید واکسن چند اپی‌توپی و گیرنده TLR-4 با استفاده از ClusPro 2.0 و نمایش برهم­کنش‌ها در مجموعه با استفاده از LigPlot. کاندید واکسن چند اپی‌توپی با رنگ آبی روشن و TLR-4 با رنگ صورتی روشن نشان داده شده‌اند.
 
برای تأیید میل اتصال کاندید واکسن چند اپی‌توپی به TLR-4، مقادیر انرژی آزاد گیبس (ΔG) و ثابت تفکیک (KD) از سرور PRODIGY به دست آمد. نتایج نشان داد که کاندید واکسن با میل اتصال بالایی به TLR-4 (kcal.mol-1 8/19- = ΔG و 15-10 ×9/3 =KD) متصل می‌شود. میل ترکیبی بالای کاندید واکسن به TLR-4 را می‌توان به تعداد بالای پیوندهای هیدروژنی و پل‌های نمکی آن نسبت داد. آنالیز داکینگ مولکولی اتصال موفقیت‌آمیز و میل ترکیبی قابل توجهی را بین ساختار واکسن پیشنهادی و گیرنده‌ ایمنی نشان داد.
شبیه‌سازی دینامیک مولکولی
برای بررسی پایداری مجموعه کاندید واکسن-TLR4 شبیه‌سازی دینامیک مولکولی انجام شد. سه شبیه‌سازی مستقل برای این مجموعه و هر کدام به مدت 50 نانوثانیه، با استفاده از GROMACS نسخه 2019.2 انجام شد. انحراف جذر میانگین مربعات (RMSD) یکی از پارامترهای مهم در مطالعات دینامیک مولکولی به منظور اطمینان از به تعادل رسیدن سیستم در طول شبیه‌سازی است و میزان انحراف موقعیت ذرات نسبت به موقعیت اولیه را در هر نقطه از زمان نشان می‌دهد. مقادیر پائین RMSD نشان دهنده پایداری سیستم در طول شبیه‌سازی است.
شکل 7، A نمودار RMSD را برای مجموعه کاندید واکسن-TLR4 نشان می‌دهد. نمودار RMSD برای این مجموعه بعد از حدود 5 نانوثانیه به تعادل رسیده و این تعادل در ادامه شبیه‌سازی حفظ شده است. این نمودار نشان داد که مجموعه کاندید
واکسن-TLR4 با میانگین مقادیر RMSD 38/0 نانومتر مجموعه پایداری تشکیل می‌دهد. جذر میانگین مربعات نوسانات (RMSF)، میزان تحرک و انعطاف‌پذیری باقی‌مانده‌های آمینواسیدها در طول زمان شبیه‌سازی را نشان می‌دهد، به طوریکه مقادیر بالای RMSF نشان‌دهنده انعطاف‌پذیری بالای باقی­مانده‌های اسیدهای آمینه است. نمودار RMSF در 50 نانوثانیه شبیه‌سازی دینامیک مولکولی در شکل 7، B نشان داده شده است. نمودار نشان می‌دهد که مجموعه کاندید واکسن-TLR4 با میانیگن RMSF 57/1 آنگستروم نوسانات کمی داشته و مجموعه پایداری تشکیل می‌دهد. شعاع چرخش (Rg) منعکس کننده فشردگی ساختار پروتئین است.
برای تشخیص فشردگی ساختار کلی، نمودار شعاع چرخش پروتئین محاسبه و در شکل 7، C نشان داده شده است. میانگین Rg برای مجموعه کاندید واکسن-TLR4 09/3 نانومتر برآورد شد. مشابه با نتایج RMSD، نمودار Rg این مجموعه‌ در طول شبیه‌سازی پایدار باقی ماند، که نشان‌دهنده فشردگی خوب ساختار سوم این مجموعه است. علاوه بر این، مساحت سطح قابل دسترس حلال (SASA)، به عنوان یک پارامتر ضروری برای توصیف آب­گریزی پروتئین، برای این مجموعه ارزیابی شد. میانگین SASA برای مجموعه واکسن-TLR4 31/371 نانومتر مربع برآورد شد. نمودار SASA روند اندکی کاهشی داشت که نشان می‌دهد در طول شبیه‌سازی هسته آب­گریز کمتر در معرض حلال قرار گرفته که منجر به افزایش پایداری پروتئین می‌شود (شکل 7، D). میانگین تعداد پیوندهای هیدروژنی در هر فریم در طول زمان برای تعیین تعداد پیوندهای هیدروژنی تشکیل شده یا شکسته شده در طول شبیه‌سازی مولکولی آنالیز شد. الگوی تعداد پیوندهای هیدروژنی تشکیل شده در این سیستم نشان داد که نعداد پیوندهای تشکیل یا شکسته شده در طول 50 نانوثانیه شبیه‌سازی دینامیک مولکولی ثابت باقی مانده است که نشان‌دهنده پایداری ساختارهای مولکولی است (شکل 7، E). با بررسی انرژی اتصال مجموعه داکینگ بعد از شبیه‌سازی مولکولی توسط سرور PRODIGY مشخص شد که حتی پس از شبیه‌سازی دینامیک مولکولی نیز کاندید واکسن طراحی شده با TLR-4 با میل اتصال بالا (kcal mol-1 4/19-) برهم­کنش می‌کند.
 




شکل 7- شبیه‌سازی دینامیک مولکولی مجموعه واکسن-TLR4 در مدت زمان 50 نانوثانیه. A) نمودار RMSD، B) نمودار RMSF، C) نمودار Rg، D) نمودار SASA و E) نمودار پیوندهای هیدروژنی.
 
شبیه‌سازی پاسخ‌های ایمنی القا شده توسط کاندید واکسن چند اپی‌توپی
شبیه‌سازی ایمنی توسط سرور C-ImmSim انجام شد. پس از سه تزریق کاندید واکسن طراحی شده، افزایش فعالیت ایمونوگلوبولین­ها، از جمله آنتی‌بادی‌های IgM، IgM+IgG، IgG1+IgG2، و IgG1 و هم­چنین کاهش سطح‌ آنتی‌ژن مشاهده شد. نکته قابل توجه این­که دوز اولیه منجر به افزایش سطح آنتی‌بادی نشد، در حالی­که دو دوز بعدی منجر به افزایش سطح آنتی‌بادی شدند (شکل 8، A). علاوه بر این، پس از هر تزریق، سطح سیتوکین‌ها از جمله اینترفرون گاما (IFN-γ)، اینترلوکین-2 (IL-2)، اینترلوکین-10 (IL-10) و فاکتور رشد تغییردهنده بتا (TGF-β) افزایش یافت. پس از دو تزریق اول، سطوح IFN-γ، TGF-β و IL-10 افزایش یافت اما پس از تزریق سوم کاهش یافت (شکل 8، B). پس از هر تزریق، تعداد کل سلول‌های B و هم­چنین ایزوتیپ‌های IgM و IgG1 سلول B افزایش یافت. علاوه بر این، تعداد سلول‌های حافظه B و جمعیت سلول‌های B فعال با هر تزریق افزایش یافت که نشان دهنده امکان تشکیل حافظه قابل‌توجه است (شکل 8، C-D). روند مشابهی برای سلول‌های T کمک کننده و کشنده مشاهده شد. پس از هر تزریق، جمعیت HTL و CTL فعال و همچنین HTL در حال استراحت و تکثیر افزایش یافت و پس از تزریق سوم کمی کاهش یافت. با این حال، جمعیت CTL در حال استراحت پس از اولین تزریق کاهش یافت و پس از تزریق سوم افزایش یافت (شکل 8، E-F). به طور کلی، شبیه‌سازی ایمنی نشان داد که تزریق‌های کاندید واکسن چند اپی‌توپی طراحی شده باعث ایجاد پاسخ ایمنی قوی می‌شود.
 

شکل 8- شبیه‌سازی پاسخ ایمنی در برابر کاندید واکسن طراحی شده با استفاده از سرور C-ImmSim. A) تولید ایمونوگلوبولین در پاسخ به ایمن‌سازی با کاندید واکسن چند اپی‌توپی طراحی شده. زیر کلاس‌ها با رنگ‌های مختلف نشان داده شده‌اند B) سطوح سیتوکین‌ها: نمودار اصلی سطوح سیتوکین را پس از تزریق کاندید واکسن چند اپی‌توپی نشان می‌دهد. نمودار داخلی سطوح فاکتور رشد گلبول سفید IL-2 و سیگنال فعال‌سازی کلی ماکروفاژ D را نشان می‌دهد. C) تکامل جمعیت سلول‌های B پس از سه دوره واکسیناسیون با کاندید واکسن چند اپی‌توپی. D) تولید سلول‌های B پس از تزریق. سلول‌های B فعال (بنفش) بالاترین سطح ترشح را در مقایسه با سایر زیرگروه‌های سلول B نشان دادند. E) تولید سلول‌های T کمک کننده CD4 در پاسخ به قرار گرفتن در معرض آنتی‌ژن، از جمله سلول‌های T کمک کننده فعال، تکثیر شونده، در حال استراحت و آنرژیک. F) تولید سلول‌های T کشنده. "وضعیت آنرژیک" نشان دهنده تحمل سلول‌های T به آنتی‌ژن‌ها به دلیل قرار گرفتن در معرض مکرر است.
 
بحث
اخیراً شیوع ویروس آبله میمون در بسیاری از کشورها بدون هیچ‌گونه ارتباط اپیدمیولوژیک شناسایی شده‌ای، رخ داده است. طبق گزارش سازمان بهداشت جهانی، تقریباً 3 تا 5 درصد موارد آبله میمون منجر به مرگ و میر می‌شود (55). با این وجود، در حال حاضر هیچ درمان قابل اعتمادی برای آبله میمون وجود ندارد. اخیراً FDA واکسن JYNNEOS را برای پیش‌گیری از آبله میمون تأیید کرده است که نرخ اثربخشی 85 درصدی را ارائه می‌دهد و به دلیل رابطه ژنتیکی نزدیک بین ویروس آبله میمون و آبله، درجه قابل توجهی از محافظت در برابر آبله میمون را نیز فراهم می‌کند (56). با این حال، پاسخ‌های آنتاگونیستی مربوط به JYNNEOS شامل واکنش‌های محل انفوزیون از جمله خارش، تورم، درد، سفتی و قرمزی می‌باشد. هم­چنین برخی از عوارض جانبی سیستمیک شامل سردرد، حالت تهوع، درد عضلانی، خستگی، لرز و میالژی نیز در ارتباط با این واکسن مطرح شده است. پاسخ‌های آنتاگونیستی واقعی در 05/0 درصد از افراد دریافت کننده JYNNEOS مشاهده شده است که شامل سارکوئیدوز، سفتی گلو، بیماری کرون و فلج عضلانی خارج چشمی می‌باشد (57).
ST-246 نیز یک ترکیب ضد ویروس آبله بسیار قوی است و تکثیر ویروس‌های آبله را در غلظت‌های نانومولار مهار می‌کند. از عوارض تزریق ST 246، ایجاد ضایعات و کاهش وزن می‌باشد (58). با این حال، تولید واکسنی که به طور خاص MPXV را هدف قرار دهد ضروری است. در این راستا، مناطق اپی‌توپی کوچکی که پتانسیل بالایی برای محافظت در برابر مقدار بیش از حد بار آنتی‌ژن و واکنش‌های آلرژیک دارند، می‌توانند به عنوان کاندید واکسن به جای ویروس‌ها یا پروتئین‌های کامل استفاده شوند. این توالی‌های اپی‌توپی همچنین توانایی قابل‌توجهی در تحریک پاسخ‌های ایمنی هومورال و سلولی دارند. واکسن‌شناسی معکوس یک رویکرد امیدوارکننده برای توسعه سریع واکسن‌های مبتنی بر پپتید است. این رویکرد شامل استفاده از اپی‌توپ‌های ایمنی پیش‌بینی ‌شده برای تسریع توسعه و دست­یابی به واکسن مقرون به صرفه، افزایش دقت و اطمینان از ایمنی واکسن است. این روش در سال‌های اخیر به دلیل پتانسیل بالا برای غلبه بر محدودیت‌های فرآیندهای سنتی تولید واکسن مورد توجه قرار گرفته است و به طور گسترده برای طراحی واکسن‌های جدید علیه پاتوژن‌های مختلف مانند Mycobacterium Tuberculosis (59)، Listeria monocytogenes (60)، سالمونلا (61)، ویروس آنفولانزای A (62)، SARS-CoV-2 (63, 64) و ویروس پاپیلومای انسانی (26) استفاده شده است.
در مطالعه حاضر، یک واکسن جدید مبتنی بر پپتید با استفاده از تکنیک ایمونو انفورماتیک طراحی شده است. به جای استفاده از ژنوم کامل یا یک پروتئین کامل برای ایجاد واکسن که به طور بالقوه می‌تواند واکنش‌های آلرژیک در میزبان ایجاد کند، کاندید واکسن طراحی شده در این مطالعه برای ایجاد ایمنی با استفاده از چندین قطعه پپتید آنتی‌ژن ایجاد شده است. اپی‌توپ‌های متعدد آنتی‌ژن برای فعال کردن سلول‌های T (CD4+ و CD8+) همراه با اپی‌توپ‌های سلول B برای تحریک تولید سلول‌های پلاسما به علاوه یک ادجوانت می‌تواند ایمنی طولانی مدت واکسن را بیش از واکسن‌های معمولی تضمین کند (65-67).
پروتئین پوکسین-شلافن از نقطه نظر آنتی‌ژنیسیته یکی از بهترین کاندیدهای پروتئین ایمونوژن در بین پروتئین‌های ویروس آبله میمون برای طراحی واکسن شناخته شده است (68). این پروتئین عملکرد لازم در اتصال به غشاء، شناسایی توسط دستگاه ایمنی میزبان و اتصال به گیرنده را دارد. پوکسین یک آنزیم نوکلئاز حفاظت شده در ویروس‌های آبله پستانداران است که در برخی موارد از انتهای کربوکسیلی به یک پروتئین شلافن که همولوژی بالایی با شلافن انسانی دارد متصل می‌شود (21). در این تحقیق از پروتئین پوکسین-شلافن برای پیش‌بینی اپی‌توپ‌های آنتی‌ژن استفاده گردید. اثربخشی، پایداری و حساسیت‌زایی نگرانی‌های عمده در رابطه با واکسن طراحی شده هستند (69). بر این اساس، بررسی جامعی از سمیت، حساسیت‌زایی، آنتی‌ژنیسیته و خواص فیزیکوشیمیایی اپی‌توپ‌های موجود در پروتئین فوق الذکر انجام گرفت. در این فرآیند اپی‌توپ‌هایی انتخاب شدند که نه تنها امتیاز آنتی‌ژنیسیته آن‌ها بالاتر از آستانه تعیین‌شده (4/0) بود، بلکه ماهیت غیر حساسیت‌زا و غیر سمی نیز داشتند.
این بررسی‌ها کارآیی و ایمنی سازه واکسن را با دقت تأیید نمود، زیرا اپی‌توپ‌های انتخاب شده به اندازه کافی آنتی‌ژنیک بودند و قادر به ایجاد مجموعه‌ای از واکنش‌های ایمنی بدون ایجاد حساسیت یا سمیت می‌باشند. آنتی‌ژن‌ها در چارچوب سیستم ایمنی تطبیقی به سلول‌های T CD4+ که به عنوان سلول‌های T کمک کننده نیز شناخته می‌شوند و سلول‌های T CD8+ که سلول‌های T کشنده هستند، به ترتیب از طریق پپتیدهای MHC-II و MHC-I ارائه می‌شوند (70). در نتیجه، در این تحقیق ترکیبی از اپی‌توپ‌های منتخب از پروتئین‌ B4R که اختصاصی گیرنده‌های سلولی MHC-I، MHC-II و B هستند، برای ایجاد دفاع ایمنی اختصاصی و انعطاف‌پذیر استفاده گردید. در این مطالعه، در یک فرآیند غربالگری و انتخاب ایمونوانفورماتیکی دقیق در مجموع 5 اپی‌توپ کارآمد جهت برهمکنش ایمنولوژیک از طریق سلول­های T کلاس I و II و سلول­های B انتخاب شد. با توجه به همولوژی بالای پروتئین شلافن آبله میمونی با شلافن انسانی، پاسخ‌های ایمنی نامطلوب احتمالی پپتیدهای انتخاب شده به دلیل واکنش متقابل با آنتی‌ژن‌های میزبان بررسی شد. با این حال هیچ­گونه واکنش متقابلی با آنتی‌ژن‌های میزبان مشاهده نشد. Hoque و همکاران (68) از واکسینولوژی معکوس برای ساخت واکسن پپتیدی علیه ویروس آبله میمون با استفاده از پروتئین‌ اتصالی سطح سلول، پوکسین-شلافن و پروتئین پوششی استفاده کردند. آن­ها کارایی مدل واکسن خود را با انجام داکینگ مولکولی با گیرنده‌های ایمنی بررسی کرده و نتایج امیدوار کننده‌ای را بر اساس انرژی آزاد اتصال به دست آوردند.
واکسن‌های چند اپی‌توپی معمولاً به صورت ساختارهای دانه‌ای روی رشته (String-of-bead) تولید می‌شوند که در آن هر اپی‌توپ مستقیماً یا توسط لینکرها به قسمت بعدی متصل می‌شود. به این ترتیب، ساختارهای منحصربه‌فرد و بسیار متفاوتی را می‌توان با تغییر ترتیب اپی‌توپ‌ها و با استفاده از لینکرهای مختلف پیش‌بینی کرد. وجود لینکر بین اپی‌توپ‌ها می‌تواند از تولید اپی‌توپ‌های پیوندی (نئواپی‌توپ‌ها) جلوگیری کرده و ارائه آنتی‌ژن را تسریع کند (71). بنابراین، در توسعه واکسن‌های پپتیدی چند اپی‌توپی برای حفظ فردیت هر اپی‌توپ معمولاً به استفاده از لینکرها توصیه می‌شود. در این راستا از لینکر KK برای اتصال اپی‌توپ‌های انتخاب شده برای سلول B و لینکرهای GPGPG و AYY به ترتیب برای اتصال اپی‌توپ‌های اختصاصی MHC-I و MHC-II استفاده شد. علاوه بر این، زیر واحد B سم وبا (CTB) به عنوان ادجوانت به انتهای کربوکسیلی توالی چند اپی‌توپی متصل شد. یکی از اشکالات اساسی واکسن‌های پپتیدی چند اپی‌توپی، ایمنی نسبتاً پایین آن‌ها است، محدودیتی که می‌توان با ترکیب ادجوانت‌ها بر آن غلبه کرد (72). مطالعات قبلی نشان داده‌اند که تجویز همزمان ادجوانت به صورت متصل به ساختار واکسن به سلول‌های ارائه‌ دهنده آنتی‌ژن، می‌تواند پاسخ‌های ایمنی قوی‌تری نسبت به ترکیب واکسن و ادجوانت به طور جداگانه ایجاد کند (73). هم­چنین، برای تسهیل خالص‌سازی واکسن نوترکیب بیان‌شده یک برچسب هیستیدینی در انتهای آمینی آن متصل شد.
TLRها پاتوژن‌های مختلف را در میزبان از طریق شناسایی الگوهای مولکولی مرتبط با پاتوژن (PAMPs) گروه‌های خاصی از میکروارگانیسم‌ها شناسایی می‌کنند. TLRها پروتئین‌های گیرنده حیاتی هستند که توسط اکثر سلول‌های سیستم ایمنی ذاتی مانند گرانولوسیت‌ها، ماکروفاژها و مونوسیت‌ها بیان می‌شوند. TLRها با درگیر شدن با اسیدهای نوکلئیک و پروتئین‌های پوششی پاتوژن‌های عفونی، پاسخ ایمنی ایجاد می‌کنند (74). MHCها بازیگران کلیدی در سیستم ایمنی هستند و قطعاتی از پاتوژن‌ها را روی سطوح سلولی ارائه می‌دهند. شناسایی این قطعات توسط سلول‌های T منجر به تحریک پاسخ‌های ایمنی تطبیقی می‌شود (75). با توجه به گزارشات مربوط به اهمیت مولکولی TLR-4 در ایمنی‌زایی علیه ویروس آبله میمون (76)، با استفاده از روش‌های داکینگ مولکولی، برهم­کنش‌های مولکولی و الگوهای پیوندی کاندید واکسن طراحی شده با TLR-4 مورد بررسی قرار گرفت.
شبیه‌سازی‌های دینامیک مولکولی (MD) به عنوان ابزار محاسباتی قدرت­مندی برای مطالعه رفتار دینامیکی سیستم‌های مولکول زیستی در سطح اتمی مورد استفاده قرار می‌گیرند. شبیه‌سازی‌ دینامیک مولکولی اطلاعات دقیقی را در مورد دینامیک ساختاری، تغییرات ساختاری، و برهم­کنش‌های درشت مولکول‌های زیستی مانند پروتئین‌ها، اسیدهای‌نوکلئیک و لیپیدها ارائه می‌دهند (77, 78). بنابراین، پایداری مجموعه کاندید واکسن-TLR4 با استفاده از شبیه‌سازی‌های MD تأیید شد. این نتایج نشان‌دهنده برهم­کنش‌های مولکولی پایدار بین کاندید واکسن و گیرنده‌ ایمونولوژیک است، که در نتیجه پایداری مولکولی مجموعه واکسن چند اپی‌توپی را در محیط سلولی تضمین می‌کند.
با توجه به مطالعه شبیه‌سازی ایمنی، و هم­چنین تولید مولکول‌های سیگنالی‌دهی مهم ایمنی مانند اینترلوکین‌ها و سیتوکین‌ها، پاسخ ایمنی کافی توسط کاندید واکسن طراحی شده در این مطالعه در طول مواجهه با واکسن ارائه شد. از آن­جایی­که هر نوع آنتی‌بادی نقش مشخصی در پاسخ ایمنی دارد (79)، اثربخشی کاندید واکسن طراحی شده با توانایی آن در تحریک طیف وسیعی از پاسخ‌های آنتی‌بادی تأیید شد. نتایج به‌دست آمده از طریق شبیه‌سازی ایمنی نه تنها پتانسیل واکسن را تأیید می‌کند، بلکه اهمیت آن را در تقویت ایمنی در برابر ویروس آبله میمون نیز بیشتر می‌کند.
کاندید واکسن چند اپی‌توپی طراحی شده در این تحقیق نویدبخش بوده و پتانسیل ایجاد یک پاسخ ایمنی قوی را نشان می‌دهد. با وجود این که رویکردهای ایمونوانفورماتیک ابزارهای ارزشمندی برای طراحی واکسن ارائه می‌دهند، اما بدون محدودیت نیستند. یکی از محدودیت‌های مهم در اتکا به پیش‌بینی‌های محاسباتی، عدم قطعیت نسبی است. دقت الگوریتم‌های پیش‌بینی اپی‌توپ به کیفیت و جامعیت داده‌های موجود بستگی داشته و ممکن است به طور بالقوه منجر به مثبت کاذب یا منفی کاذب شود. علاوه بر این، پیچیدگی واکنش‌های میزبان و پاتوژن و تنوع در پاسخ‌های ایمنی در افراد و جمعیت‌ها چالش‌های قابل توجهی را ایجاد می‌کند. علی‌رغم این محدودیت‌ها، رویکردهای ایمونو انفورماتیک یک راه امیدوارکننده برای طراحی واکسن هستند که نقطه شروع ارزشمندی برای تحقیقات تجربی و بالینی اعتبارسنجی کاندیدهای واکسن ارائه می‌کنند.
نتیجه‌گیری
روش‌های ایمونوانفورماتیکی پتانسیل بالایی برای طراحی واکسن‌های پپتیدی چند اپی‌توپی مؤثر علیه انواع مختلف ویروس‌ها دارند. در این مطالعه، از ابزارهای مختلف ایمونوانفورماتیک برای طراحی یک واکسن جدید چند اپی‌توپی علیه ویروس آبله میمون استفاده گردید. نتایج این تحقیق نشان می‌دهد که کاندید واکسن چند اپی‌توپی طراحی شده آنتی‌ژنیسیته و ایمنی‌زایی امیدوارکننده‌ای نشان می‌دهد، غیرحساسیت‌زا و غیرسمی است و می‌تواند پاسخ‌های ایمنی قوی را بدون ایجاد عوارض جانبی ایجاد کند. همچنین برهم­کنش بین واکسن چند اپی‌توپی وگیرنده TLR-4 با استفاده از داکینگ مولکولی و شبیه‌سازی دینامیک مولکولی ارزیابی شد. نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که واکسن چند اپی‌توپی طراحی شده، پتانسیل ایجاد ایمنی در برابر ویروس آبله میمون را دارد و می‌تواند گامی مهم در جهت جلوگیری از عفونت‌های آبله میمون و مرگ و میر ناشی از آن باشد. با این حال، پس از بیان موفق پروتین نوترکیب طراحی شده به عنوان کاندید واکسن برای تأیید اثر بخشی آن نیاز به آزمایشات پیش‌بالینی بر روی مدل‌های حیوانی است.
تشکر و قدردانی
به این وسیله از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه تبریز به دلیل حمایت‌های مادی و معنوی تقدیر و تشکر می‌گردد.
تعارض منافع: نویسندگان این مقاله اظهار می‌دارند که تضاد منافعی وجود ندارد.
حامی مالی: این پژوهش با حمایت مالی معاونت پژوهشی دانشگاه تبریز انجام شده است.
ملاحظات اخلاقی (کد اخلاق): با توجه به ماهیت بیوانفورماتیکی مطالعه حاضر و مطابق با آیین‌نامه اختصاص کد اخلاق در کمیته اخلاق دانشگاه تبریز، امکان ارائه کد اخلاق برای این مطالعه وجود نداشت.
مشارکت نویسندگان
- طراحی ایده: بهرام ‌باغبان‌ کهنه‌روز
- روش کار: بهرام ‌باغبان ‌کهنه‌روز، مریم احساسات‌وطن
- جمع‌آوری داده‌ها: مریم احساسات‌وطن، فدرا نژاد ایران نژاد
- تجزیه و تحلیل داده‌ها: مریم احساسات‌وطن
- نظارت: بهرام باغبان کهنه‌روز
- مدیریت پروژه: بهرام باغبان کهنه‌روز
- نگارش-پیش‌نویس اصلی: مریم احساسات‌وطن
--نگارش-بررسی و ویرایش: بهرام باغبان کهنه‌روز
 


References
 
1.   Alakunle EF, Okeke MI. Monkeypox virus: a neglected zoonotic pathogen spreads globally. Nat Rev Microbiol 2022; 20(9): 507-8.
2.   Happi C, Adetifa I, Mbala P, Njouom R, Nakoune E, Happi A, et al. Urgent need for a non-discriminatory and non-stigmatizing nomenclature for monkeypox virus. PLoS Biol 2022; 20(8): 3001769.
3.   Earl PL, Americo JL, Moss B. Lethal monkeypox virus infection of CAST/EiJ mice is associated with a deficient gamma interferon response. J Virol 2012; 86(17): 9105-12.
4.   Grothe JH, Cornely OA, Salmanton-García J. Monkeypox diagnostic and treatment capacity at epidemic onset: A VACCELERATE online survey. J Infect Public Health 2022; 15(10): 1043-6.
5.   WHO. Multi-country monkeypox outbreak: situation update. 2022.
6.   Choudhary G, Prabha PK, Gupta S, Prakash A, Medhi B. Monkeypox infection: A quick glance. Indian J Pharmacol 2022 54(3); 161-4.
7.   Bunge EM, Hoet B, Chen L, Lienert F, Weidenthaler H, Baer LR, et al. The changing epidemiology of human monkeypox—A potential threat? A systematic review. PLoS Negl Trop Dis 2022; 16(2): 0010141.
8.   Plotkin SA, Orenstein W, Offit PA. Vaccines. E-book, Elsevier Health Sciences. 2012; 1570.
9.   Grosenbach DW, Honeychurch K, Rose EA, Chinsangaram J, Frimm A, Maiti B, et al. Oral tecovirimat for the treatment of smallpox. NEJM 2018; 379(1): 44-53.
10. Chittick G, Morrison M, Brundage T, Nichols WG. Short-term clinical safety profile of brincidofovir: A favorable benefit–risk proposition in the treatment of smallpox. Antiviral Res 2017; 143: 269-77.
11. Delany I, Rappuoli R, Seib KL. Vaccines, reverse vaccinology, and bacterial pathogenesis. Cold Spring Harb Perspect Med 2013; 3(5): 012476.
12. Albekairi TH, Alshammari A, Alharbi M, Alshammary AF, Tahir ul Qamar M, Ullah A, et al. Designing of a novel multi-antigenic epitope-based vaccine against E. hormaechei: an intergraded reverse vaccinology and immunoinformatics approach. Vaccines 2022; 10(5): 665.
13. Seib KL, Dougan G, Rappuoli R. The key role of genomics in modern vaccine and drug design for emerging infectious diseases. PLoS Genet 2009; 5(10): 1000612.
14. Goumari MM, Farhani I, Nezafat N, Mahmoodi S. Multi-epitope vaccines (MEVs), as a novel strategy against infectious diseases. Curr Proteomics 2020; 17(5): 354-64.
15. Negahdaripour M, Nezafat N, Eslami M, Ghoshoon MB, Shoolian E, Najafipour S, et al. Structural vaccinology considerations for in silico designing of a multi-epitope vaccine. Infect Genet Evol 2018; 58: 96-109.
16. Eaglesham JB, Pan Y, Kupper TS, Kranzusch PJ. Viral and metazoan poxins are cGAMP-specific nucleases that restrict cGAS–STING signalling. Nature 2019; 566(7743): 259-63.
17. Maluquer de Motes C. Poxvirus cGAMP nucleases: Clues and mysteries from a stolen gene. PLoS Pathog 2021; 17(3): 1009372.
18. Eaglesham JB, McCarty KL, Kranzusch PJ. Structures of diverse poxin cGAMP nucleases reveal a widespread role for cGAS-STING evasion in host–pathogen conflict. Elife 2020; 9: 59753.
19. Ablasser A, Goldeck M, Cavlar T, Deimling T, Witte G, Röhl I, et al. cGAS produces a 2′-5′-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING. Nature 2013; 498(7454): 380-4.
20. Phelan T, Little MA, Brady G. Targeting of the cGAS-STING system by DNA viruses. Biochem Pharmacol 2020; 174: 113831.
21. Liu F, Zhou P, Wang Q, Zhang M, Li D. The Schlafen family: complex roles in different cell types and virus replication. Cell Bio Int 2018; 42(1): 2-8.
22. Sievers F, Higgins DG. Clustal Omega for making accurate alignments of many protein sequences. Protein Sci 2018; 27(1): 135-45.
23. Clifford JN, Høie MH, Deleuran S, Peters B, Nielsen M, Marcatili P. BepiPred‐3.0: Improved B‐cell epitope prediction using protein language models. Protein Sci 2022; 31(12): 4497.
24. Saha S, Raghava GPS. Prediction of continuous B‐cell epitopes in an antigen using recurrent neural network. Proteins:Struct., Funct., Bioinf 2006; 65(1): 40-8.
25. Reynisson B, Alvarez B, Paul S, Peters B, Nielsen M. NetMHCpan-4.1 and NetMHCIIpan-4.0: improved predictions of MHC antigen presentation by concurrent motif deconvolution and integration of MS MHC eluted ligand data. Nucleic Acids Res 2020; 48(1): 449-54.
26. Ehsasatvatan M, Kohnehrouz BB. Designing and immunomolecular analysis of a new broad-spectrum multiepitope vaccine against divergent human papillomavirus types. PLoS One 2024; 19(12): 0311351.
27. Wang P, Sidney J, Dow C, Mothé B, Sette A, Peters B. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comp Biol 2008; 4(4): 1000048.
28. Jensen KK, Andreatta M, Marcatili P, Buus S, Greenbaum JA, Yan Z, et al. Improved methods for predicting peptide binding affinity to MHC class II molecules. Immunol 2018; 154(3): 394-406.
29. Doytchinova IA, Flower DR. VaxiJen: a server for prediction of protective antigens, tumour antigens and subunit vaccines. BMC Bioinformatics 2007; 8: 4.
30. Calis JJ, Maybeno M, Greenbaum JA, Weiskopf D, De Silva AD, Sette A, et al. Properties of MHC class I presented peptides that enhance immunogenicity. PLoS Comput Biol 2013; 9(10): 1003266.
31. Dimitrov I, Naneva L, Doytchinova I, Bangov I. AllergenFP: allergenicity prediction by descriptor fingerprints. Bioinformatics 2014; 30(6): 846-51.
32. Dimitrov I, Flower DR, Doytchinova I. AllerTOP--a server for in silico prediction of allergens. BMC Bioinformatics 2013; 14: 4.
33. Sharma N, Naorem LD, Jain S, Raghava GP. ToxinPred2: An improved method for predicting toxicity of proteins. Brief Bioinform 2022; 23(5): 174.
34. Mahram A, Herbordt MC. NCBI BLASTP on high-performance reconfigurable computing systems. TRETS 2015; 7(4): 1-20.
35. Bui H-H, Sidney J, Dinh K, Southwood S, Newman MJ, Sette A. Predicting population coverage of T-cell epitope-based diagnostics and vaccines. BMC Bioinformatics 2006; 7(1): 1-5.
36. Cepeda MS, Katz EG, Blacketer C. Microbiome-gut-brain axis: probiotics and their association with depression. J Neuropsychiatry Clin Neurosci 2017; 29(1): 39-44.
37. Dong R, Chu Z, Yu F, Zha Y. Contriving multi-epitope subunit of vaccine for COVID-19: immunoinformatics approaches. Front Immunol 2020; 11: 1784.
38. Hajighahramani N, Nezafat N, Eslami M, Negahdaripour M, Rahmatabadi SS, Ghasemi Y. Immunoinformatics analysis and in silico designing of a novel multi-epitope peptide vaccine against Staphylococcus aureus. Infect Genet Evol 2017; 48: 83-94.
39. Pandey RK, Ojha R, Aathmanathan VS, Krishnan M, Prajapati VK. Immunoinformatics approaches to design a novel multi-epitope subunit vaccine against HIV infection. Vaccine 2018; 36(17): 2262-72.
40. Saadi M, Karkhah A, Nouri HR. Development of a multi-epitope peptide vaccine inducing robust T cell responses against brucellosis using immunoin_ formatics based approaches. Infect Genet Evol 2017; 51: 227-34.
41. Hebditch M, Carballo-Amador MA, Charonis S, Curtis R, Warwicker J. Protein–Sol: a web tool for predicting protein solubility from sequence. Bioinformatics 2017; 33(19): 3098-100.
42. Garnier J, Gibrat J-F, Robson B. [32] GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence. In Methods in enzymology. 266, Elsevier, Academic Press 1996; 540-53.
43. McGuffin LJ, Bryson K, Jones DT. The PSIPRED protein structure prediction server. Bioinformatics 2000; 16(4): 404-5.
44. Tunyasuvunakool K, Adler J, Wu Z, Green T, Zielinski M, Žídek A, et al. Highly accurate protein structure prediction for the human proteome. Nature 2021; 596(7873): 590-6.
45. Ko J, Park H, Heo L, Seok C. GalaxyWEB server for protein structure prediction and refinement. Nucleic Acids Res 2012; 40(1): 294-7.
46. Laskowski R, MacArthur M, Thornton J. PROCHECK: validation of protein-structure coordinates. International Table for Crystallography 2012; 684-8.
47. Colovos C, Yeates T. ERRAT: an empirical atom-based method for validating protein structures. Protein Sci 1993; 2(9): 1511-9.
48. Wiederstein M, Sippl MJ. ProSA-web: interactive web service for the recognition of errors in three-dimensional structures of proteins. Nucleic Acids Res 2007; 35: 407-10.
49. Potocnakova L, Bhide M, Pulzova LB. An introduction to B-cell epitope mapping and in silico epitope prediction. J Immunol Res 2016; 2016.
50. Kozakov D, Hall DR, Xia B, Porter KA, Padhorny D, Yueh C, et al. The ClusPro web server for protein-protein docking. Nat Protoc 2017; 12(2): 255-78.
51. Xue LC, Rodrigues JP, Kastritis PL, Bonvin AM, Vangone A. PRODIGY: a web server for predicting the binding affinity of protein-protein complexes. Bioinformatics 2016; 32(23): 3676-8.
52. Wallace AC, Laskowski RA, Thornton JM. LIGPLOT: a program to generate schematic diagrams of protein-ligand interactions. Protein Eng 1995; 8(2): 127-34.
53. Van Der Spoel D, Lindahl E, Hess B, Groenhof G, Mark AE, Berendsen HJ. GROMACS: fast, flexible, and free. J Comput Chem 2005; 26(16): 1701-18.
54. Lindquist JM, Sulewski CA. Microsoft Excel: The Universal Tool of Analysis. In Handbook of Military and Defense Operations Research. Chapman and Hall/CRC, Taylor & Francis. 2020; 19-54.
55. DeWitt ME, Polk C, Williamson J, Shetty AK, Passaretti CL, McNeil CJ, et al. Global monkeypox case hospitalisation rates: a rapid systematic review and meta-analysis. EClinicalMedicine 2022; 54.
56. Gruber MF. Current status of monkeypox vaccines. NPJ Vaccines 2022; 7(1): 94.
57. Owens LE. JYNNEOS vaccination coverage among persons at risk for mpox—United States, May 22, 2022–January 31, 2023. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2023; 72: 342-7.
58. Grosenbach DW, Jordan R, King DS, Berhanu A, Warren TK, Kirkwood-Watts DL, et al. Immune responses to the smallpox vaccine given in combination with ST-246, a small-molecule inhibitor of poxvirus dissemination. Vaccine 2008; 26(7): 933-46.
59. Cheng P, Gong W. In silico analysis of peptide-based biomarkers for the diagnosis and prevention of latent tuberculosis infection. Front Microbiol 2022; 13: 947852.
60. Mahapatra SR, Dey J, Kushwaha GS, Puhan P, Mohakud NK, Panda SK, et al. Immunoinformatic approach employing modeling and simulation to design a novel vaccine construct targeting MDR efflux pumps to confer wide protection against typhoidal Salmonella serovars. J Biomol Struct Dyn 2022; 40(22): 11809-21.
61. Beikzadeh B. Immunoinformatics design of multi-epitope vaccine using OmpA, OmpD and enterotoxin against non-typhoidal salmonellosis. BMC Bioinformatics 2023; 24(1): 63.
62. Maleki A, Russo G, Parasiliti Palumbo GA, Pappalardo F. In silico design of recombinant multi-epitope vaccine against influenza A virus. BMC Bioinformatics 2021; 22: 617.
63. Sarvmeili J, Baghban Kohnehrouz B, Gholizadeh A, Ofoghi H, Shanehbandi D. Introduction of an Efficient Multiepitopic Vaccine Against Different SARS-CoV-2 Strains: Reverse Vaccinology. Journal of Health and Biomedical Informatics 2023; 10(3): 269-93.
64. Sarvmeili J, Baghban Kohnehrouz B, Gholizadeh A, Shanehbandi D, Ofoghi H. Immunoinformatics design of a structural proteins driven multi-epitope candidate vaccine against different SARS-CoV-2 variants based on fynomer. Sci Rep 2024; 14(1): 10297.
65. He R, Yang X, Liu C, Chen X, Wang L, Xiao M, et al. Efficient control of chronic LCMV infection by a CD4 T cell epitope-based heterologous prime-boost vaccination in a murine model. Cell Mol Immunol 2018; 15(9): 815-26.
66. Jiang P, Cai Y, Chen J, Ye X, Mao S, Zhu S, et al. Evaluation of tandem Chlamydia trachomatis MOMP multi-epitopes vaccine in BALB/c mice model. Vaccine 2017; 35(23): 3096-103.
67. Lu I-N, Farinelle S, Sausy A, Muller CP. Identification of a CD4 T-cell epitope in the hemagglutinin stalk domain of pandemic H1N1 influenza virus and its antigen-driven TCR usage signature in BALB/c mice. Cell Mol Immunol 2017; 14(6): 511-20.
68. Hoque SF, Bappy MNI, Chowdhury AT, Parvez MSA, Ahmed F, Imran MAS, et al. Scrutinizing surface glycoproteins and poxin-schlafen protein to design a heterologous recombinant vaccine against monkeypox virus. bioRxiv 2020; 919332.
69. Sandrini A, Rolland JM, O’Hehir RE. Current developments for improving efficacy of allergy vaccines. Expert Rev Vaccines 2015; 14(8): 1073-87.
70. Jasenosky LD, Scriba TJ, Hanekom WA, Goldfeld AE. T cells and adaptive immunity to Mycobacterium tuberculosis in humans. Immunolo Rev 2015; 264(1): 74-87.
71. Papaleo E, Saladino G, Lambrughi M, Lindorff-Larsen K, Gervasio FL, Nussinov R. The role of protein loops and linkers in conformational dynamics and allostery. Chem Rev 2016; 116(11): 6391-423.
72. Marciani DJ. Vaccine adjuvants: role and mechanisms of action in vaccine immunogenicity. Drug Discov Today 2003; 8(20): 934-43.
73. Mizel SB, Bates JT. Flagellin as an adjuvant: cellular mechanisms and potential. J Immunol 2010; 185(10): 5677-82.
74. Lester SN, Li K. Toll-like receptors in antiviral innate immunity. J Mol Biol 2014; 426(6): 1246-64.
75. Mantegazza AR, Magalhaes JG, Amigorena S, Marks MS. Presentation of phagocytosed antigens by MHC class I and II. Traffic 2013; 14(2): 135-52.
76. Alakunle E, Kolawole D, Diaz-Canova D, Alele F, Adegboye O, Moens U, et al. A comprehensive review of monkeypox virus and mpox characteristics. Front Cell Infect Microbiol 2024; 14: 1360586.
77. Adcock SA, McCammon JA. Molecular dynamics: survey of methods for simulating the activity of proteins. Chem Rev 2006; 106(5): 1589-615.
78. Machado MR, Pantano S. Split the charge difference in two! A rule of thumb for adding proper amounts of ions in MD simulations. J Chem Theory Comput 2020; 16(3): 1367-72.
79. Pang J, Cui J-a, Hui J. The importance of immune responses in a model of hepatitis B virus. Nonlinear Dyn 2012; 67: 723-34.


Immunoinformatics Design of a Multi-Epitope Vaccine Candidate via Poxin-Schlafen Protein of Monkeypox Virus
Maryam Ehsasatvatan[4], Bahram Baghban Kohnehrouz[5], Fedra Nejad Iran Nejad[6]

Received: 15/12/24       Sent for Revision: 19/01/25       Received Revised Manuscript: 01/03/25   Accepted: 04/03/25

Background and Objectives: Monkeypox virus, a DNA-enveloped virus of the orthopoxvirus family, causes monkeypox infection in humans. Poxviruses have a distinctive nuclease called poxin, which cleaves cyclic dinucleotide 2'-3'-cGAMP, a crucial secondary messenger in the cGAS-STING (Cyclic GMP-AMP Synthase-Stimulator of Interferon Genes) signaling pathway. Despite existing drugs and vaccines for orthopoxvirus infections, the recent spread of monkeypox has raised global concerns. This study investigated the poxin-schlafen protein of monkeypox virus as a potential target for a novel multi-epitope vaccine.
Materials and Methods: This study was conducted using bioinformatic data analysis. Epitopes of this protein were evaluated for non-allergenicity, non-toxicity, and the ability to elicit T and B cell responses. The interaction between the vaccine and toll-like receptor-4 (TLR-4) was assessed using Cluspro 2.0. Immune, and MD simulations were performed to confirm the reliability of the docked complexes.
Results: The designed vaccine candidate was highly antigenic, non-allergenic, soluble, and had acceptable physicochemical properties. The three-dimensional structure of the vaccine and its interaction with TLR-4 were elucidated. Molecular dynamics simulations corroborated the high stability of the vaccine-TLR-4 complex. Immune simulation indicated that the vaccine candidate effectively elicited robust protective immune responses in the human body.
Conclusion: This study identified the most efficacious epitopes from the poxin-schlafen protein of the monkeypox virus. These findings demonstrate the potential efficacy of this vaccine candidate in eliciting immune responses. This study could significantly advance the development of an antiviral vaccine against monkeypox viruses. However, further in vitro and in vivo studies are required.
Keywords: Monkeypox, Immunoinformatic, Poxin-schlafen, Vaccine candidate

Funding: The study was funded by Tabriz University, Tabriz, Iran.
Conflict interest: None declared.
Ethical considerations: Not applicable.
Authors’ contributions:
-Conceptualization: Bahram Baghban Kohnehrouz
-Methodology: Bahram Baghban Kohnehrouz, Maryam Ehsasatvatan
- Data collection: Maryam Ehsasatvatan, Fedra Nejad Iran Nejad
-Formal analysis: Maryam Ehsasatvatan
-Supervision: Bahram Baghban Kohnehrouz
-Project administration: Bahram Baghban Kohnehrouz
-Writing - original draft: Maryam Ehsasatvatan
-Writing - review & editing: Bahram Baghban Kohnehrouz
Citation: Ehsasatvatan M, Baghban Kohnehrouz B, Nejad Iran Nejad F. Immunoinformatics Design of a Multi-Epitope Vaccine Candidate via Poxin-Schlafen Protein of Monkeypox Virus. J Rafsanjan Univ Med Sci 2025; 24 (1): 19-46. [Farsi]
 
[1]- دکتری تخصصی، گروه به‌نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران
[2]- دانشیار، گروه به‌نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران
   تلفن: 33356003-041، پست الکترونیکی: bahrambaghban.kr@tabrizu.ac.ir
[3]- کارشناسی ارشد، گروه به‌نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانImmunoinformatics Design of a Multi-Epitope Vaccine Candidate via Poxin-Schlafen Protein of Monkeypox Virus
Maryam Ehsasatvatan[1], Bahram Baghban Kohnehrouz[2], Fedra Nejad Iran Nejad[3]

Received: 15/12/24       Sent for Revision: 19/01/25       Received Revised Manuscript: 01/03/25   Accepted: 04/03/25

Background and Objectives: Monkeypox virus, a DNA-enveloped virus of the orthopoxvirus family, causes monkeypox infection in humans. Poxviruses have a distinctive nuclease called poxin, which cleaves cyclic dinucleotide 2'-3'-cGAMP, a crucial secondary messenger in the cGAS-STING (Cyclic GMP-AMP Synthase-Stimulator of Interferon Genes) signaling pathway. Despite existing drugs and vaccines for orthopoxvirus infections, the recent spread of monkeypox has raised global concerns. This study investigated the poxin-schlafen protein of monkeypox virus as a potential target for a novel multi-epitope vaccine.
Materials and Methods: This study was conducted using bioinformatic data analysis. Epitopes of this protein were evaluated for non-allergenicity, non-toxicity, and the ability to elicit T and B cell responses. The interaction between the vaccine and toll-like receptor-4 (TLR-4) was assessed using Cluspro 2.0. Immune, and MD simulations were performed to confirm the reliability of the docked complexes.
Results: The designed vaccine candidate was highly antigenic, non-allergenic, soluble, and had acceptable physicochemical properties. The three-dimensional structure of the vaccine and its interaction with TLR-4 were elucidated. Molecular dynamics simulations corroborated the high stability of the vaccine-TLR-4 complex. Immune simulation indicated that the vaccine candidate effectively elicited robust protective immune responses in the human body.
Conclusion: This study identified the most efficacious epitopes from the poxin-schlafen protein of the monkeypox virus. These findings demonstrate the potential efficacy of this vaccine candidate in eliciting immune responses. This study could significantly advance the development of an antiviral vaccine against monkeypox viruses. However, further in vitro and in vivo studies are required.
Keywords: Monkeypox, Immunoinformatic, Poxin-schlafen, Vaccine candidate

Funding: The study was funded by Tabriz University, Tabriz, Iran.
Conflict interest: None declared.
Ethical considerations: Not applicable.
Authors’ contributions:
-Conceptualization: Bahram Baghban Kohnehrouz
-Methodology: Bahram Baghban Kohnehrouz, Maryam Ehsasatvatan
- Data collection: Maryam Ehsasatvatan, Fedra Nejad Iran Nejad
-Formal analysis: Maryam Ehsasatvatan
-Supervision: Bahram Baghban Kohnehrouz
-Project administration: Bahram Baghban Kohnehrouz
-Writing - original draft: Maryam Ehsasatvatan
-Writing - review & editing: Bahram Baghban Kohnehrouz
Citation: Ehsasatvatan M, Baghban Kohnehrouz B, Nejad Iran Nejad F. Immunoinformatics Design of a Multi-Epitope Vaccine Candidate via Poxin-Schlafen Protein of Monkeypox Virus. J Rafsanjan Univ Med Sci 2025; 24 (1): 19-46. [Farsi]
 
[1]- Post Doctoral Researcher in Plant Biotechnology, Dept. of Plant Breeding & Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran
[2]- Associate Prof., Dept. of Plant Breeding & Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran
[3]- MSc Graduate in Plant Biotechnology, Dept. of Plant Breeding & Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran, ORCID: 0009-0003-5258-1011
(Corresponding Author) Tel: (041) 33356003, E-mail: nejadiran.f@gmail.com
شگاه تبریز، تبریز، ایران
[4]- Post Doctoral Researcher in Plant Biotechnology, Dept. of Plant Breeding & Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran
[5]- Associate Prof., Dept. of Plant Breeding & Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran
[6]- MSc Graduate in Plant Biotechnology, Dept. of Plant Breeding & Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran, ORCID: 0009-0003-5258-1011
(Corresponding Author) Tel: (041) 33356003, E-mail: nejadiran.f@gmail.com
نوع مطالعه: پژوهشي | موضوع مقاله: ايمونولوژي
دریافت: 1403/9/20 | پذیرش: 1403/12/14 | انتشار: 1404/2/1
فهرست منابع
1. Alakunle EF, Okeke MI. Monkeypox virus: a neglected zoonotic pathogen spreads globally. Nat Rev Microbiol 2022; 20(9): 507-8.
2. Happi C, Adetifa I, Mbala P, Njouom R, Nakoune E, Happi A, et al. Urgent need for a non-discriminatory and non-stigmatizing nomenclature for monkeypox virus. PLoS Biol 2022; 20(8): 3001769.
3. Earl PL, Americo JL, Moss B. Lethal monkeypox virus infection of CAST/EiJ mice is associated with a deficient gamma interferon response. J Virol 2012; 86(17): 9105-12.
4. Grothe JH, Cornely OA, Salmanton-García J. Monkeypox diagnostic and treatment capacity at epidemic onset: A VACCELERATE online survey. J Infect Public Health 2022; 15(10): 1043-6.
5. WHO. Multi-country monkeypox outbreak: situation update. 2022.
6. Choudhary G, Prabha PK, Gupta S, Prakash A, Medhi B. Monkeypox infection: A quick glance. Indian J Pharmacol 2022 54(3); 161-4.
7. Bunge EM, Hoet B, Chen L, Lienert F, Weidenthaler H, Baer LR, et al. The changing epidemiology of human monkeypox—A potential threat? A systematic review. PLoS Negl Trop Dis 2022; 16(2): 0010141.
8. Plotkin SA, Orenstein W, Offit PA. Vaccines. E-book, Elsevier Health Sciences. 2012; 1570.
9. Grosenbach DW, Honeychurch K, Rose EA, Chinsangaram J, Frimm A, Maiti B, et al. Oral tecovirimat for the treatment of smallpox. NEJM 2018; 379(1): 44-53.
10. Chittick G, Morrison M, Brundage T, Nichols WG. Short-term clinical safety profile of brincidofovir: A favorable benefit–risk proposition in the treatment of smallpox. Antiviral Res 2017; 143: 269-77.
11. Delany I, Rappuoli R, Seib KL. Vaccines, reverse vaccinology, and bacterial pathogenesis. Cold Spring Harb Perspect Med 2013; 3(5): 012476.
12. Albekairi TH, Alshammari A, Alharbi M, Alshammary AF, Tahir ul Qamar M, Ullah A, et al. Designing of a novel multi-antigenic epitope-based vaccine against E. hormaechei: an intergraded reverse vaccinology and immunoinformatics approach. Vaccines 2022; 10(5): 665.
13. Seib KL, Dougan G, Rappuoli R. The key role of genomics in modern vaccine and drug design for emerging infectious diseases. PLoS Genet 2009; 5(10): 1000612.
14. Goumari MM, Farhani I, Nezafat N, Mahmoodi S. Multi-epitope vaccines (MEVs), as a novel strategy against infectious diseases. Curr Proteomics 2020; 17(5): 354-64.
15. Negahdaripour M, Nezafat N, Eslami M, Ghoshoon MB, Shoolian E, Najafipour S, et al. Structural vaccinology considerations for in silico designing of a multi-epitope vaccine. Infect Genet Evol 2018; 58: 96-109.
16. Eaglesham JB, Pan Y, Kupper TS, Kranzusch PJ. Viral and metazoan poxins are cGAMP-specific nucleases that restrict cGAS–STING signalling. Nature 2019; 566(7743): 259-63.
17. Maluquer de Motes C. Poxvirus cGAMP nucleases: Clues and mysteries from a stolen gene. PLoS Pathog 2021; 17(3): 1009372.
18. Eaglesham JB, McCarty KL, Kranzusch PJ. Structures of diverse poxin cGAMP nucleases reveal a widespread role for cGAS-STING evasion in host–pathogen conflict. Elife 2020; 9: 59753.
19. Ablasser A, Goldeck M, Cavlar T, Deimling T, Witte G, Röhl I, et al. cGAS produces a 2′-5′-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING. Nature 2013; 498(7454): 380-4.
20. Phelan T, Little MA, Brady G. Targeting of the cGAS-STING system by DNA viruses. Biochem Pharmacol 2020; 174: 113831.
21. Liu F, Zhou P, Wang Q, Zhang M, Li D. The Schlafen family: complex roles in different cell types and virus replication. Cell Bio Int 2018; 42(1): 2-8.
22. Sievers F, Higgins DG. Clustal Omega for making accurate alignments of many protein sequences. Protein Sci 2018; 27(1): 135-45.
23. Clifford JN, Høie MH, Deleuran S, Peters B, Nielsen M, Marcatili P. BepiPred‐3.0: Improved B‐cell epitope prediction using protein language models. Protein Sci 2022; 31(12): 4497.
24. Saha S, Raghava GPS. Prediction of continuous B‐cell epitopes in an antigen using recurrent neural network. Proteins:Struct., Funct., Bioinf 2006; 65(1): 40-8.
25. Reynisson B, Alvarez B, Paul S, Peters B, Nielsen M. NetMHCpan-4.1 and NetMHCIIpan-4.0: improved predictions of MHC antigen presentation by concurrent motif deconvolution and integration of MS MHC eluted ligand data. Nucleic Acids Res 2020; 48(1): 449-54.
26. Ehsasatvatan M, Kohnehrouz BB. Designing and immunomolecular analysis of a new broad-spectrum multiepitope vaccine against divergent human papillomavirus types. PLoS One 2024; 19(12): 0311351.
27. Wang P, Sidney J, Dow C, Mothé B, Sette A, Peters B. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comp Biol 2008; 4(4): 1000048.
28. Jensen KK, Andreatta M, Marcatili P, Buus S, Greenbaum JA, Yan Z, et al. Improved methods for predicting peptide binding affinity to MHC class II molecules. Immunol 2018; 154(3): 394-406.
29. Doytchinova IA, Flower DR. VaxiJen: a server for prediction of protective antigens, tumour antigens and subunit vaccines. BMC Bioinformatics 2007; 8: 4.
30. Calis JJ, Maybeno M, Greenbaum JA, Weiskopf D, De Silva AD, Sette A, et al. Properties of MHC class I presented peptides that enhance immunogenicity. PLoS Comput Biol 2013; 9(10): 1003266.
31. Dimitrov I, Naneva L, Doytchinova I, Bangov I. AllergenFP: allergenicity prediction by descriptor fingerprints. Bioinformatics 2014; 30(6): 846-51.
32. Dimitrov I, Flower DR, Doytchinova I. AllerTOP--a server for in silico prediction of allergens. BMC Bioinformatics 2013; 14: 4.
33. Sharma N, Naorem LD, Jain S, Raghava GP. ToxinPred2: An improved method for predicting toxicity of proteins. Brief Bioinform 2022; 23(5): 174.
34. Mahram A, Herbordt MC. NCBI BLASTP on high-performance reconfigurable computing systems. TRETS 2015; 7(4): 1-20.
35. Bui H-H, Sidney J, Dinh K, Southwood S, Newman MJ, Sette A. Predicting population coverage of T-cell epitope-based diagnostics and vaccines. BMC Bioinformatics 2006; 7(1): 1-5.
36. Cepeda MS, Katz EG, Blacketer C. Microbiome-gut-brain axis: probiotics and their association with depression. J Neuropsychiatry Clin Neurosci 2017; 29(1): 39-44.
37. Dong R, Chu Z, Yu F, Zha Y. Contriving multi-epitope subunit of vaccine for COVID-19: immunoinformatics approaches. Front Immunol 2020; 11: 1784.
38. Hajighahramani N, Nezafat N, Eslami M, Negahdaripour M, Rahmatabadi SS, Ghasemi Y. Immunoinformatics analysis and in silico designing of a novel multi-epitope peptide vaccine against Staphylococcus aureus. Infect Genet Evol 2017; 48: 83-94.
39. Pandey RK, Ojha R, Aathmanathan VS, Krishnan M, Prajapati VK. Immunoinformatics approaches to design a novel multi-epitope subunit vaccine against HIV infection. Vaccine 2018; 36(17): 2262-72.
40. Saadi M, Karkhah A, Nouri HR. Development of a multi-epitope peptide vaccine inducing robust T cell responses against brucellosis using immunoin_ formatics based approaches. Infect Genet Evol 2017; 51: 227-34.
41. Hebditch M, Carballo-Amador MA, Charonis S, Curtis R, Warwicker J. Protein–Sol: a web tool for predicting protein solubility from sequence. Bioinformatics 2017; 33(19): 3098-100.
42. Garnier J, Gibrat J-F, Robson B. [32] GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence. In Methods in enzymology. 266, Elsevier, Academic Press 1996; 540-53.
43. McGuffin LJ, Bryson K, Jones DT. The PSIPRED protein structure prediction server. Bioinformatics 2000; 16(4): 404-5.
44. Tunyasuvunakool K, Adler J, Wu Z, Green T, Zielinski M, Žídek A, et al. Highly accurate protein structure prediction for the human proteome. Nature 2021; 596(7873): 590-6.
45. Ko J, Park H, Heo L, Seok C. GalaxyWEB server for protein structure prediction and refinement. Nucleic Acids Res 2012; 40(1): 294-7.
46. Laskowski R, MacArthur M, Thornton J. PROCHECK: validation of protein-structure coordinates. International Table for Crystallography 2012; 684-8.
47. Colovos C, Yeates T. ERRAT: an empirical atom-based method for validating protein structures. Protein Sci 1993; 2(9): 1511-9.
48. Wiederstein M, Sippl MJ. ProSA-web: interactive web service for the recognition of errors in three-dimensional structures of proteins. Nucleic Acids Res 2007; 35: 407-10.
49. Potocnakova L, Bhide M, Pulzova LB. An introduction to B-cell epitope mapping and in silico epitope prediction. J Immunol Res 2016; 2016.
50. Kozakov D, Hall DR, Xia B, Porter KA, Padhorny D, Yueh C, et al. The ClusPro web server for protein-protein docking. Nat Protoc 2017; 12(2): 255-78.
51. Xue LC, Rodrigues JP, Kastritis PL, Bonvin AM, Vangone A. PRODIGY: a web server for predicting the binding affinity of protein-protein complexes. Bioinformatics 2016; 32(23): 3676-8.
52. Wallace AC, Laskowski RA, Thornton JM. LIGPLOT: a program to generate schematic diagrams of protein-ligand interactions. Protein Eng 1995; 8(2): 127-34.
53. Van Der Spoel D, Lindahl E, Hess B, Groenhof G, Mark AE, Berendsen HJ. GROMACS: fast, flexible, and free. J Comput Chem 2005; 26(16): 1701-18.
54. Lindquist JM, Sulewski CA. Microsoft Excel: The Universal Tool of Analysis. In Handbook of Military and Defense Operations Research. Chapman and Hall/CRC, Taylor & Francis. 2020; 19-54.
55. DeWitt ME, Polk C, Williamson J, Shetty AK, Passaretti CL, McNeil CJ, et al. Global monkeypox case hospitalisation rates: a rapid systematic review and meta-analysis. EClinicalMedicine 2022; 54.
56. Gruber MF. Current status of monkeypox vaccines. NPJ Vaccines 2022; 7(1): 94.
57. Owens LE. JYNNEOS vaccination coverage among persons at risk for mpox—United States, May 22, 2022–January 31, 2023. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2023; 72: 342-7.
58. Grosenbach DW, Jordan R, King DS, Berhanu A, Warren TK, Kirkwood-Watts DL, et al. Immune responses to the smallpox vaccine given in combination with ST-246, a small-molecule inhibitor of poxvirus dissemination. Vaccine 2008; 26(7): 933-46.
59. Cheng P, Gong W. In silico analysis of peptide-based biomarkers for the diagnosis and prevention of latent tuberculosis infection. Front Microbiol 2022; 13: 947852.
60. Mahapatra SR, Dey J, Kushwaha GS, Puhan P, Mohakud NK, Panda SK, et al. Immunoinformatic approach employing modeling and simulation to design a novel vaccine construct targeting MDR efflux pumps to confer wide protection against typhoidal Salmonella serovars. J Biomol Struct Dyn 2022; 40(22): 11809-21.
61. Beikzadeh B. Immunoinformatics design of multi-epitope vaccine using OmpA, OmpD and enterotoxin against non-typhoidal salmonellosis. BMC Bioinformatics 2023; 24(1): 63.
62. Maleki A, Russo G, Parasiliti Palumbo GA, Pappalardo F. In silico design of recombinant multi-epitope vaccine against influenza A virus. BMC Bioinformatics 2021; 22: 617.
63. Sarvmeili J, Baghban Kohnehrouz B, Gholizadeh A, Ofoghi H, Shanehbandi D. Introduction of an Efficient Multiepitopic Vaccine Against Different SARS-CoV-2 Strains: Reverse Vaccinology. Journal of Health and Biomedical Informatics 2023; 10(3): 269-93.
64. Sarvmeili J, Baghban Kohnehrouz B, Gholizadeh A, Shanehbandi D, Ofoghi H. Immunoinformatics design of a structural proteins driven multi-epitope candidate vaccine against different SARS-CoV-2 variants based on fynomer. Sci Rep 2024; 14(1): 10297.
65. He R, Yang X, Liu C, Chen X, Wang L, Xiao M, et al. Efficient control of chronic LCMV infection by a CD4 T cell epitope-based heterologous prime-boost vaccination in a murine model. Cell Mol Immunol 2018; 15(9): 815-26.
66. Jiang P, Cai Y, Chen J, Ye X, Mao S, Zhu S, et al. Evaluation of tandem Chlamydia trachomatis MOMP multi-epitopes vaccine in BALB/c mice model. Vaccine 2017; 35(23): 3096-103.
67. Lu I-N, Farinelle S, Sausy A, Muller CP. Identification of a CD4 T-cell epitope in the hemagglutinin stalk domain of pandemic H1N1 influenza virus and its antigen-driven TCR usage signature in BALB/c mice. Cell Mol Immunol 2017; 14(6): 511-20.
68. Hoque SF, Bappy MNI, Chowdhury AT, Parvez MSA, Ahmed F, Imran MAS, et al. Scrutinizing surface glycoproteins and poxin-schlafen protein to design a heterologous recombinant vaccine against monkeypox virus. bioRxiv 2020; 919332.
69. Sandrini A, Rolland JM, O’Hehir RE. Current developments for improving efficacy of allergy vaccines. Expert Rev Vaccines 2015; 14(8): 1073-87.
70. Jasenosky LD, Scriba TJ, Hanekom WA, Goldfeld AE. T cells and adaptive immunity to Mycobacterium tuberculosis in humans. Immunolo Rev 2015; 264(1): 74-87.
71. Papaleo E, Saladino G, Lambrughi M, Lindorff-Larsen K, Gervasio FL, Nussinov R. The role of protein loops and linkers in conformational dynamics and allostery. Chem Rev 2016; 116(11): 6391-423.
72. Marciani DJ. Vaccine adjuvants: role and mechanisms of action in vaccine immunogenicity. Drug Discov Today 2003; 8(20): 934-43.
73. Mizel SB, Bates JT. Flagellin as an adjuvant: cellular mechanisms and potential. J Immunol 2010; 185(10): 5677-82.
74. Lester SN, Li K. Toll-like receptors in antiviral innate immunity. J Mol Biol 2014; 426(6): 1246-64.
75. Mantegazza AR, Magalhaes JG, Amigorena S, Marks MS. Presentation of phagocytosed antigens by MHC class I and II. Traffic 2013; 14(2): 135-52.
76. Alakunle E, Kolawole D, Diaz-Canova D, Alele F, Adegboye O, Moens U, et al. A comprehensive review of monkeypox virus and mpox characteristics. Front Cell Infect Microbiol 2024; 14: 1360586.
77. Adcock SA, McCammon JA. Molecular dynamics: survey of methods for simulating the activity of proteins. Chem Rev 2006; 106(5): 1589-615.
78. Machado MR, Pantano S. Split the charge difference in two! A rule of thumb for adding proper amounts of ions in MD simulations. J Chem Theory Comput 2020; 16(3): 1367-72.
79. Pang J, Cui J-a, Hui J. The importance of immune responses in a model of hepatitis B virus. Nonlinear Dyn 2012; 67: 723-34.
80.  
ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
CAPTCHA
ارسال پیام به نویسنده مسئول

بازنشر اطلاعات
Creative Commons License این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است.

کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق

© 2025 CC BY-NC 4.0 | Journal of Rafsanjan University of Medical Sciences

Designed & Developed by : Yektaweb