جلد 19، شماره 5 - ( 5-1399 )                   جلد 19 شماره 5 صفحات 484-463 | برگشت به فهرست نسخه ها


XML English Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Sosani Gharibvand Z, Alizadeh Behbahani B, Noshad M, Jooyandeh H. Investigation of the Functional Groups of Bioactive Compounds, Radical Scavenging Potential, Antimicrobial Activity and Cytotoxic Effect of Callistemon Citrinus Aqueous Extract on Cell Line HT29: A Laboratory Study. JRUMS. 2020; 19 (5) :463-484
URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-5180-fa.html
سوسنی غریبوند زهره، علیزاده بهبهانی بهروز، نوشاد محمد، جوینده حسین. بررسی گروه‌های عاملی ترکیبات زیست‌فعال، توانایی رادیکال گیرندگی، فعالیت ضدمیکروبی و اثر سمیت سلولی عصاره آبی گیاه شیشه‌شور (Callistemon citrinus) بر رده سلولی HT29: یک مطالعه آزمایشگاهی. مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان. 1399; 19 (5) :484-463

URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-5180-fa.html


دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان
متن کامل [PDF 663 kb]   (409 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (971 مشاهده)
متن کامل:   (969 مشاهده)
مقاله پژوهشی
مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان
دوره 19، مرداد 1399، 484-463
 
بررسی گروه‏های عاملی ترکیبات زیست‏فعال، توانایی رادیکال گیرندگی، فعالیت ضدمیکروبی و اثر سمیت سلولی عصاره آبی گیاه شیشه‏شور (Callistemon citrinus) بر رده سلولی HT29:
 یک مطالعه آزمایشگاهی
 
زهره سوسنی غریبوند[1]، بهروز علیزاده بهبهانی[2]، محمد نوشاد[3]، حسین جوینده[4]
 
دریافت مقاله: 3/12/98   ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 20/3/99    دریافت اصلاحیه از نویسنده: 7/4/99           پذیرش مقاله: 15/4/99
 
 
 
چکیده
زمینه و هدف: کاربرد گسترده داروهای‏ شیمیایی جهت درمان و کنترل بیماری‌های مزمن و عفونی و هم­چنین سرطان‌ کولون سبب افزایش تقاضا برای مواد دارویی و نگه­دارنده طبیعی و ایمن شده است. بنابراین هدف از این پژوهش تعیین گروه‌های عاملی ترکیبات تشکیل دهنده، میزان فنول و فلاوونوئید کل، ﺗﻮاﻧﺎیﯽ رادیﮑﺎل ﮔﯿﺮﻧﺪﮔﯽ، فعالیت ضدمیکروبی و برهم­کنش عصاره آبی شیشه‌شور (Callistemon citrinus) با آنتی­بیوتیک­های رایج درمانی و اثر سمیت سلولی آن بر رده سلولی HT29 بود.
مواد و روش­ها: در این مطالعه آزمایشگاهی، حضور گروه‌های عاملی ترکیبات تشکیل دهنده عصاره آبی شیشه‌شور با کمک Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) بررسی گردید. ﺗﻮاﻧﺎیﯽ ﮔﯿﺮﻧﺪﮔﯽ رادیﮑﺎل­های آزاد، میزان فنول و فلاوونوئید کل، فعالیت ضدمیکروبی و برهم­کنش عصاره آبی شیشه‌شور با آنتی­بیوتیک­های کلرامفنیکل و جنتامایسین و میزان زنده ­مانی رده سلولی HT29 تحت غلظت‌های مختلف عصاره با آزمون MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 diphenyl tetrazolium bromide) بررسی شد. داده­ها با استفاده از آنالیز واریانس یک­طرفه و آزمون تعقیبی Duncan تجزیه و تحلیل شد.
یافته­ها: عصاره آبی شیشه‌شور فعالیت ضدمیکروبی قابل توجهی بر باکتری‌های اشرشیا کلی، سودوموناس ائروژینوزا، سالمونلا تیفی، استافیلوکوکوس اورئوس و لیستریا اینوکوا نشان داد. میزان مهارکنندگی رادیکال‌های آزاد در محدوده 33/51-68/71 درصد بود. وجود گروه­های C-C و OH ترکیبات پلی­فنولی عصاره توسط FTIR تأیید شد. غلظت‌های مختلف عصاره رشد سلول HT29 را نسبت به گروه کنترل بعد از 24 ساعت کاهش داد (05/0P<).
نتیجه­گیری: عصاره آبی شیشه‌شور دارای فعالیت ضدمیکروبی، پتانسیل آنتی­اکسیدانی و سمیت سلولی بر رده سلولی HT29 بود. بنابراین، استفاده از عصاره آبی شیشه­شور در صنایع داروسازی و غذایی پیشنهاد می­گردد.
واژه­های کلیدی: سمیت سلولی، حداقل غلظت مهارکنندگی، شرایط برون­تنی، عصاره آبی شیشه‌شور

 
 
 
مقدمه
یکی از مهم­ترین عوامل ایجاد کننده بیماری‌های مزمن، رادیکال‌های آزاد می­باشند. رادیکال‌های آزاد با ایجاد استرس اکسیداتیو می­توانند نقش خود را ایفاء کنند. مهم­ترین عامل جهت مهار و از بین بردن رادیکال‌های آزاد، آنتی­اکسیدان­ها هستند [2-1]. از جمله خواص آنتی­اکسیدان، کاهش خطر ابتلاء به سکته مغزی، بیماری‌های قلبی-عروقی و کاهش آسیب به دزوکسی ریبونوکلئیک اسید می­باشد. یکی از مهمترین منابع آنتی­اکسیدان­ها، گیاهان می­باشند [4-3]. متابولیت­های ثانویه­ای که توسط گیاهان تولید می­شود دارای فعالیت آنتی­اکسیدانی بوده و از آن‌ها می­توان به عنوان ترکیب دارویی استفاده کرد [6-5]. از جمله متابولیت­های ثانویه فعال گیاهی، پلی­فنول­ها می‌باشند که در قسمت­های مختلف گیاهان مانند برگ، میوه، دانه، ریشه و پوست وجود دارند [4]. فلاوونوئیدها و اسیدهای فنولی از مهم­ترین گروه­های پلیفنولی با خواص هورمونی، دارویی و آنتی­اکسیدانی میباشند [7].
از جمله بیماری‌های مهم که همواره گریبان­گیر انسان بوده، بیماری‌های عفونی می­باشد [8]. در این زمینه تلاش­های متعددی جهت تشخیص عوامل ایجاد­کننده، درمان و کنترل آن‌ها صورت گرفته است [9]. عمده­ترین مشکل جهت درمان بیماری‌های عفونی، مقاومت باکتری­ها در برابر آنتی­بیوتیک­ها و عوارض جانبی عوامل ضدمیکروبی شیمیایی می­باشد [8]. همین امر باعث شده تا گیاهان به عنوان مواد طبیعی، کم خطر، در دسترس و ارزان قیمت بودن نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها جهت درمان عفونت­های میکروبی رواج یابند [10]. ترکیبات ضد میکروبی و ترکیبات فنولی مانند اسیدهای فنولیک، فلاوونوئید، تانن و دی­ترپن­های فنولی موجود در گیاهان­ دارویی سبب شده استفاده از این گیاهان مورد توجه پژوهشگران قرار گیرد [11].
گیاه شیشه‌شور با نام علمی Callistemon citrinus از خانواده Myrtaceae می­باشد و شامل بیش از 30 گونه است [12]. این گیاه 5/0 تا 7 متر ارتفاع دارند که به صورت درخت یا درخت­چه­های چوبی معطر در نواحی استوایی مرطوب رشد می­کنند [13]. مقاومت در برابر خشکی، گرما، باد و زیبایی در زمان گلدهی از جمله دلایلی است که سبب شده از این گیاه در فضای سبز و حاشیه خیابان­ها در سطح وسیع استفاده شود [13]. در طب سنتی از برگ این درخت جهت درمان عفونتهای دستگاه گوارش نیز استفاده می­شود [14]. در جامائیکا از این گیاه جهت درمان بیماری‌های معده و روده، عفونت­های پوستی و اسهال به صورت چای داغ استفاده میشود [13]. علاوه بر این، فعالیت ضد سرطانی گیاه شیشه‌شور نیز مشخص شده است [16-15].
سرطان کولون به عنوان سومین علت مرگ و میر در دنیا مطرح می­باشد و پس از سرطان ریه، سرطان کولون به عنوان شایع­ترین نوع سرطان در مردان می­باشد [18-17]. این سرطان ابتدا به صورت خوش­خیم بوده و در صورت تشخیص به موقع با عمل جراحی کاملاً قابل درمان می‌باشد و در صورت عدم درمان به موقع به صورت آدنومای پیشرفته با درجه دیسپلازی بالا و سپس به شکل سرطان بدخیم تکامل پیدا می­کند [19]. روش­های درمان سرطان کولون شامل ترکیبی از شیمی درمانی، پرتو درمانی و جراحی می­باشد که پرهزینه و پیچیده می­باشد. به همین دلیل استفاده از گیاهان دارویی جهت مهار فرآیند تومورزایی و القاء آپوتیوز در سلول‌های سرطانی یک روش جدید جهت مبارزه با سرطان کولون میباشد که از مزایای این روش هزینه کمتر و اثر جانبی کمتر می­باشد [20]. در این مطالعه، فعالیت ضدسرطانی عصاره آبی گیاه شیشه‌شور بر رده سلولی HT29 بررسی شد که جزء سلول‌های سرطانی کولون انسان است و به­طور گسترده‌ای در مطالعات سرطان کولون مورد استفاده قرار می‌گیرد [21].
تاکنون پژوهش­های بسیار اندکی در مورد عصاره آبی گیاه شیشه‌شور انجام شده است [22 ،12]. لذا هدف از این پژوهش تعیین فعالیت ضدمیکروبی، برهم­کنش آن با آنتی­بیوتیک­های رایج درمانی، تعیین پتانسیل آنتی­اکسیدانی، شناسایی گروه‌های عاملی ترکیبات شیمیایی و تشخیص کیفی نوع پیوندها، تعیین میزان فنول و فلاوونوئید کل و در نهایت اثر سمیت سلولی عصاره آبی گیاه شیشه‌شور بر رده سلولی HT29 بود.
مواد و روش­ها
این مطالعه آزمایشگاهی در سال 1398 در آزمایشگاه میکروبیولوژی و شیمی گروه علوم و مهندسی صنایع غذایی، دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان انجام پذیرفت.
برگ­های تازه گیاه شیشه‌شور در خرداد ماه 1398 از محوطه دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان جمع­آوری شد. بعد از تأیید اسم علمی گیاه توسط مرکز هرباریوم دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان (کد هرباریوم KHAU302)، برگ­های جمع‏آوری شده توسط آب سرد به صورت سطحی مورد شست‌وشو قرار گرفت و سپس به مدت 5 روز در سایه خشک گردید.
جهت تهیه عصاره آبی گیاه شیشه‌شور، ابتدا برگ­های خشک شده گیاه توسط آسیاب آزمایشگاهی (T3800، توس شکن، ایران) پودر شد. گیاه پودر شده از الک آزمایشگاهی جهت یکنواخت شدن اندازه ذرات عبور داده شد. عمل عصارهگیری از گیاه با روش خیساندن انجام شد. در این روش 100 گرم از پودر برگ گیاه شیشه‌شور در 1000 میلی­لیتر آب مقطر مخلوط شد. مخلوط حاصل به مدت 72 ساعت روی دستگاه هم­زن مغناطیسی (RH Basic، IKA، آلمان) در دمای اتاق به آرامی هم­زده شد تا استخراج عصاره به صورت کامل انجام شود. مخلوط حاصل از پارچه توری تمیز عبور داده شد. عصاره اولیه به دست آمده با دور rpm 6000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ (K2042، Centurion، آمریکا) شد. پس از عمل سانتریفیوژ کردن عصاره اولیه گیاه شیشه‌شور، عصاره شفاف شده تحت عمل تغلیظ شدن (50 درجه سانتی‏گراد، 30 دقیقه) توسط دستگاه تقطیر در خلأ (روتاری) (Heidolph laborota 400، Heidolph Instruments، آلمان) قرار گرفت. در نهایت عصاره تغلیظ شده توسط دستگاه خشک‏کن انجمادی (Christ-Alpha 1–4، LD freeze dryer، آلمان) به طور کامل خشک شد. عصاره به دست آمده تا زمان انجام آزمون­های میکروبیولوژی و شیمیایی در ظروف درب بسته تمیز که اطراف آن با فویل آلومینیومی پیچیده شده بود در یخچال نگه­داری شد [11 ،4].
از آنالیز طیف‌سنجی فروسرخ تبدیل فوریه (Fourier-transform infrared spectroscopy; FTIR) برای تعیین گروه­های عاملی ترکیبات شیمیایی و شناسایی کیفی عصاره آبی گیاه شیشه‌شور استفاده شد. برای آماده‌سازی نمونه، ابتدا عصاره پودر شده با برمید پتاسیم (هیچ پیکی در طول‌موج مورد استفاده جهت شناسایی گروه­های عاملی عصاره ایجاد نمی­کند) مخلوط گردید. مخلوط حاصل جهت به دست آوردن قرص مناسب فشرده شد. طیف FTIR از عصاره در محدوده طول‌ موج cm-1 4000-500 و توسط دستگاه FTIR (Thermo Nicolet، مدلAvatar 370 ، ساخت آمریکا) ثبت شد [23].
از روش فولین سیوکالچو (Folin–Ciocalteu) برای تعیین میزان فنول کل عصاره آبی گیاه شیشه‏شور استفاده شد. جهت انجام آزمون، 1 میلی­لیتر از محلول عصاره 1/0 درصد با 5/2 میلی­لیتر از واکنش­گر فنول مخلوط شد. پس از گذشت مدت زمان 5 دقیقه، 5/2 میلی­لیتر کربنات سدیم 7 درصد به مخلوط اضافه شده و به مدت یک ساعت در دمای اتاق نگهداری شد. در نهایت میزان جذب با دستگاه اسپکتروفتومتر (Biochrom WPA Lightwave UV/VIS، S2000، انگلیس) در طول‌ موج 725 نانومتر خوانده شد و اعداد آن ثبت گردید. میزان کل ترکیبات فنولی موجود در عصاره آبی گیاه شیشه‌شور برحسب اسید گالیک و با استفاده از معادله حاصل از منحنی استاندارد محاسبه و نتایج برحسب گالیک اسید بیان گردید [24].
برای اندازه­گیری ترکیبات فلاوونوئیدی عصاره برگ گیاه شیشه‌شور از روش Zhishen و همکاران [25]، با کمی تغییر استفاده شد. مطابق با این روش، 1 میلی­لیتر از محلول عصاره برگ گیاه شیشه‌شور با 25/1 میلی­لیتر آب مقطر مخلوط شده و سپس به آن 75 میکرولیتر نیتریت سدیم 5 درصد افزوده شد. پس از گذشت 5 دقیقه، 150 میکرولیتر آلومینیوم تریکلرید 10 درصد به مخلوط اضافه شد. در نهایت 1 میلیلیتر سود اضافه گردید و پس از 5 دقیقه میزان جذب نمونه در طول‌ موج 510 نانومتر اندازه­گیری شد. از آب مقطر به عنوان شاهد استفاده شد. جهت رسم منحنی استاندارد از محلول کوئرستین استفاده شد [26].
در آزمون میزان مهار رادیکال‌های آزاد DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) ابتدا 1 میلی­لیتر از غلظت‌های مختلف عصاره آبی برگ گیاه شیشه‌شور با 3 میلی­لیتر از DPPH (Mm 1/0 در متانول) مخلوط شده و به مدت 30 دقیقه در دمای 25 درجه سانتی­گراد و در مکان تاریک قرار داده شد. میزان جذب نمونه­ها در برابر نمونه شاهد (آب) در طول‌موج 515 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره آبی گیاه شیشه‌شور برحسب درصد بازدارندگی بر اساس معادله ذیل محاسبه شد [24].
  
جهت ارزیابی فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره آبی گیاه شیشه‌شور با مهار رادیکال آزاد ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) ابتدا رادیکال‌های آزاد ABTS تهیه شد. برای این منظور ابتدا محلول آبی با غلظت 7 میلی مولار از ABTS تهیه شده و به محلول ساخته شده، پتاسیم پرسولفات اضافه شد تا غلظت نهایی آن به 45/2 میلی‌مولار برسد. محلول به دست آمده به مدت 16 ساعت در مکان تاریک و در دمای 25 درجه سانتی­گراد قرار داده شد. رقیق­سازی کاتیون رادیکال ABTS+ توسط متانول تا رسیدن جذب معرف به 02/0 ± 7/0 در طول‌موج 734 نانومتر انجام شد. در نهایت 300 میکرولیتر از غلظت‌های مختلف عصاره به 9/3 میلی­لیتر از محلول رادیکال ABTS اضافه و پس از گذشت 5 دقیقه، جذب آن در دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت و ثبت شد [24-23].
قبل از انجام آزمون­های میکروبیولوژی، عصاره خشک شده گیاه شیشه‌شور با استفاده از اشعه فرابنفش استریل شد. جهت تأیید عمل استریل شدن عصاره توسط اشعه فرابنفش، عصاره اشعه دیده به صورت سطحی بر سطح محیط کشت نوترینت آگار کشت داده شد. پس از 24 ساعت گرمخانه گذاری و عدم رشد هیچ کلنی میکروبی، استریل بودن عصاره آبی گیاه شیشه‌شور تأیید شد [8].
در این پژوهش از 2 سویه استاندارد گرم مثبت Listeria innocua ATCC 33090 و Staphylococcus aureus ATCC 25923، و 3 سویه استاندارد گرم منفی Salmonella typhi PTCC 1609، Escherichia coli ATCC 25992 وPseudomonas aeruginosa ATCC 27853 استفاده شد. جهت انجام هر آزمون کشت تازه تهیه گردید [27].
24 ساعت قبل از شروع آزمون­های ضدمیکروبی، تلقیح از کشت ذخیره به محیط کشت نوترینت آگار انجام شد. پس از گرمخانه گذاری (Model G25 & R25، New Brunswick Scientific، آمریکا) به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد، از کلنی تک ایجاد شده بر سطح پتری دیش توسط لوپ حلقه­ای استریل مقداری برداشته و به لوله آزمایش حاوی محلول رینگر استریل انتقال داده شد. کدورت سوسپانسیون میکروبی در اسپکتروفتومتر در طول‌موج 625 نانومتر اندازه‌گیری شد و تا زمانی که کدورت محلول با کدورت استاندارد نیم مک­فارلند برابر نشده، توسط محلول رینگر رقیق شد. در این حالت سوسپانسیون میکروبی حاوی colony forming unit/mL 108× 5/1 است [28، 11].
در روش ضدمیکروبی انتشار در آگار به کمک دیسک، ابتدا محیط کشت مولر هینتون آگار تهیه و به پتری­دیش­های استریل اضافه شد. یک لوپ از کشت پایه هر باکتری بر این محیط­ کشت داده شد. دیسک­های کاغذی (قطر 6 میلی­متر) با غلظت‌های 75/18، 5/37، 75 و 150 میلی­گرم بر میلی­لیتر عصاره تهیه و با آن آغشته شد و به کمک پنس استریل در سطح محیط کشت با فواصل معینی قرار داده شد. در هر پتری­دیش 3 دیسک قرار گرفت، 2 دیسک مربوط به غلظت­ها و یک دیسک نیز به عنوان شاهد (دیسک فاقد عصاره) بود. هم­چنین فعالیت ضد باکتریایی دیسک­های آنتی‌بیوتیک استاندارد شامل جنتامایسین و کلرامفنیکل در پتری­دیش­های جداگانه مورد ارزیابی قرار گرفت. در انتها پتری­دیش­های تلقیح شده در انکوباتور (Model G25 & R25، New Brunswick Scientific، آمریکا) با دمای 37 درجه سانتی­گراد قرار گرفت و پس از گذشت مدت زمان 24 ساعت قطر هاله عدم رشد در اطراف دیسک­ها با خط­کش برحسب میلی­متر اندازه‌گیری شد [29، 11].
در روش ضدمیکروبی انتشار در آگار به کمک چاهک، ابتدا با پیپت استریل چاهک­هایی روی محیط کشت مولر هینتون آگار به عمق 6 میلی­متر ایجاد شد. سوسپانسیون میکروبی با غلظت معادل نیم مک فارلند روی سطح محیط کشت با سوآپ پخش گردید. سپس از غلظت‌های مختلف عصاره (75/18، 5/37، 75 و150 میلی­گرم بر میلی­لیتر)، 50 میکرولیتر درون چاهک­ها ریخته شد. در هر پتری­دیش 3 چاهک ایجاد شد. 2 چاهک از غلظت‌های مختلف عصاره و یک چاهک به عنوان شاهد (فاقد عصاره) استفاده شد. در انتها پتری­دیش ها به مدت 24 ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجه قرار داده شد و قطر هاله عدم رشد در اطراف چاهک­ها با خط کش برحسب میلی­متر اندازه‌گیری شد [30 ،10].
آزمون تعیین کمترین غلظت مهارکنندگی (Minimum inhibitory concentration; MIC) و کمترین غلظت باکتریکش (Minimum bactericidal concentration; MBC) مطابق با مطالعه Alizadeh Behbahani و همکاران، انجام پذیرفت [31]. به طور خلاصه، 100 میکرولیتر از غلظت‌های مختلف عصاره (1، 2، 4، 8، 16، 32، 64، 128، 256 و 512 میلی­گرم بر میلی­لیتر) در پلیت 96 خانه استریل ریخته شد. 20 میکرولیتر سوسپانسیون میکروبی با کدورت نیم مک فارلند به هر چاهک اضافه شد. از محیط کشت حاوی باکتری و بدون عصاره به عنوان کنترل مثبت و از محیط کشت بدون باکتری حاوی عصاره به عنوان کنترل منفی استفاده شد. سپس میکروپلیت 96 خانه­ای در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت انکوبه شد. پس از گذشت مدت زمان گرمخانه­گذاری (24 ساعت) محلول تری‏فنیل تترازولیوم کلراید با غلظت 5 میلی­گرم بر میلی­لیتر به عنوان شاخص رنگی رشد باکتری تهیه و به هر خانه 10 میکرولیتر از این معرف افزوده شد. اولین چاهکی که بعد از 15 دقیقه گرمخانه گذاری مجدد تغییر رنگ قرمز یا ارغوانی در آن مشاهده نشد به عنوان MIC در نظر گرفته شد [31].
حداقل غلظت کشندگی عصاره برگ شیشه‌شور با توجه به نتایج به دست ­آمده از حداقل غلظت مهارکنندگی از رشد در آزمون قبل تعیین شد. 100 میکرولیتر از چاهک­هایی که باکتری در آن‌ها رشد نکرده بود (تغییر رنگ قرمز یا ارغوانی مشاهده نشد) توسط سمپلر برداشته و به محیط کشت مولر هینتون آگار منتقل شد. پتری دیش­های کشت داده شده در دمای 37 درجه سانتی­گراد به مدت 24 ساعت گرمخانه‏گذاری شد. اولین غلظتی از عصاره که مانع از رشد 9/99 درصد باکتری­ها شد (در سطح پتری‏دیش هیچ کلنی مشاهده نشد) به عنوان حداقل غلظت کشندگی تعیین گردید [32، 29].
برای ارزیابی برهم­کنش (هم‌افزایی یا کاهندگی) عصاره برگ شیشه‌شور در ترکیب با آنتی‌بیوتیک‌های کلرامفنیکل و جنتامایسین از غلظت تحت ­مهاری (Sub-MIC) استفاده شد. در این پژوهش از غلظت تحت ­مهاری که 2/1 غلظت حداقل غلظت مهارکنندگی بود استفاده شد. عصاره برگ شیشه‌شور به محیط مولر هینتون آگار اضافه شد و سوسپانسیون میکروبی معادل نیم مک فارلند بر سطح محیط کشت توسط سوآپ کشت داده شد و سپس دیسک‌های آنتی‌بیوتیک کلرامفنیکل و جنتامایسین روی سطح محیط کشت قرار داده شد و به مدت 24 ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجه قرار داده شد. پس از گذشت مدت زمان 24 ساعت، قطر هاله عدم رشد میکروبی توسط خط­کش اندازه‌گیری شده و برحسب میلی­متر گزارش شد [32].
جهت بررسی اثر سمیت سلولی عصاره برگ گیاه شیشه‌شور بر رده سلولی HT29 (شماره سلول IBRC C10097، مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران) از روش MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 diphenyl tetrazolium bromide) استفاده شد. این آزمون مطابق با مطالعه Alizadeh Behbahani و همکاران، انجام پذیرفت. به طور خلاصه بعد از رشد سلول­ها، میزان 105 سلول به هر چاهک اضافه گردید. سپس محیط کشت DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)، 200 میکرولیتر سرم جنینی گاو و غلظت‌های 1، 125/3، 25/6، 5/12، 25، 50، 100 و 200 میلی­گرم بر میلی­لیتر عصاره برگ شیشه‌شور به چاهک­ها اضافه شد. در انتها 30 میکرولیتر از محلول MTT به تمام چاهک­ها اضافه شده و صفحات به مدت 3 ساعت در انکوباتور دی‌اکسید کربن قرار گرفت. پس از حذف محیط، 200 میکرولیتر DMSO (Dimethyl sulfoxide) به هر چاهک اضافه شد و میزان جذب در طول‌موج 570 نانومتر با استفاده از دستگاه الایزا ریدر (ELX 808، Bio Tek Instruments، آمریکا) خوانده شد. با استفاده از سلول‌های کنترل منحنی زنده­مانی سلولی ترسیم گشت [23].
از نرم‌افزارSPSS نسخه 18 جهت آنالیز نتایج استفاده گردید. آزمون نرمالیته Shapiro-Wilk’s جهت تأیید نرمال بودن داده‏ها مورد استفاده قرار گرفت و توزیع فراوانی داده‏ها نرمال بود. نتایج به­صورت "انحراف معیار ± میانگین" سه تکرار گزارش شدند و از آنالیز واریانس یک­طرفه و آزمون تعقیبی Duncan برای تجزیه و تحلیل داده­ها استفاده شد. سطح معنی­داری در آزمون­ها 05/0 در نظر گرفته شد.
نتایج
نتایج ارزیابی فعالیت ضدباکتریایی عصاره آبی گیاه شیشه‌شور به روش دیسک دیفیوژن بر باکتری‌های بیماری‌زا در جدول 1، آورده شده است. نتایج نشان داد که با افزایش غلظت‌های عصاره آبی شیشه‏شور قطر هاله عدم رشد نیز افزایش یافت. به­طور کلی، حساس­ترین و مقاوم­ترین باکتری در برابر عصاره آبی گیاه شیشه‌شور به ترتیب استافیلوکوکوس اورئوس و اشرشیا کلی بود. مقایسه آماری نتایج نشان داد که میان غلظت‌های 75/18 و 5/37 میلی­گرم بر میلی­لیتر برای تمامی باکتری­ها اختلاف معنی­داری در سطح 5 درصد مشاهده نشد. با مقایسه دوتایی میان غلظت‌های 75 و 150 میلی­گرم بر میلی­لیتر مشخص گردید غلظت بالاتر عصاره اثر ضدمیکروبی قوی‏تری در برابر باکتری‌های اشرشیا کلی، سالمونلا تیفی و لیستریا اینوکوا نشان می‏دهد (05/0>P). لازم به ذکر است که اختلاف معنی‏داری بین اثر ضدمیکروبی غلظت‏های مذکور برای باکتری‌های سودوموناس ائروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس مشاهده نشد (05/0<P). مقایسه نتایج آماری بین غلظت‌های 5/37 و 75 میلی­گرم بر میلی­لیتر نشان داد که فعالیت ضدمیکروبی غلظت 75 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر عصاره آبی گیاه شیشه‌شور در برابر باکتری‌های اشرشیا کلی، سودوموناس ائروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس به­طور معنی­داری بالاتر از غلظت 5/37 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر بود (05/0>P). در غلظت ثابت عصاره، به استثناء غلظت 75 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر که در آن قطر هاله عدم رشد برای باکتری استافیلوکوکوس اورئوس به­طور معنی­داری بالاتر از سالمونلا تیفی بود، اختلاف معنی‏داری بین قطر هاله عدم رشد برای باکتری‏های مورد مطالعه مشاهده نشد (05/0<P)، با این­حال، به­طور کلی باکتری‏های گرم مثبت حساسیت بیشتری نسبت به عصاره آبی شیشه‏شور در مقایسه با انواع گرم منفی نشان دادند (جدول 1).
 
 
جدول 1- میانگین قطر هاله عدم رشد میکروبی (دیسک دیفیوژن) عصاره آبی شیشه‌شور بر باکتری‌های بیماری‌زا برحسب میلی‏متر
باکتری      غلظت (میلی­گرم بر میلی­لیتر)
75/18 5/37 75 150
اشرشیا کلی           10/7±58/0aA 70/7±50/0aA 60/9±57/0bAB 10/11±20/0cA
سودوموناس ائروژینوزا 00/8±29/0aA 80/8±43/0aA 40/10±29/0bAB 00/11±14/0bA
سالمونلا تیفی 10/8±58/0aA 60/8±52/0aA 00/9±44/0aB 20/11±14/0bA
استافیلوکوکوس اورئوس 20/8±37/0aA 10/9±50/0aA 80/10±35/0bA 90/11±20/0bA
لیستریا اینوکوا 10/8±30/0aA 80/8±26/0aA 50/9±50/0aAB 30/11±50/0bA
نتایج به­صورت "انحراف معیار ± میانگین" سه تکرار (n=3) گزارش شده اند و از آنالیز واریانس یک­طرفه و آزمون تعقیبی Duncan برای تجزیه و تحلیل داده­ها استفاده شده است.
حروف غیر مشابه کوچک در یک ردیف نشان­دهنده تفاوت معنی­دار در سطح معنی­داری 5 درصد میان غلظت­های مختلف عصاره آبی شیشه‏شور است (05/0>P).
حروف غیر مشابه بزرگ در یک ستون نشان­دهنده تفاوت معنی­دار در سطح معنی­داری 5 درصد میان باکتری‌های مختلف است (05/0>P).
 
 
جدول 2، نتایج فعالیت ضدمیکروبی عصاره آبی شیشه‏شور به روش چاهک آگار بر باکتری‌های عامل عفونت و مسمومیت را نشان می­دهد. نتایج نشان داد که باکتری استافیلوکوکوس اورئوس با قطر هاله 30/10 میلی­متر در کم­ترین غلظت (75/18 میلی­گرم بر میلی­لیتر) حساس­ترین بود. در غلظت‌های بالاتر اثر ضدمیکروبی بر باکتری‌های گرم منفی (سودوموناس ائروژینوزا و سالمونلا تیفی) به طور قابل توجهی افزایش یافت، به نحوی که در غلظت 150 میلی­گرم بر میلیلیتر برای باکتری‌های استافیلوکوکوس اورئوس و سالمونلا تیفی قطر هاله 10/14 میلی­متر مشاهده شد. مقایسه نتایج آماری میان غلظت‌های 75/18 و 5/37 میلی‌گرم بر میلی­لیتر نشان داد که برای باکتری‌های گرم منفی (اشرشیا کلی، سالمونلا تیفی و سودوموناس ائروژینوزا) هیچ اختلاف معنی­داری در سطح 5 درصد وجود ندارد (05/0<P)، در حالی که برای باکتری‌های گرم مثبت (استافیلوکوکوس اورئوس و لیستریا اینوکوا) اختلاف معنی‌داری مشاهده گردید (05/0>P). همان­طور که در جدول 2 نیز مشخص است در غلظت‌های 5/37 و 75 میلی­گرم بر میلی­لیتر عصاره آبی گیاه شیشه‌شور برای تمامی باکتری‌های گرم منفی اختلاف معنی­داری در سطح 5 درصد وجود داشت (05/0>P)، در حالی که برای باکتری‌های گرم مثبت اختلاف معنی­داری مشاهده نشد (05/0<P). در شکل 1، نمایی از فعالیت ضدباکتریایی عصاره آبی شیشه‏شور و آنتی­بیوتیک­های رایج درمانی بر باکتری اشرشیا کلی نشان داده شده است.
 
 
جدول 2- میانگین قطر هاله عدم رشد میکروبی (چاهک آگار) عصاره آبی شیشه‌شور بر باکتری‌های بیماری‌زا برحسب میلی‏متر
باکتری      غلظت (میلی­گرم بر میلی­لیتر)
75/18 5/37 75 150
اشرشیا کلی 20/8±19/0aB 70/9±23/0aB 10/10±27/0bC 20/11±33/0bB
سودوموناس ائروژینوزا 10/8±29/0aB 50/8±40/0aC 60/10±13/0bBC 00/13±68/0bAB
سالمونلا تیفی 30/8±37/0aB 50/8±12/0aC 50/11±64/0bABC 10/14±14/0cA
استافیلوکوکوس اورئوس 30/10±62/0aA 00/12±40/0bA 50/12±32/0bA 10/14±72/0bA
لیستریا اینوکوا 90/8±79/0aAB 50/11±35/0bA 90/11±50/0bAB 20/12±60/0bAB
نتایج به­صورت "انحراف معیار ± میانگین" سه تکرار (n=3) گزارش شده اند و از آنالیز واریانس یک­طرفه و آزمون تعقیبی Duncan برای تجزیه و تحلیل داده­ها استفاده شده است.
حروف غیر مشابه کوچک در یک ردیف نشان­دهنده تفاوت معنی­دار در سطح معنی­داری 5 درصد میان غلظت­های مختلف عصاره آبی شیشه‏شور است (05/0>P).
حروف غیر مشابه بزرگ در یک ستون نشان­دهنده تفاوت معنی­دار در سطح معنی­داری 5 درصد میان باکتری‌های مختلف است (05/0>P).
 

شکل 1- اثر ضدمیکروبی عصاره آبی شیشه‌شور و آنتی­بیوتیک­های رایج درمانی بر باکتری اشرشیا کلی
الف) اثر آنتی­بیوتیک کلرامفنیکل و جنتامایسین، ب) اثر عصاره به روش چاهک آگار و پ) اثر عصاره به روش دیسک دیفیوژن.
 
 
نتایج حداقل غلظت مهارکنندگی و حداقل غلظت کشندگی عصاره آبی شیشه‏شور برای باکتری‌های بیماری‌زا در جدول 3، آورده شده است. نتایج نشان داد که حداقل غلظت مهارکنندگی برای باکتری‌های اشرشیا کلی، سودوموناس ائروژینوزا، سالمونلا تیفی، استافیلوکوکوس اورئوس و لیستریا اینوکوا به ترتیب 8، 8، 16، 4 و 8 میلی‌گرم بر میلی­لیتر بود. در شکل 2، نمایی از اثر عصاره آبی گیاه شیشه‌شور به روش میکرودایلوشن براث (تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی) نشان داده شده است. نتایج حداقل غلظت کشندگی نیز بزرگتر از حداقل غلظت مهارکنندگی بود.
 
جدول 3- حداقل غلظت مهارکنندگی و حداقل غلظت کشندگی عصاره آبی شیشه‌شور بر باکتری‌های بیماری‌زا
باکتری MIC (میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) MBC (میلی‌گرم بر میلی‌لیتر)
اشرشیا کلی 8 512<
سودوموناس ائروژینوزا 8 512<
سالمونلا تیفی 16 512<
استافیلوکوکوس اورئوس 4 512
لیستریا اینوکوا 8 512
MIC= Minimum inhibitory concentration
MBC= Minimum bactericidal concentration
 

شکل 2- نمایی از تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی عصاره آبی گیاه شیشه‌شور به روش میکرودایلوشن براث
 
 
نتایج اثر آنتی­بیوتیک­های کلرامفنیکل و جنتامایسین و هم­چنین برهم­کنش عصاره آبی گیاه شیشه‌شور با آنتیبیوتیک­های مذکور در جدول 4، آورده شده است. نتایج نشان داد که آنتی­بیوتیک کلرامفنیکل با قطر 30/24 میلی‌متر بالاترین اثر را بر باکتری گرم منفی اشرشیاکلی داشت. بیشترین اثر ضدمیکروبی آنتیبیوتیک جنتامایسین بر باکتری گرم مثبت لیستریا اینوکوا مشاهده شد. نتایج حاصل از برهمکنش عصاره آبی شیشه‏شور با آنتی­بیوتیک کلرامفنیکل برای باکتری‌های اشرشیا کلی، سودوموناس ائروژینوزا، سالمونلا تیفی، استافیلوکوکوس اورئوس و لیستریا اینوکوا به ترتیب حالت سینرژیستی، سینرژیستی، سینرژیستی، سینرژیستی و آنتاگونیستی بود. به­طور کلی می­توان بیان کرد که ترکیب عصاره آبی شیشه‏شور با آنتی‌بیوتیک­های رایج درمانی به‌ویژه برای باکتری‌های گرم منفی که معمولاً از مقاومت بالاتری نسبت به باکتری‌های گرم مثبت برخوردارند می­تواند باعث افزایش اثر ضدباکتریایی گردد.
میزان فنول کل و فلاوونوئید عصاره آبی شیشه‏شور به ترتیب 17/102 میلی­گرم گالیک اسید بر گرم وزن خشک و 95/44 میلی­گرم کوئرستین بر گرم وزن خشک بود. نتایج بررسی ظرفیت آنتی­اکسیدانی عصاره آبی شیشه‏شور در جدول 5، آورده شده است. نتایج نشان داد که میزان درصد مهارکنندگی رادیکال‌های آزاد با افزایش غلظت عصاره افزایش پیدا کرد. میزان درصد مهارکنندگی رادیکال‌های آزاد با استفاده از DPPH و ABTS در غلظت 125 میلی­گرم بر میلیلیتر به ترتیب 68/71 و 33/51 بود.
 
جدول 4- اثر آنتی‌بیوتیک‌های کلرامفنیکل و جنتامایسین به تنهایی و توام (برهم­کنش) با عصاره آبی شیشه‌شور بر باکتری‌های بیماری‌زا (میانگین قطر هاله عدم رشد میکروبی برحسب میلی‌متر)
باکتری ماده ضدمیکروب
کلرامفنیکل جنتامایسین کلرامفنیکل + عصاره جنتامایسین + عصاره
اشرشیا کلی 30/24±57/0a 25/18±44/0c 50/31±59/0a 30/22±41/0a
سودوموناس ائروژینوزا 10/18±15/0c 50/20±38/0b 50/22±18/0c 80/22±62/0a
سالمونلا تیفی 40/18±66/0c 50/18±81/0c 40/20±86/0d 00/20±54/0b
استافیلوکوکوس اورئوس 20/20±32/0b 40/24±78/0a 10/26±27/0b 20/20±77/0b
لیستریا اینوکوا 00/18±72/0c 50/24±37/0a 30/10±66/0e 10/20±46/0b
نتایج به­صورت "انحراف معیار ± میانگین" سه تکرار (n=3) گزارش شده اند و از آنالیز واریانس یک­طرفه و آزمون تعقیبی Duncan برای تجزیه و تحلیل داده­ها استفاده شده است.
حروف غیر مشابه در یک ستون نشان­دهنده تفاوت معنی­دار در سطح معنی­داری 5 درصد میان غلظت­های مختلف عصاره آبی شیشه‏شور است.
 
جدول 5- بررسی فعالیت آنتی‌اکسیدانی عصاره آبی شیشه‌شور بر رادیکال‌های آزاد DPPH و ABTS
غلظت عصاره (میلی­گرم بر میلی­لیتر) فعالیت مهارکنندگی (درصد)
DPPH ABTS
25 d42/0 ± 45/39 e28/0 ± 50/5
50 c32/0 ± 16/56 d43/0 ± 23/14
75 c80/0 ± 90/57 c69/0 ± 01/32
100 b15/0 ± 15/68 b68/0 ± 14/38
125 a55/0 ± 68/71 a89/0 ± 33/51
نتایج به­صورت "انحراف معیار ± میانگین" سه تکرار (n=3) گزارش شده اند و از آنالیز واریانس یک­طرفه و آزمون تعقیبی Duncan برای تجزیه و تحلیل داده­ها استفاده شده است.
حروف غیر مشابه در یک ستون نشان­دهنده تفاوت معنی­دار در سطح معنی­داری 5 درصد میان غلظت­های مختلف عصاره آبی شیشه‌شور است.
 
 
یکی از متداول­ترین روش­های ارزیابی ساختار ترکیبات آلی، استفاده از طیف‌سنجی زیر قرمز است. شکل 3، طیف FTIR عصاره آبی گیاه شیشه‌شور را نشان می­دهد. نتایج نشان داد که نوار پهن به مرکزیت cm-1 3406 به دلیل وجود گروههای هیدروکسیل و گستره­ عدد موج cm-1 3000-2800 به دلیل وجود پیوندهای ­C-H گروه­های متیل در ساختار عصاره بود. حضور پیوند کششی C=O (گروه کربوکسیل) باعث ایجاد پیک در گستره عدد موج cm-1 1700-1600 در طیف است. وجود پیک در گستره­ی cm-1 1500-1400 نشان دهنده وجود گروه‌های C-C در حلقه آروماتیک ترکیبات پلی فنولی و گروه­های OH موجود در ترکیبات فنولی در ساختار عصاره بود. وجود پیک­ها در طول‌موج 1023-106 احتمالاً به دلیل ارتعاشات کششی C-O در نمونه بود.
 
 

شکل 3- طیف FTIR عصاره آبی گیاه شیشه‌شور
 
 
نتایج مربوط به آزمون سمیت سلولی و اثر غلظت‌های مختلف عصاره آبی گیاه شیشه‌شور بر رده سلولی HT29 در شکل 4، نشان داده شده است. برای تعیین سمیت سلولی عصاره آبی گیاه شیشه‌شور از غلظت‌های 1، 125/3، 25/6، 5/12، 25، 50، 100 و 200 میلی­گرم بر میلی­لیتر استفاده گردید. درصد زنده­مانی سلول‌های HT29 در غلظت‌های مذکور به ترتیب 100، 33/59، 12/50، 66/47، 24/29، 65/18، 86/10 و 12/6 بود. بر اساس نتایج مشاهده شده، با افزایش غلظت عصاره آبی گیاه شیشه‌شور، تأثیر بر رده سلولی HT29 افزایش پیدا کرد و درصد زنده­مانی آن کاهش یافت. بیش­ترین اثر سمیت سلولی عصاره آبی شیشه‏شور در غلظت 200 میلی­گرم بر میلی­لیتر و در مقابل کم­ترین اثر آن در غلظت 1 میلی­گرم بر میلی­لیتر مشاهده گردید.
 
 

­شکل 4- اثر غلظت‌های مختلف عصاره آبی شیشه‌شور بر زنده‌مانی رده سلولی HT29
 
 
بحث
با توجه به مقاومت میکروارگانیسم­های بیماری‌زا نسبت به آنتی­بیوتیک­های رایج درمانی، یافتن ترکیبات ضدمیکروبی جدید با کم­ترین اثر جانبی بسیار حائز اهمیت است. در این پژوهش آزمایشگاهی فعالیت ضدمیکروبی، ظرفیت آنتیاکسیدانی، ترکیبات فنولی و فلاوونوئید کل، ساختار شیمیایی و اثر سمیت سلولی عصاره آبی گیاه شیشه‌شور مورد بررسی قرار گرفت.
با توجه به نتایج به دست آمده از آزمون ضد میکروبی عصاره آبی گیاه شیشه‌شور (جداول 1، 2، 3 و 4) مشخص شد که عصاره آبی گیاه شیشه‌شور به خوبی توانست در غلظت‌های مورد بررسی از رشد باکتری‌های بیماری‌زا به‌ویژه باکتری‌های گرم مثبت جلوگیری کند. فعالیت ضد میکروبی اسانس و عصاره‌های آبی و الکلی گیاه شیشه‌شور در مطالعات مختلف گزارش شده است. با مطالعه‏ اثر ضدمیکروبی اسانس گیاه شیشه‌شور بر تعدادی از باکتری‌های گرم مثبت و منفی، Oyedeji و همکاران گزارش نمودند که سویه استافیلوکوکوس اورئوس نسبت به اسانس شیشه‌شور حساس­ترین بود که این اثر ضد میکروبی به ترکیبات اصلی تشکیل دهنده اسانس از قبیل 8 و 1-سینئول (2/83 درصد)، آلفا پینن (4/6 درصد) و آلفا تریپنئول (9/4 درصد) نسبت داده شد [33]. نتایج حاکی از آن است که سویه اشرشیا کلی مقاوم­ترین سویه در برابر عصاره آبی شیشه‌شور بود. چنین نتیجه‌ای در خصوص بررسی اثر عصاره اتانولی و متانولی گیاه شیشه‌شور توسط Seyydnejad و همکاران بر فعالیت ضد­میکروبی عصاره­های الکلی شیشه‌شور گزارش شده است. نتایج این محققین نشان داد که عصاره اتانولی و متانولی گیاه شیشه‌شور دارای فعالیت ضد میکروبی در برابر میکروارگانیسم­های مورد بررسی (باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی) بود. به­طوری­که فعالیت ضدباکتریایی عصاره­های الکلی شیشه‌شور با اثر آنتی­بیوتیکی استاندارد قابل مقایسه بود [22]. اثر ضد میکروبی بالاتر عصاره آبی گیاه شیشه‌شور در برابر باکتری‌های گرم مثبت نسبت به باکتری‌های گرم منفی به تفاوت در غشاء و دیواره سلولی این باکتری­ها نسبت داده می­شود، به­طوری­که باکتری‌های گرم مثبت دارای لایه موکوپپتیدی ضخیم‌تری در دیواره سلولی خود می­باشند، درحالی­که این لایه در باکتری‌های گرم منفی نازک­تر است و ساختار سلولی آن‌ها اغلب متشکل از لیپوپروتئین و لیپوپلی­ساکارید می­باشد که منجر به مقاومت بیشتر باکتری نسبت به ترکیبات ضد میکروبی می­گردد [34]. جهت تأیید این فرضیه، انجام آزمون‌های تکمیلی از قبیل بررسی ویژگی‌های مورفولوژیکی سلول باکتری توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی و اندازه‌گیری میزان خروج گلوکز، لاکتات دهیدروژناز و پروتئین از سلول‌های باکتریایی پیشنهاد می‌گردد. علاوه براین، ترکیبات اصلی تشکیل دهنده عصاره آبی شیشه‏شور بایستی توسط دستگاه کروماتوگرافی گازی متصل به طیف‏سنج جرمی شناسایی و تعیین مقدار گردند. با جداسازی و خالص‏سازی این ترکیبات و بررسی فعالیت ضد میکروبی آن‏ها می‏توان به طور دقیق‏تری در مورد ساز و کار ضدمیکروبی عصاره آبی شیشه‏شور بحث نمود. با این­حال، با مقایسه اثر ضد میکروبی عصاره‌های آبی، اتانولی و کلروفرمی برگ گیاه شیشه‌شور،Krishna و همکاران گزارش نمودند که عصاره کلروفرمی دارای بالاترین اثر ضدمیکروبی بود و عصاره آبی فاقد فعالیت ضدمیکروبی بر باکتری‌های باسیلوس سوبتلیس، باسیلوس پومیلیس و اشرشیا کلی بود [35]. به طور کلی شاید بتوان دلیل اختلاف بین نتایج مطالعه­های مختلف انجام شده در جهان را به عوامل مختلفی همانند گونه گیاه، شرایط کشت، نوع خاک، شرایط آب و هوایی، نوع عصاره­گیری و حلال­های مورد استفاده جهت عصاره­گیری نسبت داد [32-31].
آنتی‌اکسیدان‌ها نقش اساسی در کنترل و درمان بیماری‌ها دارند و فلاوونوئیدها و ترکیبات فنولی به­عنوان منابع طبیعی آنتی‌اکسیدانی موجود در گیاهان دارویی شناخته می‌شوند [36]. ترکیبات فلاوونوئیدی متعددی از قبیل callistine A، 6,7-dimethyl-5,7-dihydroxy-4'-methoxy flavone، astragalin، quercetin، catechin، eucalyptin و 8-demethyleucalyptin در ساقه و برگ گیاه شیشه‌شور شناسایی شده‌اند [37]. از دیگر ترکیبات فنولی شناسایی شده در گیاه شیشه‌شور می‌توان به blumenol A، n-tetratriacontanol، gallic acid، methyl gallate، protocatechuic acid، β-sitosterol و 2,6,10-bisabolatriene اشاره نمود [38]. محتوای فنول و فلاوونوئید کل عصاره آبی شیشه‌شور به ترتیب 17/102 میلی­گرم گالیک اسید و 95/44 میلی­گرم کوئرستین بر گرم وزن خشک بود. محتوای فنول کل از 30/123 تا 85/548 میلی‌گرم گالیک اسید بر گرم عصاره‏های الکلی خشک برگ شیشه‌شور در مطالعه Saad و همکاران گزارش شده است [39]. در مطالعه‌ای دیگر، مشخص گردید که عصاره متانولی شیشه‌شور دارای میزان فنول کل (11/225 در برابر 64/109 میلی‌گرم گالیک اسید بر گرم عصاره) و فلاوونوئید کل (88/6 در برابر 68/3 میلی‌گرم روتین بر گرم عصاره) بالاتری نسبت به عصاره اتیل استات است که دلیل این امر به اثر حلال بر محتوای ترکیبات فنولی هنگام استخراج نسبت داده شد [40]. میزان فنول کل حدود 100 میلی‌گرم گالیک اسید بر گرم و فلاوونوئید کل حدود 25 میلی‌گرم کوئرستین بر گرم عصاره آبی برگ شیشه‌شور در مطالعه Ahmed و Rahman گزارش گردید [41]. تفاوت در میزان فنول و فلاوونوئید کل در این مطالعه با سایر مطالعات به شرایط مختلف آب و هوایی و جغرافیایی محل رشد گیاه از قبیل نوع خاک، میزان آب و ارتفاع محیط و هم­چنین روش‌های مختلف اندازه‌گیری و بیان نتایج این دو ترکیب وابسته می‌باشد [42]. بنابراین، شناسایی و اندازه‏گیری ترکیبات فنولی و فلاوونوئیدی عصاره آبی شیشه‏شور توسط روش‏های تجزیه‏ای دقیق‏تر از قبیل کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا پیشنهاد می‏گردد.
رادیکال‌های آزاد سبب تغییر عملکرد طبیعی ماکرومولکول‌های سلولی مانند کربوهیدرات‌ها، پروتئین‌ها، لیپیدها و نوکلئیک اسیدها و در نهایت تسریع صدمات التهابی، آب‌مروارید، سرطان، پیری و سایر بیماری‌های وابسته می‌شوند [43]. بنابراین، دریافت مقادیر کافی ترکیبات آنتی‌اکسیدانی جهت جلوگیری و درمان این اختلالات ضروری می‌باشد. ترکیبات فلاوونوئیدی و فنولی نقش مهمی در فعالیت آنتی‌اکسیدانی گیاهان دارویی ایفاء می‌کنند. فعالیت آنتی‌اکسیدانی عصاره آبی شیشه‌شور وابسته به غلظت بود و غلظت‌های بالاتر قدرت مهارکنندگی قوی‌تری در برابر رادیکال‌های آزاد نشان دادند. قابلیت اسانس شیشه‌شور در مهار رادیکال آزاد DPPH به­صورت تابعی از غلظت اسانس در مطالعه ‌Abdelhady و همکارش نشان داده شده است، به طوری­که بالاترین درصد مهارکنندگی (1/91 درصد) در غلظت 1000 میکروگرم در میلی‌لیتر اسانس به­دست آمد [44]. با مطالعه‌ عالیت آنتی‌اکسیدانی عصاره متانولی گل، برگ و ساقه شیشه‌شور بر پایه روش آنتی‌اکسیدانی DPPH، Jamzad و همکاران گزارش نمودند که بالاترین فعالیت آنتی‌اکسیدانی (32/93 درصد) در عصاره حاصل از گل‌های گیاه به­دست آمد و درصد مهارکنندگی رادیکال عصاره متانولی برگ و ساقه گیاه به ترتیب 11/64 و 17/44 درصد بود [45]. در مطالعه‌ای دیگر، فعالیت آنتی­اکسیدانی (مهار رادیکال‌های آزاد DPPH و ABTS) عصاره اتیل­استات و متانول شیشه‌شور مورد بررسی قرار گرفت. نتایج پتانسیل آنتی­اکسیدانی نشان داد که IC50 عصاره اتیل­استات (25/0 ± 41/2 میلی­گرم بر میلی­لیتر) کمتر از عصاره متانولی (24/0 ± 33/1 میلی­گرم بر میلی­لیتر) در روش DPPH بود. هم­چنین در روش ABTS نیز IC50 عصاره اتیل­استات و متانولی به ترتیب 36/0 ± 80/0 و 52/0 ± 52/0 میلی­گرم بر میلی­لیتر بود [40]. مقایسه نتایج این پژوهش­گران با مطالعه حاضر نشان می­دهد که اختلاف میان اعداد گزارش شده برای پتانسیل آنتی‌اکسیدانی ممکن است ناشی از شرایط کشت گیاه، شرایط آب و هوایی، زمان جمع‌آوری گیاه و هم­چنین نوع حلال مورد استفاده و روش اندازه­گیری فعالیت آنتی‌اکسیدانی باشد [48-46]. فعالیت آنتی‌اکسیدانی عصاره آبی گیاه شیشه‌شور عمدتاً ناشی از ترکیبات فنولی و فلاوونوئیدی آن است، به­طوری­که حضور کشش پیوند O-H الکل/فنول، C-H آلکیل و C=O آلدئید، کتون، استر و کربوکسیلیک اسید در طیف FTIR عصاره آبی شیشه‌شور تأیید گردید [49]. با این­حال، مطالعات بیشتری جهت شناسایی ترکیبات مسئول فعالیت آنتی‌اکسیدانی عصاره آبی این گیاه نیاز می‌باشد. علاوه براین، ترکیبات زیست فعال گیاهان دارویی دارای جنبه‌های واکنش‏پذیری پیچیده‌ای می‌باشند و بنابراین پیشنهاد می‏شود که آزمون‏های آنتی‌اکسیدانی مختلفی جهت تعیین و صحت فعالیت آنتی‌اکسیدانی اسانس‌های گیاهی استفاده گردند. دو آزمون آنتی‏اکسیدانی استفاده شده در این مطالعه بر پایه اهداء هیدروژن از عصاره آبی شیشه‏شور به رادیکال‏های آزاد DPPH و ABTS استوار می‏باشند و بنابراین پیشنهاد می‏شود که از سایر روش‏های آنتی‏اکسیدانی برپایه اهداء الکترون (مانند قدرت کاهندگی) و شلاته کنندگی (شلاته کردن فلزات واسطه) جهت بررسی فعالیت آنتی‏اکسیدانی عصاره آبی شیشه‏شور استفاده شود.
ترکیبات فنولی و فلاوونوئیدی فعالیت ضد سرطانی قابل توجهی نشان می‌دهند. نتایج حاکی از آن است که با افزایش غلظت عصاره آبی گیاه شیشه‌شور، تأثیر بر رده سلولی سرطانی HT29 افزایش پیدا کرد و درصد زنده ­مانی آن کاهش یافت. در راستای نتایج این مطالعه، سمیت سلولی اسانس برگ و گل گیاه شیشه‌شور در برابر سرطان ریه انسان (A549)، گلیومای موش (6-C)، سرطان روده بزرگ انسان (Colo-205) و سرطان دهانه رحم (siHa) توسطKumar و همکاران بررسی گردید. مطابق نتایج این محققین، سمیت سلولی وابسته به غلظت اسانس گل و برگ بود و بالاترین فعالیت سمیت سلولی در برابر سلول‌های A594 و C-6 مشاهده شد. اما اثرات اسانس بر سلول‌های SiHa و Colo-205 ناچیز بود [16]. اثر سمیت سلولی قابل توجه عصاره‌های الکلی و آبی برگ شیشه‌شور در برابر سلول‌های سرطانی در مطالعهSaad و همکاران نیز گزارش شده است [39]. علاوه بر این، غلظت پایین متیل اوژنول (ترکیب زیست فعال گیاه شیشه‌شور) دارای اثر ضد توموری در برابر سرطان سینه است، اما غلظت‌های بالای آن منجر به ایجاد جهش در دزوکسی ریبونوکلئیک اسید و متعاقباً افزایش حساست به سرطان کبد می‌شود [44]. بنابراین، گیاه شیشه‌شور حاوی ترکیبات زیست فعالی است که در غلظت‌های مشخص قادر به ایجاد فعالیت ضدسرطانی می‌باشند. در حقیقت، ترکیبات فنولی اثر ضدسرطانی خود را از طریق جلوگیری از آنزیم‌های متابولیک دخیل در فعال‌سازی عوامل سرطان­زا و یا توقف سیکل سلول سرطانی بروز می‌دهند [44]. لازم به ذکر است که در آزمون MTT، ترکیب تترازولیوم توسط آنزیم دهیدروژناز میتوکندری سلول زنده به فورمازان ارغوانی رنگ احیاء می‏شود که مقدار فورمازان تولیدی با اندازه گیری جذب محلول در 570 نانومتر تعیین می‏گردد [50]. بنابراین، ترکیبات احیاء کننده مانند پلی فنول‏ها قادر به احیاء کردن تترازولیوم به فورمازان و تداخل در این آزمون می‏باشند. در این راستا، پیشنهاد می‏شود که از آزمون‏های تکمیلی از قبیل زنده‏مانی سلول بر پایه ATP (Adenosine triphosphate) و ارزیابی ریزساختار سلول توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی جهت تأیید فعالیت ضدسرطانی عصاره‏های گیاهی غنی از ترکیبات فنولی استفاده گردد.
نتیجه­گیری
نتایج فعالیت ضد باکتریایی عصاره آبی برگ شیشه‌شور نشان داد که فعالیت ضد میکروبی بر باکتری‌های گرم مثبت بیشتر از باکتری‌های گرم منفی بود. با این­حال با توجه به نتایج به­دست آمده از برهم­کنش عصاره با آنتی­بیوتیک­های کلرامفنیکل و جنتامایسین و افزایش اثر ضد میکروبی (اثر سینرژیستی) به‌ویژه بر باکتری‌های گرم منفی پیشنهاد میشود به طور هم­زمان از ترکیب آنتی­بیوتیک و عصاره آبی شیشه‌شور استفاده شود. نتایج پژوهش حاضر نشان داد که عصاره آبی برگ شیشه‌شور از پتانسیل آنتی­اکسیدانی بالایی برخوردار است. با توجه به نتایج فعالیت آنتی­اکسیدانی و فنول کل عصاره و هم­چنین اثر سمیت سلولی عصاره بر رده سلولی HT29 به نظر می­آید بتوان از پتانسیل بالقوه این گیاه در پیش­گیری و درمان بیماری­ استفاده نمود. هرچند لازم است در ادامه پژوهش­های بیشتری در شرایط مختلف (آزمایشگاهی و مدل حیوانی) انجام گیرد.
تشکر و قدردانی
مقاله حاضر مستخرج از پایان‌نامه کارشناسی ارشد می­باشد، لذا نویسندگان مقاله بر خود لازم می­دانند از معاونت پژوهشی و فناوری دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان به دلیل حمایتهای مادی و معنوی صمیمانه تشکر و قدردانی نمایند.
.
 
 
References
 
 
 
  1. Minadipour MM, Sharifi, A. Evaluation of chemical composition and antioxidant activity of Cydonia Oblonga extract. Innov Food Sci Technol 2019; 10(1): 109-19. [Farsi]
  2. Lobo V, Patil A, Phatak A, Chandra N. Free radicals, antioxidants and functional foods: Impact on human health. Phco Rev 2010; 4(8): 118-26.
  3. Azadedel S, Hanachi P, Saboora A. Investigation on antioxidant activity of pistachio (Pistacia vera L.) skin extraction. J Plant Res 2018; 30(4): 722-31. [Farsi]
  4. Mirzaei A, Mohammadi J, Mirzaei N, Mirzaei M. The antioxidant capacities and total phenolic contents of some medicinal plants in Iran. J Fasa Univ Med Sci 2011; 1(3): 160-7. [Farsi]
  5. Jafari N, Naderi P, Ebrahimzadeh MA. Evaluation of phenolic content, total flavonoid and survey of antioxidant activity of leaves of Ficus carica and Pterocarya fraxinifolia trees using spectrophotometry and high-performance liquid chromatograph methods. Iran J Plant Biol 2015; 7(25): 1-16. [Farsi]
  6. Kiarostami Kh, Mosafa N. The study of antioxidant properties of Lavandula angustifolia in tissue culture. J Plant Res 2016; 28(4): 835-43. [Farsi]
  7. Salmanian SH, Sadeghi Mahoonak AR, KHomeiri M, Masteri Farahani MR. Phenolic acid content, antiradical and antimicrobial properties of Mentha aquatic leaf methanolic extract. Iran J Nutr Sci Food Technol 2013; 7(2): 145-54. [Farsi]
  8. Pedram Nia A, Mortazavi A, Nemat Shahi MM. Study of chemical compounds and the antimicrobial effects of leaf extract of Laurus nobilis L on various microbial strains. Food Sci Technol 2018; 15(81): 217-26. [Farsi]
  9. Majnouni MB, Ebiri R, Adibi H. Study of antimicrobial effects of Trigonella Foenum hydro-alcoholic extract on different bacterial strains. Med Lab J 2009; 3(1): 32-35. [Farsi]
  10. Mobaiyen H, Jafari Sales A, Sayyahi J. Evaluating Antimicrobial effects of centaurea plant’s essential oil on pathogenic bacteria: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, and Escherichia coli isolated from clinical specimens. J Fasa Univ Med Sci 2016; 5(4): 479-87. [Farsi]
  11. Alizadeh Behbahani B, Tabatabaei Yazdi F, Shahidi F, Mohebbi M, Vasiee A. Antimicrobial effect aqueous and ethanolic extract of Avicennia marina on microorganisms the infection and intoxication in vitro. J North Khorasan Univ Med Sci 2014; 6(1): 99-109. [Farsi]
  12. Cock I. Antimicrobial activity of Callistemon citrinus and Callistemon salignus methanolic extracts. Phcog Commn 2012; 2(3): 50-57.
  13. Ashraf Mansuri SJA, Ramezanian M. Comparing the effect of methanolic and aquatic extract of Callistemon viminalis (SOl. Ex Gaertn.) G. Don with amphotericin B and their synergistic effects. J Fasa Univ Med Sci 2017; 7(1): 86-93. [Farsi]
  14. Larayetan RA, Okoh OO, Sadimenko A, Okoh AI. Terpene constituents of the aerial parts, phenolic content, antibacterial potential, free radical scavenging and antioxidant activity of Callistemon citrinus (Curtis) Skeels (Myrtaceae) from Eastern Cape Province of South Africa. BMC Complement Altern Med 2017; 17(1): 292.
  15. Sampath S, Veeramani V, Krishnakumar GS, Sivalingam U, Madurai SL, Chellan R. Evaluation of in vitro anticancer activity of 1, 8-Cineole–containing n-hexane extract of Callistemon citrinus (Curtis) Skeels plant and its apoptotic potential. Biomed Pharmacother 2017; 93: 296-307.
  16. Kumar D, Sukapaka M, Babu GDK, Padwad Y. Chemical composition and in vitro cytotoxicity of essential oils from leaves and flowers of Callistemon citrinus from western Himalayas. Plos One 2015; 10(8): e0133823.
  17. Mirzaei R, Mirzaei H, Alikhani MY, Sholeh M, Arabestani MR, Saidijam M, et al. Bacterial biofilm in colorectal cancer: What is the real mechanism of action?. Microb Pathogenesis 2020; 142: 104052.
  18. International Agency for Research on Cancer. Cancer Fact Sheets. Available online: http://gco.iarc.fr/today/factsheets-cancers. Last access: July 4, 2019.
  19. Dalali Isfahani L, Monajemi R, Amjad L. Cytotoxic effects of extract and essential oil leaves of Achillea wilhelmsii C. Koch on colon cancers cells. Exp Anim Biol 2013; 1(3): 1-6.
  20. Abdalan S, Baghbani-Arani F, Sadat Shandiz SA. Evaluation of anticancer effect of aqueous and hydroalcoholic extracts of Quercusin fectoria leaf against colon cancer HT29 cell line. J Arak Univ Med Sci 2018; 21(4): 48-57. [Farsi]
  21. Schwarz SB, Schaffer PM, Kulka U, Ertl-Wagner B, Hell R, Schaffer M. The effect of radio-adaptive doses on HT29 and GM637 cells. Radiat Oncol 2008; 3(1): 1-6.
  22. Seyydnejad SM, Niknejad M, Darabpoor I, Motamedi H. Antibacterial activity of hydroalcoholic extract of Callistemon citrinus and Albizia lebbeck. Am J Appl Sci 2010; 7(1): 13-16.
  23. Alizadeh Behbahani B, Noshad M, Falah F. Study of chemical structure, antimicrobial, cytotoxic and mechanism of action of Syzygium aromaticum essential oil on foodborne pathogens. Potravinarstvo Slovak J Food Sci 2019; 13(1): 875-83.
  24. Dehghan N, Barzegar H, Mehrnia MA, Jooyandeh H. Investigation on the effect of Methanolic Bene (pistachia atlantica) hull extract on oxidative stability of soybean oil. Innov Food Technol 2018; 5(3): 499-507. [Farsi]
  25. Zhishen J, Mengcheng T, Jianming W. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chem 1999; 64(4): 555-9.
  26. Ansaripour A, Mehrnia M. A, Noshad M, Barzegar H, Alizadeh Behbahani B. Antimicrobial effect of garlic essential oil on a number of foodborne pathogens and determination of its chemical composition and antioxidant activity. Food Sci Technol 2019; 16(91): 17-29. [Farsi]
  27. Alizadeh Behbahani B, shahidi F, Tabatabai Yazdi F, Mortazavi A, Mohebbi M. The antimicrobial effect and interaction between the aqueous and ethanolic extracts of Plantago major on Staphylococcus aureus, Listeria Inocova, Escherichia coli, and Pseudomonas aeruginosa in vitro. Iran J Infect Dis and Trop Med 2017; 21(75): 1-8. [Farsi]
  28. Khosravi A, Malecan M. Effects of Lavandula stoechas extracts on Staphylococcus aureus and other gram negative bacteria. J Qazvin Univ Med Sci 2004; 7(5): 3-9. [Farsi]
  29. Derakhshan S, Sattari M, Bigdeli M, Zarei Eskikand N. Antibacterial activity of essential oils from Artemisia and Cumin plants against Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Vibrio cholera. J Qazvin Univ Med Sci 2011; 15(1): 6-14. [Farsi]
  30. Mahmodi R, Amini K, Asadi Dashbolagh J, Farhoodi A. Antioxidant and antibacterial properties of the Melissa officinalis essential oil. J Qazvin Univ Med Sci 2016; 20(2): 49-57. [Farsi]
  31. Alizadeh Behbahani B, Noshad M, Falah F. Cumin essential oil: Phytochemical analysis, antimicrobial activity and investigation of its mechanism of action through scanning electron microscopy. Microb Pathogenesis 2019; 136: 103716.
  32. Barzegar H, Alizadeh Behbahani B, Mehrnia M. A. Identification of the chemical compounds andantibacterial activity of Ocimum basilicum essential oil and the effects of its interaction with tetracycline and chloramphenicol antibiotics on some pathogenic microorganisms causing infection and food poisoning. Food Sci Technol 2019; 16(90): 113-25. [Farsi]
  33. Oyedeji OO, Lawal OA, Shode FO, Oyedeji AO. Chemical composition and antibacterial activity of the essential oils of Callistemon citrinus and Callistemon viminalis from South Africa. Molecules 2009; 14(6): 1990-8.
  34. Heidari-Sureshjani M, Tabatabaei-Yazdi F, Alizadeh-Behbahani B, Mortazavi A. Antimicrobial effect of aqueous, ethanol, methanol and glycerin extracts of Satureja bachtiarica on Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus epidermidis. Zahedan J Res Med Sci 2015; 17(7): e1011.
  35. Krishna K, Surendra G, Anjana M, Siva Nagini K. Phytochemical screening and antimicrobial activity of Callistemon citrinus (L.) leaves extracts. Int J Pharm Tech Res 2012; 4(2): 700-4.
  36. Hosseinimehr SJ, Pourmorad F, Shahabimajd N, Shahrbandy K, and Hosseinzadeh R. In vitro antioxidant activity of Polygonium hyrcanicum, Centaurea depressa, Sambucus ebulus, Mentha spicata and Phytolacca americana. Pakistan J Biol Sci 2007; 10(4): 637-40.
  37. Cuong NM, Khanh PN, Duc HV, Huong TT, Kim YC, Long PQ, et al. Flavonoids and triterpenoids from Callistemon citrinus and their inhibitory effect on no production in LPS-stimulated Raw264.7 macrophages. Vietnam J Sci Technol 2016; 54(2): 214-23.
  38. Khanh PN, Đuc HV, Huong TT, Ha VT, Van DT, Kim YH, et al. Phenolic compounds from Callistemon citrinus leaves and stems. Vietnam J Sci Technol 2016; 54(2): 190-7.
  39. Saad AM, Abdel-Aleem AAH, Ghareeb MA, Hamed MM, Abdel-Aziz MS, Hadad AH. In vitro antioxidant, antimicrobial and cytotoxic activities and green biosynthesis of silver & gold nanoparticles using Callistemon citrinus leaf extract. J App Pharm Sci 2017; 7(06): 141-9.
  40. Larayetan R, Ololade ZS, Ogunmola OO, Ladokun A. Phytochemical constituents, antioxidant, cytotoxicity, antimicrobial, antitrypanosomal, and antimalarial potentials of the crude extracts of Callistemon citrinus. Evid-Based Compl Alt 2019; 2019: 1-14.
  41. Ahmed F, Rahman MS. Preliminary assessment of free radical scavenging, thrombolytic and membrane stabilizing capabilities of organic fractions of Callistemon citrinus (Curtis.) skeels leaves. BMC Compl Alt Med 2016; 16(1): 1-8.
  42. Barzegar H, Behbahani BA, Mehrnia MA. Quality retention and shelf life extension of fresh beef using Lepidium sativum seed mucilage-based edible coating containing Heracleum lasiopetalum essential oil: an experimental and modeling study. Food Sci Biotechnol 2020; 29: 717–28.
  43. Schetter AJ, Heegaard NH, Harris CC. Inflammation and cancer: interweaving microRNA, free radical, cytokine and p53 pathways. Carcinogenesis 2010; 31(1): 37-49.
  44. Abdelhady MI, Aly HAH. Antioxidant antimicrobial activities of callistemon comboynensis essential oil. Free Radical Antioxid 2012; 2(1): 37-41.
  45. Jamzad M, Kazembakloo A, Tehrani AD, Rostami F. Essential oil composition and antioxidant activity of hydromethanolic extract from the flowers, leaves and stems of Callistemon citrinus (Curtis) Skeels. Indian J Nat Prod Resour 2015; 5(4): 308-12.
  46. Alizadeh Behbahani B, Shahidi F, Yazdi FT, Mortazavi SA, Mohebbi M. Antioxidant activity and antimicrobial effect of tarragon (Artemisia dracunculus) extract and chemical composition of its essential oil. J Food Me:as char:act 2017; 11(2): 847-63.
  47. Noshad M, Hojjati M, Alizadeh Behbahani B. Black Zira essential oil: Chemical compositions and antimicrobial activity against the growth of some pathogenic strain causing infection. Microb Pathogenesis 2018; 116: 153-7.
  48. Yeganegi M, Yazdi FT, Mortazavi SA, Asili J, Alizadeh Behbahani B, Beigbabaei A. Equisetum telmateia extracts: Chemical compositions, antioxidant activity and antimicrobial effect on the growth of some pathogenic strain causing poisoning and infection. Microb Pathogenesis 2018; 116: 62-67.
  49. Fayemi PO, Ozturk I, Kaan D, Özcan S, Yerer MB, Dokumaci AH, et al. Bioactivities of phytochemicals in Callistemon citrinus against multi-resistant foodborne pathogens, alpha glucosidase inhibition and MCF-7 cancer cell line. Biotechnol Biotech Eq 2019; 33(1): 764-78.
[50] Van Tonder A, Joubert AM, Cromarty AD. Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Res Notes 2015; 8(1): 1-10.


 
Investigation of the Functional Groups of Bioactive Compounds, Radical Scavenging Potential, Antimicrobial Activity and Cytotoxic Effect of Callistemon Citrinus Aqueous Extract on Cell Line HT29: A Laboratory Study
 
 
Z. Sosani Gharibvand[5], B. Alizadeh Behbahani[6], M. Noshad[7], H. Jooyandeh[8]
 
 
Received: 22/02/2020  Sent for Revision: 09/06/2020 Received Revised Manuscript: 27/06/2020 Accepted: 05/07/2020
 
Background and Objectives: The extensive use of chemical drugs for the treatment and control of chronic and infectious diseases as well as colorectal cancer, has led to an increased demand for natural and safe drugs and preservatives. Therefore, this study aimed to evaluate the presence of functional groups of constituents, total phenol and flavonoids content, radical scavenging potential, and antimicrobial activity of Callistemon citrinus aqueous extract (CCE). Its interaction with common therapeutic antibiotics and cytotoxic effect on cell line HT29 was also evaluated.
Materials and Methods: In this laboratory study, the presence of functional groups of chemical constituents of C. citrinus aqueous extract was evaluated by Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy. Free radical scavenging activity, total phenol and flavonoids content, antimicrobial activity of C. citrinus aqueous extract and its interaction with chloramphenicol and gentamicin antibiotics, and the viability of cell line HT29 (through MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] test) under different concentrations of C. citrinus aqueous extract were investigated. Data were analyzed using one-way ANOVA followed by Duncan’s test.
Results: The C. citrinus aqueous extract had a considerable antimicrobial effect on Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, and Listeria innocua. The free radicals scavenging effect of C. citrinus aqueous extract was in the range of 51.33-71.68%. The presence of C-C and OH groups of phenolic compounds of C. citrinus aqueous extract was confirmed by FTIR. After 24 hours, the different concentrations of C. citrinus aqueous extract reduced the growth of cell line HT29 compared to the control group (p<0.05).
Conclusion: The C. citrinus aqueous extract had antimicrobial activity, antioxidant potential and inhibitory effect on cell line HT29. Therefore, the use of C. citrinus aqueous extract could be suggested in pharmaceutical and food industries.
Key words: Cytotoxic effect, Minimum inhibitory concentration, In vitro, Callistemon citrinus aqueous extract
 
Funding: This study was funded by Agricultural Sciences and Natural Resources University of Khuzestan.
Conflict of interest: None declared.
Ethical approval: This study has been approved by the Research Deputy of Agricultural Science and Natural Resources of University of Khuzestan and Iranian Research Institute for Information Science and Technology (IR.AC.IRANDOC. SABT.1520449).
How to cite this article: Sosani Gharibvand  Z, Alizadeh Behbahani B, Noshad  M, Jooyandeh H. Investigation of the Functional Groups of Bioactive Compounds, Radical Scavenging Potential, Antimicrobial Activity and Cytotoxic Effect of Callistemon Citrinus Aqueous Extract on Cell Line HT29: A Laboratory Study. J Rafsanjan Univ Med Sci 2020; 19 (5): 463-84. [Farsi]


 
[1]- دانشجوی کارشناسی ارشد علوم و مهندسی صنایع غذایی، دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، ملاثانی، ایران
[2]- (نویسنده مسئول) استادیار گروه آموزشی علوم و مهندسی صنایع غذایی، دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، ملاثانی، ایران
   تلفن: ۳۶۵۲۲۴۲۵-061، دورنگار: ۳۶۵۲۲۴۲۵-061، پست الکترونیکی: b.alizadeh@asnrukh.ac.ir
[3]- استادیار گروه آموزشی علوم و مهندسی صنایع غذایی، دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، ملاثانی، ایران
[4]- دانشیار گروه آموزشی علوم و مهندسی صنایع غذایی، دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، ملاثانی، ایران
 
[5]- MSc Student of Food Science and Technology, Faculty of Animal Science and Food Technology, Agricultural Sciences and Natural Resources University of Khuzestan, Mollasani, Iran, ORCID: 0000-0001-7194-0903
[6]- Assistant Prof., Dept. of Food Science and Technology, Faculty of Animal Science and Food Technology, Agricultural Sciences and Natural Resources University of Khuzestan, Mollasani, Iran, ORCID: 0000-0002-1447-5088
(Corresponding Author) Tel: (061) 36522425, Fax: (061) 36522425, E-mail: b.alizadeh@asnrukh.ac.ir
[7]- Assistant Prof., Dept. of Food Science and Technology, Faculty of Animal Science and Food Technology, Agricultural Sciences and Natural Resources University of Khuzestan, Mollasani, Iran, ORCID: 0000-0002-4060-9254
[8]- Associate Prof., Dept. of Food Science and Technology, Faculty of Animal Science and Food Technology, Agricultural Sciences and Natural Resources University of Khuzestan, Mollasani, Iran, ORCID: 0000-0002-1516-7052
نوع مطالعه: پژوهشي | موضوع مقاله: ميكروبيولوژي
دریافت: 1398/11/23 | پذیرش: 1399/4/15 | انتشار: 1399/6/9

ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
CAPTCHA

ارسال پیام به نویسنده مسئول


بازنشر اطلاعات
Creative Commons License این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است.

کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق

© 2022 CC BY-NC 4.0 | Journal of Rafsanjan University of Medical Sciences

Designed & Developed by : Yektaweb