مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

مقاله پژوهشی

مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

دوره 12، بهمن 1392، 906-895

بررسی نقش N – استیل سیستئین در کاهش استرس اکسیداتیو ناشی از دیازینون در کبد و کلیه موش صحرایی

فریده ایزدی[1]، مهوش جعفری[2]، حسین بهادران[3]، علیرضا عسگری[4]، عادله دیو سالار[5]، مریم صالحی[6]

دریافت مقاله: 06/04/91    ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 28/04/91  دریافت اصلاحیه از نویسنده:25/10/91     پذیرش مقاله: 27/12/91

چکیده

زمینه و هدف: دیازینون [Diazinon: (DZN)] به عنوان یک سم ارگانوفسفره سبب تولید رادیکال‌های آزاد و القاء استرس اکسیداتیو می‌شود. هدف از این مطالعه بررسی اثر N – استیل سیستئین [N- acetyl cysteine: (NAC)]  به عنوان آنتی‌اکسیدان بر کاهش استرس اکسیداتیو ناشی از سمیت دیازینون در کبد و کلیه موش صحرایی است.

مواد و روش‌ها: در مطالعه تجربی 24 سر موش‌ نر نژاد ویستار به طور تصادفی به 4 گروه (در هر گروه 6 سر) تقسیم شدند. گروه کنترل (روغن ذرت)، گروه DZN (100 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن)، گروه NAC (160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن) و گروه NAC+DZN که هم زمان DZN و NAC را به صورت تزریق داخل صفاقی دریافت کردند. بعد از 24 ساعت، موش‌ها بیهوش و بافت‌های کبد و کلیه جدا شدند. پس از هموژنه کردن بافت‌ها، فعالیت آنزیم‌های سوپراکسیددیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، گلوتاتیونS - ترانسفراز (GST)، لاکتات دهیدروژناز (LDH) و غلظت گلوتاتیون (GSH) و مالون‌دی‌آلدئید (MDA) توسط روش بیوشیمیایی تعیین شد. معنی‌دار بودن نتایج توسط آنالیز واریانس (ANOVA) به همراه تست توکی تعیین شد.

یافته‌ها: دیازینون سبب افزایش فعالیت SOD، CAT و GST کبد و کلیه و افزایش فعالیت LDH کبد و کاهش میزان GSH و افزایش میزان MDA می‌گردد. تجویز  NAC باعث کاهش فعالیت SOD،GST  و LDH کبد و فعالیت آنزیم CAT در کبد و کلیه و افزایش غلظت GSH کبد و کلیه و کاهش غلظت MDA کبد می‌شود.

نتیجه‌گیری: احتمالاً دیازینون با تولید رادیکال‌های آزاد سبب افزایش لیپیدپراکسیداسیون غشاء و کاهش غلظت GSH سلول‌های کبد و کلیه می‌شود. تجویز NAC به عنوان آنتی‌اکسیدان از طریق حذف رادیکال‌های آزاد و افزایش سنتز گلوتاتیون به طور نسبی باعث کاهش سمیت دیازینون می‌شود.

واژه‌های کلیدی: دیازینون، N–استیل سیستئین، استرس اکسیداتیو، کبد، کلیه، موش صحرایی

مقدمه

ارگانوفسفره‌ها متداول‌ترین ترکیبات شیمیایی هستند که برای کنترل آفت‌های کشاورزی استفاده می‌شوند و به عنوان سمی‌ترین حشره‌کش‌ها برای حیوانات مهره‌دار به شمار می‌روند. این ترکیبات به دلیل قابلیت تجمع پایین و ماندگاری کوتاه مدت در محیط زیست به میزان فراوان مورد استفاده قرار می‌گیرند. مسمومیت با این ترکیبات یکی از مشکلات بهداشت جهانی بوده و در ایران سومین علت مرگ و میر را به خود اختصاص داده است. ارزیابی سازمان بهداشت جهانی نشان داده است که شیوع مسمومیت با حشره‌کش‌ها در کشورهای در حال توسعه در طی 10 سال گذشته دو برابر شده است. این ترکیبات منبع مهم آلودگی محیط زیست به شمار می‌آیند [3-1].

دیازینون یکی از حشره‌کش‌های ارگانوفسفره است که به طور گسترده در مزارع برنج گیلان، مازندران، گلستان و سایر مناطق ایران استفاده می‌شود. مصرف سالیانه دیازینون در ایران 3775 تن تخمین زده شده است و گزارش شده که برخی آب‌های سطحی و محیط‌های اطراف در ایران با سموم ارگانوفسفره مثل دیازینون و مشتقات آن آلوده شده‌اند [4].

این حشره کش از طریق پوست، سیستم گوارش و مسیر هوایی (در صورت تبخیر) جذب شده و عمدتاً از راه کلیه دفع می‌شود. آنزیم‌های میکروزومی‌ کبد دیازینون را اکسید می‌کنند و ترکیبات مهارکننده استیل کولین استراز قوی‌تری نظیر دیازوکسون، هیدروکسی دیازوکسون و هیدروکسی دیازینون تولید می‌کنند [1]. این ترکیب تا حدی در آب محلول است و در سیستم‌های بیولوژیکی تجمع پیدا نمی‌کند و به علت ویژگی‌های شیمیایی آن  به طور وسیع در کشاورزی استفاده می‌شود [5].

ارگانوفسفره‌ها با فسفریلاسیون اسید آمینه سرین در جایگاه فعال آنزیم استیل کولین استراز باعث مهار آنزیم شده که تجمع استیل کولین در سیناپس‌های کولینرژیک و وقوع بحران کولینرژیک تشنج و در موارد حاد ضایعه مغزی و مرگ را به دنبال دارد [6، 1]. بسیاری از اثرات ارگانوفسفره‌ها ارتباطی به مهار آنزیم استیل‌کولین استراز نداشته، بلکه توسط سازوکار‌های دیگر سلولی القاء می‌شود.

 یکی از سازوکار‌هایی که اخیراً بسیار مورد توجه قرار گرفته است، تولید رادیکال‌های آزاد توسط این ترکیبات می‌باشد [6، 2-1]. رادیکال‌های آزاد می‌توانند ماکرومولکول‌های زیستی نظیر لیپیدها، پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک را اکسید کنند و سبب پراکسیداسیون چربی‌ها، آسیب به غشاء و غیرفعال کردن آنزیم‌ها شوند. آنتی‌اکسیدان‌ها به عنوان موادی که در غلظت پایین وجود دارند و به مقدار قابل توجهی اکسید شدن ماده اکسید شونده را به تأخیر می‌اندازند یا مهار می‌کنند و سلول را در برابر اثرات زیان‌آور عوامل محیطی محافظت می‌کنند. آنتی‌اکسیدان‌های آنزیمی ‌شامل آنزیم‌های سوپراکسید دیسموتاز [Superoxide dismutase (SOD)]، کاتالاز [Catalase (CAT)] و گلوتاتیون S- ترانسفراز [Glutathione S-transferase (GST)] و آنتی‌اکسیدان‌های غیرآنزیمی‌شامل ویتامین‌ها و گلوتاتیون [Glutathione (GSH)] می‌باشند. اختلال در توازن اکسیدان‌ها و آنتی‌اکسیدان‌های بدن منجر به آسیب‌های بافتی و استرس اکسیداتیو می‌شود [8-7].

N–استیل سیستئین به عنوان یک آنتی‌اکسیدان قادر است که گلوتاتیون را سنتز نماید و به طور طبیعی اثرات آسیب‌های داخل سلولی رادیکال‌های آزاد را به وسیله ترمیم آسیب‌های اکسیداتیو یا به طور مستقیم با جمع‌آ‌وری رادیکال‌های فعال اکسیژن خنثی کند [9، 3].

 مطالعات روی تجویز دیازینون به صورت داخل صفاقی و اثر  N- استیل سیستئین بر کاهش سمیت ارگانوفسفره‌ها در بافت‌های مختلف بسیار کم انجام شده است. Shadnia و همکاران اثر حفاظتی NAC و آلفا- توکوفرول در کاهش استرس اکسیداتیو القاء شده توسط دیازینون خوراکی را نشان دادند [4].  Pena-Llopisو همکاران نشان دادند که تزریق NAC سه ساعت قبل از تجویز دی‌کلروس به عنوان یک ارگانوفسفره به ماهی در زمان‌های مختلف تا 96 ساعت باعث افزایش فعالیت GST می‌شود [10]. هدف از این مطالعه بررسی نقش N- استیل سیستئین بر کاهش استرس اکسیداتیو ناشی از دیازینون در بافت‌های کبد (محل اصلی متابولیسم عوامل ارگانوفسفره) و کلیه (محل دفع مواد متابولیزه عوامل ارگانوفسفره) موش صحرایی است.

مواد و روش‌ها

این مطالعه از نوع تجربی است که در طی سال‌های 1390-1389 انجام شده است.

مواد شیمیایی: 1-کلرو 2،4 دی‌نیتروبنزن، نیتروبلوتترازولیوم، دی تیو – بیس- نیتروبنزوئیک اسید، تری‌کلرواستیک اسید و دیگر مواد شیمیایی مورد نیاز با درجه خلوص بالا از شرکت‌های Sigma و Merck (آلمان) خریداری شدند. دیازینون از شرکت  Supelco–USAبا بیشتر از 98% خلوص خریداری شد و محلول ذخیره (استوک) با غلظت 400 میلی‌گرم بر کیلوگرم در روغن ذرت به صورت تازه تهیه گردید. N–استیل سیستئین از شرکت Sigma خریداری و محلول ذخیره با غلظت 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم در آب مقطر به صورت تازه تهیه گردید.

حیوانات: این مطالعه بر روی 24 سر موش آزمایشگاهی نر نژاد ویستار با محدوده وزنی 250-200 گرم انجام گرفت. حیوانات در شرایط 12 ساعت نور و 12 ساعت تاریکی با دسترسی آزاد به آب و غذا و دمای 22-20 درجه سانتی‌گراد در حیوان‌خانه دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌ا... (عج) نگه‌داری می‌شدند. موازین اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی مورد تأیید کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌ا... (عج) قرار گرفت که هنگام کار با حیوانات آزمایشگاهی رعایت گردید.

تیمار حیوانات: حیوانات به طور تصادفی به 4 گروه (در هر گروه 6 سر) تقسیم شدند: گروه کنترل که روغن ذرت را به عنوان حلال دیازینون، گروه دیازینون که 100 میلی‌گرم بر کیلوگرم دیازینون، گروه NAC که 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم NAC و گروه دیازینون- NAC که به طور هم‌زمان 100 میلی‌گرم بر کیلوگرم دیازینون و 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم NAC را به صورت داخل صفاقی دریافت کردند. دقیقاً 24 ساعت بعد از تزریق با بیهوش نمودن حیوانات به وسیله اتر، بافت‌های کبد و کلیه خارج گردید و بعد از شستشو با سرم فیزیولوژی و خارج شدن خون و جدا کردن قسمت‌های زاید، به نیتروژن مایع انتقال داده شد و سپس در دمای 70- درجه سانتی‌گراد تا زمان انجام آزمایش نگه‌داری گردید. در روز آزمایش بافت‌ها به دقت توزین و با نسبت 1 به 10 در بافر فسفات سالین هموژنه شده و به مدت 15 دقیقه با دور 12000 گرم در 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفوژ گردید. از مایع رویی جهت سنجش شاخص‌های مورد نظر استفاده شد.

سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز: فعالیت آنزیم SOD به روش Winterbourn سنجیده شد [11]. به حجم مناسبی از بافت هموژنه EDTA1/0 مولار در سدیم سیانید 3/0 میلی‌مولار و نیتروبلوتترازولیوم 5/1 میلی‌مولار در یک کووت اضافه و بعد از مخلوط کردن به مدت 5 دقیقه در 37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. سپس ریبوفلاوین 12/0 میلی‌مولار در بافرفسفات پتاسیم 067/0 مولار با 8/7=pH اضافه و به مدت 10 دقیقه در درجه حرارت اتاق قرار گرفت. جذب در طی 5 دقیقه در طول موج 560 نانومتر قرائت شد و فعالیت ویژه بر حسب واحد بر میلی‌گرم پروتئین محاسبه شد.

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز: برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کاتالاز از روش Abei استفاده شد [12]. به حجم معینی از عصاره بافتی اتانول مطلق (ml/ml 01/0) اضافه و به مدت نیم ساعت در یخ انکوبه گردید. سپس به آن تریتون 100X- 10% با غلضت نهایی 1% اضافه شد. عصاره بافتی حاصله جهت اندازه‌گیری فعالیت آنزیم استفاده شد. واکنش با اضافه کردن H₂O₂ 30 میلی‌مولار به حجم مناسبی از عصاره نمونه بافتی در بافر فسفات سدیم 50 میلی‌مولار 7=pH شروع شد. سپس جذب در طی 3 دقیقه در طول موج 240 نانومتر قرائت شد. فعالیت ویژه بر حسب واحد بر میلی‌گرم پروتئین محاسبه شد.

اندازه‌گیری فعالیت گلوتاتیون S- ترانسفراز: اندازه‌گیری فعالیت این آنزیم به روش Habig انجام شد [13]. یک میلی‌لیتر محلول واکنش حاوی بافرفسفات پتاسیم 50 میلی‌مولار با 4/7 pH= شامل EDTA یک میلی‌مولار، گلوتاتیون 20 میلی‌مولار و 1-کلرو 2،4 دی‌نیتروبنزن 20 میلی‌مولار است. واکنش با اضافه کردن حجم معینی از عصاره بافتی شروع شد. تغییرات جذب در طول موج 340 نانومتر در طی 5 دقیقه قرائت گردید. فعالیت ویژه بر حسب واحد بر میلی‌گرم پروتئین بیان شد.

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم لاکتات دهیدروژناز (LDH): اندازه‌گیری فعالیت آنزیم لاکتات دهیدروژناز با استفاده از کیت شرکت پارس آزمون (تهران- ایران) انجام شد. مقدار 10 میکرولیتر نمونه را با یک میلی‌لیتر از محلول مخلوط شده 1 و 2 موجود در کیت اضافه و اختلاف جذب بین صفر و 3 دقیقه در طول موج 340 نانومتر قرائت شد. فعالیت آنزیم بر حسب واحد بر میلی‌گرم پروتئین محاسبه گردید.

سنجش میزان مالون‌دی‌آلدئید (MDA): برای تعیین محصول نهایی پراکسیداسیون لیپیدها از روش Satho استفاده شد [14]. به 500 میکرولیتر بافت هموژنه 5/1 میلی‌لیتر تری‌کلرواستیک اسید 10% اضافه شد و به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ گردید. سپس 5/1 میلی‌لیتر از مایع رویی را برداشته و 2 میلی‌لیتر اسید تیوباربیتوریک 67/0% اضافه شد و به مدت 30 دقیقه در بن ماری جوش قرار داده شد. سپس 2 میلی‌لیتر n- بوتانل به محلول اضافه و بعد از ورتکس شدید، به مدت 15 دقیقه در 4000 گرم سانتریفوژ گردید. سپس جذب محلول رویی صورتی رنگ در طول موج 532 نانومتر خوانده شد. غلظت مالون‌دی‌آلدئید با استفاده از 1 و 1 و 3 و 3 تترااتوکسی پروپان به عنوان استاندارد تعیین و غلظت مالون‌دی‌آلدئید بر حسب نانومول بر میلی‌گرم پروتئین محاسبه شد. محلول استاندارد MDA در غلظت‌های 20 – 2/0 میکرومولار در اسیدسولفوریک 10% تهیه شد.

سنجش میزان GSH: برای سنجش میزان گلوتاتیون بافت از روش Tietz استفاده شد [15]. غلظت مناسبی از نمونه هموژنه با 10 میکرولیتر اسیدسولفوسالسیلیک 5% مخلوط و به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با دور g 2000 سانتریفوژ گردید. 100 میکرولیتر از محلول رویی برداشته به 810 میکرولیتر دی‌سدیم‌فسفات 3/0 مولار اضافه شد. سپس با اضافه کردن 90 میکرولیتر دی‌تیو- بیس- نیتروبنزوئیک اسید 4/0% محلول در سیترات سدیم 1% واکنش شروع گردید. تغییرات جذب در طول موج 412 نانومتر در طی 5 دقیقه قرائت شد. با استفاده از محلول گلوتاتیون 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر منحنی استاندارد گلوتاتیون رسم گردید و غلظت گلوتاتیون بر حسب نانومول بر میلی‌گرم پروتئین محاسبه گردید. محلول استاندارد گلوتاتیون در غلظت‌های 200-25 میکرومولار تهیه شد.

تعیین غلظت پروتئین: برای تعیین غلظت پروتئین از روش Brodford استفاده شد [16]. حجم مناسبی از عصاره بافتی را به حجم 1 میلی‌لیتر رسانده و 3 میلی‌لیتر از محلول Brodford (100 میلی‌گرم کوماسی بیریلیانت بلو، 50 میلی‌لیتر اتانول و 100 میلی‌لیتر اسید فسفریک 85% در یک لیتر) به آن اضافه و به مدت 10 دقیقه انکوبه گردید. سپس در طول موج 595 نانومتر جذب قرائت شد. غلظت پروتئین را با رسم استاندارد با استفاده از محلول 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر آلبومین سرم گاوی (BSA) محاسبه گردید.

تجزیه و تحلیل داده‌ها: نتایج به صورت Mean±SD بیان شد. تجزیه و تحلیل اطلاعات با استفاده از نرم‌افزار INSTAT به صورت آنالیز واریانس یک طرفه به همراه تست توکی انجام گردید. در تمامی آزمون‌ها 05/0>p اختلاف‌ معنی‌دار در نظر گرفته شد.

نتایج

اثر دیازینون و N–استیل سیستئین به تنهایی و در ترکیب با هم روی فعالیت آنزیم‌‌های آنتی‌اکسیدان و LDH در کبد و کلیه موش صحرایی بعد از 24 ساعت در جدول 1 نشان می‌دهد که دیازینون باعث افزایش فعالیت آنزیم‌های SOD، CAT وGST  کبد و کلیه و افزایش فعالیت LDH کبد در مقایسه با گروه کنترل می‌شود. میزان افزایش فعالیت این آنزیم‌ها در کبد و کلیه در گروه دیازینون-NAC  در مقایسه با گروه دیازینون کمتر بوده، ولی تأًثیری روی فعالیت SOD کلیه ندارد.

جدول 1-اثر دیازینون و N – استیل سیستئین (NAC) به تنهایی و در ترکیب با هم بر روی فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و LDH در کبد و کلیه موش صحرایی بعد از 24 ساعت

با آنالیز واریانس (ANOVA) و تست توکی *: 05/0>p، **: 01/0>p و ***: 001/0>p نسبت به گروه کنترل معنی‌دار است.

اثر توأم دیازینون و N-استیل سیستئین روی غلظت گلوتاتیون و مالون‌دی‌آلدئید در کبد و کلیه موش صحرایی در جدول 2 نشان می‌دهد که دیازینون باعث کاهش غلظت گلوتاتیون و افزایش غلظت مالون‌دی‌آلدئید در کبد و کلیه در مقایسه با گروه کنترل می‌شود. تجویز NAC به همراه دیازینون سبب کاهش کمتر غلظت گلوتاتیون در کبد و کلیه در مقایسه با گروه دیازینون می‌شود. بهبودی غلظت گلوتاتیون کبد بیشتر از کلیه است. همچنین، تجویز NAC با دیازینون باعث افزایش کمتر غلظت مالون‌دی‌آلدئید در کبد می‌شود، ولی تأثیری روی غلظت مالون‌دی‌آلدئید کلیه ندارد.

جدول 2- اثر دیازینون و N – استیل سیستئین (NAC) به تنهایی و در ترکیب با هم بر روی غلظت GSH و MDA در کبد و کلیه موش صحرایی بعد از 24 ساعت

با آنالیز واریانس (ANOVA) و تست توکی *: 05/0>p، **: 01/0>p و ***: 001/0>p نسبت به گروه کنترل معنی‌دار است.

بحث

سازوکار اصلی سمیت دیازینون مانند دیگر ارگانوفسفره‌ها مهار فعالیت استیل کولین استراز توسط متابولیت‌های آن می‌باشد. همچنین، دیازینون می‌تواند سبب القاء استرس اکسیداتیو و تولید گونه‌های فعال اکسیژن [Reactive oxygen species (ROS)] شود [17]. کبد در مهره‌‍داران فعال‌ترین بافت از نظر متابولیکی است و دارای بیشترین فعالیت آنتی‌اکسیدان‌ها و آنزیم‌های مربوطه می‌باشد. بنابراین، ارگان اصلی جهت سم‌زدایی گزنوبیوتیک‌هاست. کلیه نیز نقش حیاتی در ثبات محیط داخلی موجودات زنده ایفا می‌کند و هدف سموم شیمیایی است که می‌توانند عملکرد آن را دچار اختلال کنند و سبب اختلال موقت یا دایم هموستازی شوند [1].

آنزیم‌های SOD و CAT اولین خط دفاعی سلول در برابر رادیکال‌های آزاد اکسیژن هستند. SOD آنیون‌های سوپراکسید را به H₂O₂ و O₂ تبدیل می‌کند که آن هم متعاقباً توسط آنزیم CAT به H₂O و O₂ تبدیل می‌شود [7]. نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که دیازینون سبب افزایش قابل توجهی در فعالیت آنزیم‌های SOD و CAT در کبد و کلیه موش صحرایی می‌شود و تجویز NAC تا حدی سبب کاهش فعالیت آنزیم SOD در کبد و فعالیت CAT در کبد و کلیه موش صحرایی می‌گردد. افزایش فعالیت SOD سبب افزایش میزان H₂O₂ و کاهش رادیکال‌های سوپراکسید و افزایش فعالیت CAT باعث کاهش میزان H₂O₂ و جلوگیری از آسیب بافتی می‌شود. افزایش فعالیت این آنزیم‌ها مربوط به سازوکار‌های دفاعی در برابر استرس اکسیداتیو است. افزایش فعالیت SOD و CAT احتمالاً ناشی از افزایش تولید ROS توسط دیازینون می‌باشد و کاهش فعالیت آنزیم‌های SOD و CAT بعد از استفاده از NAC، احتمالاً مربوط به توانایی NAC در حذف مستقیم ROS‌ها می‌باشد [9]. نتایج این تحقیق موافق نتایج مطالعاتی است که نشان می‌دهند که تجویز خوراکی دیازینون باعث افزایش فعالیت آنزیم‌های  SODو CAT در بافت کبد ماهی و مغز و قلب موش صحرایی می‌شود [20-18]. مطالعات دیگر کاهش فعالیت آنزیم‌های  SODو CAT را بعد از تجویز خوراکی دیازینون در بافت‌های کلیه، قلب و ماهیچه نشان می‌دهند [21، 2]. این اختلاف نتایج در مطالعات مختلف ناشی از نوع، نژاد و گونه حیوان، نوع سم و بافت، مسیر تجویز ماده سمی ‌و دوز و زمان مواجهه می‌باشد.

GST یکی دیگر از آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان است که مواد سمی‌را با اتصال به گلوتاتیون تبدیل به مواد با سمیت کمتر می‌کند [7]. نتایج مطالعه حاضر نشان داد دیازینون سبب افزایش فعالیت GST در کبد و کلیه موش صحرایی شده و تجویز NAC تا حدی سبب کاهش فعالیت این آنزیم در هر دو بافت در مقایسه با گروه دیازینون می‌شود. افزایش GST در اثر تزریق دیازینون نشان دهنده افزایش دفاع بدن در مقابل این سم و دفع سریع‌تر آن است. مطالعات دیگر نیز نشان می‌دهند که به دنبال تجویز دیازینون فعالیت GST در ماهی نشان می‌دهد [18، 23-22]. Llopis و همکاران نشان دادند که تزریق داخل صفاقی N- استیل سیستئین سه ساعت قبل از تجویز دی‌کلروس به ماهی در زمان‌های مختلف تا 96 ساعت باعث افزایش فعالیت GST می‌شود. NAC باعث افزایش تحمل به این ارگانوفسفره می‌شود [10].

LDH یک آنزیم سیتوپلاسمی ‌می‌باشد که جهت بررسی آسیب سلولی و به عنوان شاخص جهت بررسی سمیت یک ماده شیمیایی و لیز سلولی مورد استفاده قرار می‌گیرد [24]. در این مطالعه دیازینون سبب افزایش فعالیت LDH کبد شده که تجویز NAC در کبد تا حدی فعالیت این آنزیم را در مقایسه با گروه دیازینون کاهش می‌دهد. افزایش LDH کبدی می‌تواند ناشی از کمبود اکسیژن بافت باشد. افزایش فعالیت LDH مغز و قلب پس از تجویز خوراکی دیازینون مشاهده می‌شود [24، 21]. استفاده از NAC سبب احیاء رادیکال‌های آزاد ناشی از تجویز دیازینون و در نتیجه جلوگیری از پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء و مانع از آزادشدن آنزیم LDH می‌شود.

گلوتاتیون فراوان‌ترین و مهم‌ترین آنتی‌اکسیدان سلولی است که قادر است مستقیماً ROS‌ها را جمع‌آوری کند [8]. همچنین، GSH به عنوان کوفاکتور برای آنزیم‌های گلوتاتیون پراکسیداز و GST عمل می‌کند [25]. بر طبق نتایج مطالعه حاضر تجویز دیازینون سبب کاهش غلظت گلوتاتیون در کبد و کلیه موش صحرایی می‌شود. از آن جایی که فعالیت GST در هر دو بافت کبد و کلیه در اثر دیازینون افزایش پیدا کرده است، کاهش گلوتاتیون این بافت‌ها می‌تواند ناشی از افزایش فعالیت آنزیم GST و مصرف آن به عنوان سوبسترا توسط این آنزیم باشد و هم مربوط به عملکرد مستقیم آن جهت حذف رادیکال‌های آزاد باشد. کاهش غلظت گلوتاتیون بافت‌های کبد و کلیه تا حد زیادی در اثر استفاده NAC جبران می‌شود. این نتیجه می‌تواند ناشی از عمل NAC به عنوان پیش ساز گلوتاتیون و شرکت آن در سنتز این آنتی‌اکسیدان سلولی و همین طور عملکرد مستقیم آن در حذف رادیکال‌های آزاد باشد [9]. مطالعات دیگر نشان می‌دهد که تجویز خوراکی دیازینون موجب کاهش گلوتاتیون کبد، کلیه و قلب می‌گردد [26، 19، 2]. دو مطالعه دیگر نشان داد که تزریق داخل صفاقی N- استیل سیستئین قبل از تجویز آندوسولفان و دی کلروس به ماهی باعث افزایش غلظت گلوتاتیون، نسبت GSH/GSSG و فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز کبدی می‌شود [27، 10].

لیپیدها به ویژه اسیدهای چرب غیراشباع در غشاء سلولی جزء حساس‌ترین مولکول‌های بیولوژیکی هستند که در معرض حمله ROS‌ها قرار می‌گیرند و این مساًله موجب افزایش میزان پراکسیداسیون لیپیدها می‌شود [28].MDA  شاخص اصلی اکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع است و به عنوان شاخص استرس اکسیداتیو در پاتوژنز بسیاری از بیماری‌ها به شمار می‌رود [29]. در مطالعه حاضر افزایش سطح MDA در کبد و کلیه در اثر تجویز دیازینون مشاهده می‌شود که این افزایش ناشی از تولید ROS‌ها توسط دیازینون و افزایش پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء می‌باشد. استفاده از NAC در کبد تا حدودی سبب کاهش سطح MDA می‌شود. کاهش سطح MDA می‌تواند مربوط به قابلیت NAC در حذف مستقیم رادیکال‌های آزاد و مهار پراکسیداسیون لیپیدها توسط ROS می‌باشد. مطالعات مختلف نشان می‌دهند که تجویز خوراکی دیازینون موجب تغییر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و افزایش پراکسیداسیون لیپیدها در مغز، کلیه، قلب و ماهیچه می‌شود [30، 21، 2]. Shadnia و همکاران نشان دادند که تجویز خوراکی دیازینون به مدت 4 هفته باعث افزایش مواد فعال اسیدتیوباربیتوریک (TBARS) به عنوان شناساگر لیپیدپراکسیداسیون، کاهش مولکول‌های تیول کل و ظرفیت آنتی‌اکسیدان کل به عنوان شناساگر استرس اکسیداتیو می‌شود. اثر حفاظتی NAC و آلفا- توکوفرول به همراه دیازینون باعث کاهش استرس اکسیداتیو القاء شده توسط دیازینون می‌شود [4].

نتیجه‌گیری

نتایج نشان داد که دیازینون با افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و میزان MDA و کاهش غلظت گلوتاتیون در بافت‌های کبد و کلیه باعث تولید رادیکال‌های آزاد و وقوع استرس اکسیداتیو می‌شود. NAC به عنوان آنتی‌اکسیدان از طریق حذف رادیکال‌های آزاد و افزایش سنتز گلوتاتیون تا حدی باعث کاهش سمیت دیازینون می‌شود.

تشکر و قدردانی

این طرح تحقیقاتی با حمایت مالی مرکز تحقیقات شیمیایی دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌ا... انجام شده است که بدین وسیله از کلیه مسئولین مرکز مربوطه تشکر و قدردانی به‌عمل می‌اید.

References

[1] Oruc EO, Usta D. Evaluation of oxidative stress responses and neurotoxicity potential of diazinon in different tissues of Cyprinus carpio. Environ Toxicol Pharmacol 2007; 23: 48-55.

[2] Shah MD, Iqbal M. Diazinon-induced oxidative stress and renal dysfunction in rats. Food Chem Toxicol 2010; 48: 3345-53.

[3] Xue C, Liu W, Wu J, Yang X, Xu H. Chemoprotective effect of N-acetylcysteine (NAC) on cellular oxidative damages and apoptosis induced by nano titanium dioxide under UVA irradiation. Toxicol in Vitro 2011; 25: 110-6.

[4] Shadnia S, Abdollahi M, Sasanian G. Effects of N-acetyl-cysteine and tocopherol on diazinon toxicity. Curr Med Chem 2003; 10: 2705-8.

[5] Durmaz H, Sevgiler Y, ÜnerN. Tissue-specific antioxidative and neurotoxic responses to diazinon in Oreochromis niloticus. Pest Biochem Physiol 2006; 84: 215-26.

[6] Saulsbury MD, Heyliger SO, Wang K, Johnson DJ. Chlorpyrifus induces oxidative stress in oligodendrocyte progenitor cells. Toxicology 2009; 259: 1-9.

[7] Limon-Pacheco J, Gonsebatt ME. The role of antioxidants and antioxidant-related enzymes in protective responses to environmentally induced oxidative stress. Mutat Res 2009; 674: 137-47.

[8] Meister A. Glutathione metabolism. Methods Enzymol 1995; 251: 3-7.

[9] De Flora S, Bennicelli C, Camoirano A, Serra D, Romano M, Rossi GA, et al. In vivo effects of N-acetylcysteine on glutathione metabolism and on the biotransformation of carcinogenic and/or mutagenic compounds. Carcinogenesis 1985; 6: 1735-45.

[10] Pena-Llopis S, Ferrando MD, Pena JB. Fish tolerance to organophosphate-induced oxidative stress is dependent on the glutathione metabolism and enhanced by N-acetylcysteine. Aquat Toxicol 2003; 65: 337-60.

[11] Winterbourn C, Hawkins R, Brian M, Carrell R. The estimation of red cell superoxide dismutase activity. J Lab Clin Med 1975; 85: 337.

[12] Aebi H. Catalase in vitro. Methodes Enzymol 1984; 105: 121-6.

[13] Habig WH, Jakoby WB. Glutathion S-transferases (rat and human). Methods Enzymol 1981; 77: 218-31.

[14] Satoh K. Serum lipid peroxide in cerebrovascular disorders determined by a new colorimetric method. Clin Chim Acta 1978; 90: 37-43.

[15] Tietze F. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: Applications to mammalian blood and other tissues. Anal Biochem 1969; 27: 502-22.

[16] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976; 72: 248-54.

[17] Uner N, Oruc EO, Sevgiler Y, Sahin N, Durmaz H, Usta D.  Effects of diazinon on acetylcholinesterase activity and lipid peroxidation in the brain of Oreochromis niloticus. Environ Toxicol Pharmacol 2006; 21: 241-5.

[18] Oruc E. Effects of diazinon on antioxidant defense system and lipid peroxidation in the liver of Cyprinus carpio (L.). Environ Toxicol 2010; 26: 571-8.

[19] Akturk O, Demirin H, Sutcu R, Yilmaz N, Koylu H, Altuntas I. The effects of diazinon on lipid peroxidation and antioxidant enzymes in rat heart and ameliorating role of vitamin E and vitamin C. Cell Biol Toxicol 2006: 22: 455-61.

[20] Salehi M, Jafari M, Saleh Moqadam M, Salimian M, Asghari A, Nateghi M, et al. The effect of diazinon on rat brain antioxidant system. Toxicol Lett 2009; 189: S123.

[21] Abdou HM, El Mzoudy RH. Oxidative damage, hyperlipidemia and histological alterations of cardiac and skeletal muscles induced by different doses of diazinon in female rats. J Hazardous Materials 2010; 182: 273-8.

[22] Ezemonye L, Tongo L. Sublethal effects of endosulfan and diazinon pesticides on glutathione-S-transferase (GST) in various tissues of adult amphibians (Bufo regularis). Chemosphere 2010; 81: 214-7.

[23] Isik I, Celik I. Acute effects of methyl parathion and diazinon as inducers for oxidative stress on certain biomarkers in various tissues of rainbowtrout (Oncorhynchus mykiss). Pest Biochem Physiol 2008; 92: 38-42.

[24] El-Demerdash FM. Lipid peroxidation, oxidative stress and acetylcholinesterase in rat brain exposed to organophosphate and pyrethroid insecticides. Food Chem Toxicol 2011; 49: 1346-52.

[25] Lopez-Cruz RI, Zenteno-Savin T, Galvan-Magana F. Superoxide production, oxidative damage and enzymatic antioxidant defenses in shark skeletal muscle. Comp Biochem Physiol, Part A, 2010; 156: 50-6.

[26] Ahmadi S, Jafari M, Asgari A, Salehi M. Acute effect of diazinon on the antioxidant system of rat’s heart tissue. Kowsar Med J 2011; 16: 87-93. [Farsi]

[27] Dorval J, Hontela A. Role of glutathione redox cycle and catalase in defanse against oxidative stress induced by endosulfan in adrenocortical cells of rainbow trout. Toxicol Appl Pharmacol 2003; 192: 191-200.

[28] Caylak E, Aytekin M, Halifeoglu I. Antioxidant effects of methionine, a-lipoic acid, N-acetylcysteine and homocysteine on lead-induced oxidative stress to erythrocytes in rats. Exper Toxicol Pathol 2008; 60: 289-94.

[29] Liu Y, Zhang H, Zhang L, Zhou Q, Wang X, Long J, et al. Antioxidant N-acetylcysteine attenuates the

acute liver injury caused by X-ray in mice. Euro J Pharmacol 2007; 575: 142-8.

[30] Yilmaz N, Yilmaz M, Altuntas I. Diazinon-induced brain toxicity and protection by vitamins E plus C. Toxicol Ind Health 2012; 28: 51-7.