جلد 17، شماره 10 - ( 10-1397 )                   جلد 17 شماره 10 صفحات 936-925 | برگشت به فهرست نسخه ها

XML English Abstract Print

Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Karami Robati A, Khalili M, Hashemi Hazaveh S, Bayat M. Studying the Subtilisin Virulence Genes (1-7) in Trichophyton Rubrum Isolated from Clinical Samples of Skin and Nail in 2017: A Descriptive Study . JRUMS 2019; 17 (10) :925-936
URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-4297-fa.html
کرمی رباطی ازاده، خلیلی محمد، هاشمی سید جمال، بیات منصور. بررسی ژن‌های بیماری‌زا سوبتیلیزین (7-1) درگونه ترایکوفایتون روبروم جدا شده از نمونه‌های بالینی پوست و ناخن در سال 1396: یک مطالعه توصیفی . مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان. 1397; 17 (10) :925-936

URL: http://journal.rums.ac.ir/article-1-4297-fa.html

بررسی ژن‌های بیماری‌زا سوبتیلیزین (7-1) درگونه ترایکوفایتون روبروم جدا شده از نمونه‌های بالینی پوست و ناخن در سال 1396: یک مطالعه توصیفی
ازاده کرمی رباطی ، محمد خلیلی ، سید جمال هاشمی ، منصور بیات
گروه انگل شناسی و قارچ شناسی، دانشکده بهداشت، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران
واژه‌های کلیدی: ژن‌های سوبتیلیزین، درماتوفیتوزیس، ترایکوفایتون روبروم، پوست، ناخن، تهران
متن کامل [PDF 240 kb]   (1051 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (4160 مشاهده)
متن کامل:   (1873 مشاهده)
مقاله پژوهشی
مجله دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان
دوره 17، دی 1397، 936-925
 
بررسی ژن­های بیماری­زا سوبتیلیزین (7-1) درگونه ترایکوفایتون روبروم جدا شده از نمونه­های بالینی پوست و ناخن در سال 1396:
یک مطالعه توصیفی
 
 
آزاده کرمی رباطی[1]، محمد خلیلی[2]، سید [j1] جمال هاشمی هزاوه[3]، منصور بیات4
 
دریافت مقاله: 1/3/97     ارسال مقاله به نویسنده جهت اصلاح: 9/7/97      دریافت اصلاحیه از نویسنده: 21/7/97         پذیرش مقاله: 22/7/97
 
 

چکیده
زمینه و هدف: خانواده ژنومی سوبتیلیزین (Subtilisins; SUBs) ترایکوفایتون روبروم، نقش مهمی در تخریب بافت کراتین در جهت تولید یک منبع مغذی و حدت­زایی، ایفاء می کند. این مطالعه با هدف تعیین ژن­های سوبتیلیزین (7-1) در گونه ترایکوفایتون روبروم جدا شده از بیماران مبتلا به درماتوفیتوزیس ساکن شهر تهران در سال 1396 انجام شده است.
مواد و روش‌ها: مطالعه توصیفی حاضر، بر روی 32 بیمار مبتلا به عفونت قارچی مراجعه کننده به دانشگاه علوم پزشکی تهران از تیر ماه تا شهریور ماه سال1396 انجام گرفت. بر اساس مشاهدات میکروسکوپی و ماکروسکوپی، گونه ترایکوفایتون روبروم جداسازی و شناسایی شد. DNA درماتوفیت استخراج و سپس ژن­های SUB1، SUB2،SUB3 ، SUB4، SUB5، SUB6 و SUB7 با روش مولکولی واکنش زنجیره­ای پلیمراز(PCR)  با پرایمرهای اختصاصی تکثیر گردیدند. درصد فراوانی نسبی هر یک از هفت توالی ژنومی نیز محاسبه گردید.
یافته‌ها: 7 گونه ترایکوفایتون روبروم از نمونه بالینی پوست (5 مورد) و ناخن (2 مورد) جداسازی شدند. خانواده سوبتیلیزین ( (SUB1-7با فراوانی 57 درصد گزارش شد. در حالی­که ژن SUB5 (100 درصد) در تمام ایزوله­ها مشاهده شد، ژن SUB6 با کم‌ترین فراوانی (4 از 7 مورد) و حضور هفت ژن سوبتیلیزین در گونه های جدا شده از بافت ناخن، گزارش شد.    
نتیجه‌گیری: حضور و عدم حضور ژن­های سوبتیلیزین در DNA ایزوله­های ترایکوفایتون روبروم، احتمالاٌ حاکی از اهمیت هر یک از ژن­ها در مراحل مختلف عفونت (اتصال، تهاجم و التهاب) درماتوفیت و نوع بافت ناخن و پوست می‌باشد.
واژه‌های کلیدی: ژن‌های سوبتیلیزین، درماتوفیتوزیس، ترایکوفایتون روبروم، پوست، ناخن، تهران
 
 
مقدمه
ترایکوفایتون روبروم عامل اصلی درماتوفیتوزیس انسانی، عفونت‌های مزمن و عود کننده قارچی در جهان است ]1[. مکانیسم اتصال و تهاجم درماتوفیت­ها عمدتاً با ترشح اندوپروتئازها و اگزوپروتئازها آغاز می‌شود ]2[. گونه ترایکوفایتون روبروم در طی روند عفونت با ترشح اندوپروتئازهایی مانند سوبتیلیزین­ها و متالوپروتئازها، قادر به حلال سازی کراتین و پروتئین­های فیبری موجود در ساختار پوست، مو و ناخن می‌شود ]4-3[. در مطالعات مختلف مجموعه‌ای از پروتئازها که توسط ژن­های سوبتیلیزین (Subtilisins; SUBs) ترایکوفایتون روبروم کدگذاری شده‌اند، با استفاده از روش پروتئولیز و طیف سنجی جرم شناسایی شدند [6-5].  
مطالعه­ای در خصوص حضور دو خانواده، متالوپروتئازها و سوبتلیزین‌ها با استفاده از روش PCR با کمک آغازگرهای اختصاصی در پرتغال انجام گرفت که حاکی از حضور این دو خانواده ژنومی در جنس ترایکوفایتون و عدم حضور برخی از توالی ژنومی در برخی از ایزوله­های بالینی و هم­چنین در جنس­های میکروسپوروم و اپیدرموفایتون بود ]7[. مطالعه بر روی فعالیت آنزیمی و خصوصیات مولکولی پروتئین سوبتیلیزین در گونه میکروسپوروم ژیپسئوم و ترایکوفایتون  وانبروزگمئی در ایران، جهت مطالعات پاتوژنیک و سایر اهداف کاربردی انجام گرفته است ]8[. مطالعات مختلف نشان دادند که ترشحات پروتئینازها (مانند خانواده  SUBو Trichophyton rubrum 4 antigen; Tri r4) نه تنها می­توانند پروتئین‌هایی مانند کراتین، الاستین و کلاژن برای تاٌمین مواد مغذی قارچ­ها تجزیه کنند، بلکه می­توانند مکانیسم­های دفاعی میزبان را کنترل و حساسیت نوع تاٌخیری را ایجاد کند ]9[. مطالعه برروی آلرژنTri r2  (SUB6) آن را به عنوان یک مارکر جهت تشخیص کچلی ناخن با روش آنالیز پروتئین­ها (پروتئومیکس) تولید شده توسط ترایکوفایتون روبروم برروی نمونه بالینی ناخن، معرفی کرد ]10[.
سوبتیلیزین‌ها عمدتاٌ به خانواده سرین پروتئازهای خارج سلولی تعلق دارند ]11[. سرین پروتئاز ترشح شده توسط قارچ­های بیماری­زا متعلق به زیر خانواده سوبتیلیزین(S8A)  است. جرم مولکولی این آنزیم­ها 28 الی30 کیلو دالتون و در محیط خنثی و برخی در محیط قلیایی با pH حدود 8 تا 9 فعالیت دارند، به همین دلیل آن­ها پروتئازها قلیایی (Alkaline Proteases; Alp) نامیده می­شوند ]12[.
یک خانواده ژنومی هفت عضوی منحصر به فرد، سوبتیلیزین­ها را در گونه ترایکوفایتون روبروم کدگذاری می­کنند که به اختصار ژن­ها را با   SUBو پروتئین­ها را با Sub نشان می­دهند. SUB1، SUB2 و SUB3-7 به ترتیب دارای دو، چهار و سه اینترون هستند. در میان Subs ترایکوفایتون روبروم، تطابق بین توالی اسیدهای آمینه از 4/29٪ (بین Sub2 و Sub6) تا 4/67٪ (بین Sub3 و Sub4) وجود دارد ]13[. با توجه به این که حضور ژن­های حدت­زای سوبتیلیزین در درماتوفیت­ها خطر ابتلاء به درماتوفیتوزیس را افزایش می­دهند ]3[، لذا مطالعه حاضر با هدف تعیین فراوانی نسبی هر یک از ژن­های سوبتیلیزین در گونه تریکوفایتون روبروم جدا شده از بیماران مبتلا به کچلی بدن و ناخن انجام گردید.
مواد و روش‌ها
پژوهش حاضر یک مطالعه توصیفی- مقطعی است که بر روی 32 بیمار مبتلا به عفونت قارچی مراجعه کننده به آزمایشگاه قارچ شناسی دانشگاه علوم پزشکی تهران از تیرماه تا شهریور ماه سال 1396 انجام گرفت. جمعیت مورد مطالعه شامل تمام گروه­های سـنی زن و مـرد بـا مـشاغل مختلف بودند. بعد از مشاهدات بالینی، ضایعات مشکوک به درماتوفیتوزیس وارد مطالعه گردیدند. در تمام مراحل ملاحظات اخلاقی رعایت گردید و ضمناُ این مطالعه دارای کد اخلاقی از دانشگاه علوم پزشکی تهران (IR.TUMS.SPH.Rec1395.1339) می باشد.
محل ضایعه بـا اسـتفاده از گـاز آغشته به الکل 70 درصد تمـیز شـد، سـپس بـا اسـکالپل استریل از کناره‌های تازه و فعال ضایعه، پوسته‌ها تراشـیده و روی لام تمیزی جمــع آوری شـدند. در ضایعات مشکوک ناخن، بعد از تمیز کــردن نـاخن بـا الکل 70 درصد، ابتـدا قسـمت انتـهایی نـاخن بـا اسـتفاده از ناخن گیر استریل چیده و دور ریخته شــد، پـس از آن بـا استفاده از تیغه اسکالپل حد فاصل ناحیه مبتلا و سالم ناخن تراشـیده شـد و تـراش اول دور ریختــه شــد ]14[.
تراشه­های پوست را باKOH 20 درصد و تراشه­های ناخن را با  KOH 10%+DMSO شفاف شدند که مشاهده هایف و آرتروکونیدی به عنوان موارد مستقیم مثبت در نظر گرفته شدند. جهت شناسایی گونه ترایکوفایتون روبروم از محیط انتخابی و افتراقی درماتوفیت­ها از جمله محیط مایکوزیل آگار (مرک، آلمان) و محیط سابرودکستروزآگار با کلرآمفنیکل و سیکلوهگزامید (SCC)  Conda)  اسپانیا)، به صورت نقطه­ای کشت داده شد.
کلنی­های ترایکوفایتون روبروم رشد یافته با سطحی کرکی سفید و پیگمان پشتی آن قرمز و سیاه رنگ که در داخل محیط کشت انتشار یافته و تمام آگار موجود در پتری­دیش را رنگی می کند. از پلیت­های دارای ویژگی­های فوق، کشت بر روی لام تهیه شد و طی بررسی­های میکروسکوپی، مشاهده ماکروکونیدی، میکروکونیدی و هایف­های سپتوم­دار به شناسایی گونه درماتوفیت منجر شد.
برای تهیه محیط­ کشت مغذی، جهت کمک به تشخیص قطعی و سریع­تر عامل قارچی، از دانه برنج عصاره­گیری و برای جامد کردن آن میزان 2 درصد آگار استفاده شد و سپس به محیط سابورودکستروز آگار اضافه شد. در محیط­ تهیه شده از عصاره برنج رشد سریع و واضح­تر درماتوفیت نسبت به سابورودکستروز آگار معمولی مشاهده شد، اندازه کلنی­ها نیز در آن­ها بزرگ‌تر و رنگدانه قرمز پس از حدود 6 روز از ایزوله­ها ظاهر گشت. سپس جهت مشاهده عناصر قارچی (ماکروکونیدی و میکروکونیدی) اسمیر بر روی لام تهیه و با رنگ Lactophenol Cotton Blue  به روش تیزمان رنگ آمیزی شد ]15[.
به منظور تهیه توده کافی از میسلیوم­ها جهت استخراج DNA درماتوفیت، مقداری از کلنی­های مورد نظر به 5 پلیت حاوی 20 میلی­لیتر محیط سابورودکستروز مایع (مرک، آلمان)، انتقال داده شد. زمانی که توده میسلیومی به طور یکنواخت و قبل از تشکیل میسلیوم­های هوایی در سطح پلیت­ها  قرار گیرند، جمع­آوری و بر روی یک گاز استریل انتقال داده شد. سپس با1X    PBS شستشو و در دمای 20- درجه سانتی­گراد نگهداری شدند تا مراحل استخراج DNA بر روی آن­ها انجام شود ]16[.
حدود 3-1 گرم از توده میسلیوم در یک هاون چینی به همراه نیتروژن مایع به خوبی پودر شد و مقدار 1/0گرم از آن به لوله اپندرف 5/1 میلی‌لیتری ریخته شد و مراحل استخراج با توجه به پروتکل کیت استخراج DNA قارچ‌های رشته­ای شرکت Denazist Asia ، مشهد، انجام گردید.
  • از پایان مراحل تخلیص، OD 260/ 280 نمونه­ها خوانده شد تا غلظت DNA ژنومی به‌دست آید و سپس به کمک روش ژل الکتروفورز (PNP-1000d Padideh nojen pars، ساخت ایران) (ژل 1 درصد) کیفیت DNA  تخلیص شده نیز ارزیابی گردید ]17[.
آغازگرها (پرایمرها) الیگونوکلئوتید مورد استفاده در مطالعه حاضر در جدول 1 آورده شده است ]7[. پرایمرها بر اساس توالی­ نوکلئوتیدی ژن­های SUB1-7 ترایکوفایتون روبروم از شرکت ژن فن­آوران خریداری شد. تمام تکثیر PCR در یک دستگاه ترمال سایکلر (Applied Biosysems، ساخت آمریکا) انجام گردید.
  • اجرا شده برای PCR عبارت بود از مرحله اول 94 درجه سانتی­گراد با زمان 5 دقیقه، یک چرخه واسرشت سازی اولیه، مرحله دوم 94 درجه سانتی­گراد با زمان 30 ثانیه، مرحله سوم با توجه به نوع پرایمر دمای اتصال پرایمرها 55 تا 60 درجه سانتی‌گراد، محاسبه شد. مرحله چهارم با دمای 72 درجه سانتی­گراد و زمان یک دقیقه و پانزده ثانیه که جمعاً 35 چرخه برای تکثیرDNA  و کل این فرآیند بیش‌تر از دو ساعت طول کشید ]7[. برای تفکیک قطعات  DNAو آگاهی از محصولPCR  و نیز قابل مشاهده نمودن آن­ها، هر کدام از محصولات PCR روی ژل آگارز به مدت یک ساعت با ولتاژ 90، الکتروفورز (PNP-1000d Padideh nojen pars، ساخت ایران) گردید.
جهت تشخیص قطعه DNA مشاهده شده هر یک از ژن‌های سوبتلیزین بر حسب واحد (جفت باز) از DNA Ladder استفاده شد و سپس با قطعه توالی ژن­ها (Sequence ID)  بر حسب واحد که در پایگاه داده GenBank در دسترس است، مقایسه شد. در این مطالعه، درصد فراوانی نسبی هر یک از ژن­های سوبتیلیزین و توزیع فراوانی آن­ها در بین ایزوله­ها با استفاده از نرم‌افزار  SPSS نسخه 16 و با آزمون مجذور chi-square آنالیز گردید.
 

جدول1- آغازگرها الیگونوکلئوتید ژن­های SUB1-7 ]7[
ترایکوفایتون روبروم
ژن                                                 آغازگرها(5´---> 3´)                      Sequence ID          
AY343499.1 ATCCTGTCTATGCCTCATG
AATCGAAGTCGAAGTTATC		 SUB1   For
             Rev
AY343500.1 ATATCTCGTCACACTGAAGG
CCTGGATGCCATTGTACAC		 SUB2    For
              Rev
AY343501.1 TTATCTCCGTCTTCCTAGC
AGCAACGCTAACACCCTG		 SUB3    For
              Rev
AY344481.1 AAGACTCAGGGCCACAAG
TTCCGATCATGTAGGCAC		 SUB4    For
              Rev
AY344482.1 GAAGTTGTGCCCAATGGC
CTCCAGGCCTAGCAGAAAG		 SUB5   For
            Rev
AF420485.1 CGATTCAGAACTGATTATGATG
GAGGTTTGGAGGCAGGTTC		 SUB6   For
            Rev
AF407184.1
 		 CTTGCCTAGACACTTCAATG
ATGAGGTAGGCACCGAGAC		 SUB7   For
           Rev
                                 SUB═Subtilisin gene
 
نتایج
در مدت 2 ماه، 7 ایزوله های ترایکوفایتون روبروم از 5 نمونه پوست و 2 نمونه ناخن بر اساس مشاهدات میکروسکوپی و ماکروسکوپی شناسایی شد. نتایج مثبت محصولات PCR با مشاهده قطعات مختلف ژن‌های SUB1 و SUB4 که در شکل 1،  SUB2وSUB5  در شکل 2، SUB7 وSUB6  در شکل 3 و SUB3 در شکل 4 آورده شده است، نشان دهنده حضور و عدم حضور هر یک از ژن­های حدت­زای سوبتلیزین در DNA ایزوله‌های ترایکوفایتون روبروم است.
توزیع هر یک از ژن­های SUB1-7 در بین نمونه­های
بالینی پوست و ناخن در جدول 2 ذکر شده است. حضور خانواده سوبتیلیزین ( (SUB1-7در ایزوله­های ترایکوفایتون روبروم با فراوانی 57 درصد (4 از 7 ایزوله) گزارش شد. در حالی­که ژن SUB5 (100 درصد) در تمام ایزوله­ها مشاهده شد، ژن  SUB6در 4 از 7 ایزوله (57 درصد) مشاهده شد و کم‌ترین حضور در بین توالی ژن های سوبتیلیزین را دارد. درصد فراوانی نسبی SUB1، SUB2،SUB3 ،SUB4  وSUB7 ، 86 درصد (6 از 7 ایزوله) گزارش شد. حضور هر هفت توالی ژن سوبتیلیزین در گونه­های جدا شده از نمونه­های ناخن، به عنوان یک بافت کراتین سخت، نکته قابل توجه در این مطالعه است.
 

شکل 1- بلوک A: نتایج مثبت با مشاهده باند bp1500 ژن SUB1  برای 6 از 7 ایزوله ترایکوفایتون روبروم؛ ستون 1 تا 5- نمونه پوست. ستون 6 و 7- نمونه ناخن. بلوک B: نتایج مثبت با مشاهده باند bp1200 ژن SUB4  برای 6 از 7 ایزوله ترایکوفایتون روبروم؛ ستون1 تا 5- نمونه پوست. ستون 6 و 7- نمونه ناخن. ستونC - کنترل منفی ایزوله میکروسپوروم کنیس. ستونM – مارکر (Ladder) DNA با bp3000-100
شکل 2- بلوک A: نتایج مثبت با مشاهده باند bp1400 ژن SUB2 برای 6 از 7 ایزوله ترایکوفایتون روبروم؛ ستون  1 تا 5- نمونه پوست. ستون  6 و 7- نمونه ناخن. بلوک B: نتایج مثبت با مشاهده باند bp1100 ژن SUB5 برای 7 از 7 ایزوله ترایکوفایتون روبروم؛ ستون 1تا 5- نمونه پوست. ستون  6 و 7- نمونه ناخن. ستونC - کنترل منفی ایزوله میکروسپوروم کنیس. ستون M– مارکر (Ladder) DNA با bp 3000-100

شکل 3- بلوک A: نتایج مثبت با مشاهده باند bp1650 ژن SUB6 برای 4 از 7 ایزوله ترایکوفایتون روبروم؛ ستون 1 تا 5- نمونه پوست. ستون 6 و 7- نمونه ناخن. بلوک B: نتایج مثبت با مشاهده باند bp1567 ژن SUB7 برای 6 از 7 ایزوله ترایکوفایتون روبروم؛ ستون 1 تا 5- نمونه پوست. ستون 6 و 7- نمونه ناخن. ستون C- کنترل منفی ایزوله میکروسپوروم کنیس. ستون M– مارکر (Ladder)DNA   با bp3000-100

 
 
شکل 4- نتایج مثبت با مشاهده باند bp1300 ژن SUB3 برای 6 از 7 ایزوله ترایکوفایتون روبروم؛ ستون 1 و 2- نمونه ناخن. ستون 3 تا 7- نمونه پوست. ستونC - کنترل منفی ایزوله میکروسپوروم کنیس. ستونM – مارکر (Ladder) DNA با bp3000-100.
 
جدول 2-   توزیع فراوانی ژن­های SUB1-7  ترایکوفایتون روبروم در بین نمونه­های ناخن و پوست در سال 1396
 
  ژن­های سوبتیلیزین نمونه­های بالینی
(درماتوفیتوزیس)		  
    کل
 تعداد(درصد)		 SUB7
تعداد (درصد)		 SUB6
تعداد (درصد)		 SUB5
 تعداد(درصد)		 SUB4
تعداد (درصد)		 SUB3
تعداد (درصد)		 SUB2
تعداد (درصد)		 SUB1
 تعداد(درصد)		  
  100%) 7) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) نمونه پوست 1    
    100%) 7) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) نمونه پوست 2  
    100%) 6) 7/16%) 1) 0%) 0) 7/16%) 1) 7/16%) 1) 7/16%) 1) 7/16%) 1) 7/16%) 1) نمونه پوست 3  
    100%) 2) 0%) 0) 0%) 0) 50%) 1) 0%) 0) 50%) 1) 0%) 0) 0%) 0) نمونه پوست 4  
    100%) 5) 20%) 1) 0%) 0) 20%) 1) 20%) 1) 0%) 0) 20%) 1) 20%) 1) نمونه پوست 5  
    100%) 7) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) نمونه ناخن 1  
    100%) 7) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) 3/14%) 1) نمونه ناخن 2  
    100%) 41) 6/14%) 6) 8/9%) 4) 1/17%) 7) 6/14%) 6) 6/14%) 6) 6/14%) 6) 6/14%) 6) کل  
* تعداد (درصد)
 
 
بحث 
هدف از این مطالعه، تعیین فراوانی نسبی هر یک از هفت ژن سوبتلیزین ترایکوفایتون روبروم از نمونه­های بالینی، جهت مشخص نمودن اهمیت برخی از توالی ژن‌ها نسبت به سایر ژن­ها در روند عفونت درماتوفیت بود. درماتوفیت­ها، قارچ­های بیماری­زا هستند که افراد سالم را نیز بیمار و با تولید آنزیم­های سوبتیلیزین فقط در شرایط in vivo به عنوان شاخصی از اهمیت آن­ها در حدت‌زای درماتوفیت­ها شناخته شده است [19-18]. در این مطالعه، ژن  SUB5در گونه ترایکوفایتون روبروم با فراوانی 100 درصد گزارش شد که Lemsaddek  و همکاران، ژن SUB5 با فراوانی 89 درصد برای گونه ترایکوفایتون روبروم و با فراوانی 100 درصد برای گونه­های ترایکوفایتون مگنینی، سوداننس، ویولاسئوم و وروکوزوم گزارش کردند [7].
روند عفونت درماتوفیت­ها در میزبان شامل 3 مرحله اصلی است: اتصال به بافت میزبان، تهاجم و ایجاد پاسخ ایمنی میزبان است ]20[. نقش آنزیمی این خانواده ژنومی در مرحله اتصال و تهاجم اولیه درماتوفیت­ها خواهد بود ]21[. مقایسه فراوانی حضور ژن SUB1،SUB2 ،SUB3 ، SUB4 و  SUB7(86 درصد) با SUB6 (57 درصد) و SUB5 (100 درصد) در این مطالعه، احتمالاُ نشان دهنده اهمیت هر یک از ژن­ها در مراحل مختلف عفونت است. Staib و همکاران با بررسی نقش پروتئازهای ترشح شده منحصر به فرد در عفونت­های شدید التهابی پوست در انسان و جوندگان با استفاده از روش میکرواری (Microarray) بر روی بیان حداقل 23 ژن پروتئاز در شرایط in vivo در درماتوفیت­ها، نشان دادند که بیان ژن SUB6 به عنوان یک آلرژن مهم مرتبط با گونه ترایکوفایتون روبروم در ارتباط با واکنش­های التهابی میزبان، در طول عفونت به شدت افزایش یافته است ]22[.Lemsaddek   و همکاران، ژن SUB6 با فراوانی 50 درصد برای گونه ترایکوفایتون روبروم (44 مورد) و سوداننس و هم‌چنین  با فراوانی 43 درصد برای گونه ترایکوفایتون ویولاسئوم گزارش می­کنند که با نتایج مطالعه حاضر هم­خوانی دارد [7].
از ویژگی­های متمایز بافت کراتین، پیوندهای دی‌سولفیدی نسبتاً بالای آن به علت حضور سولفور در آمینو اسیدها مانند سیستئین و متیونین است. متناسب با میزان این اسید آمینه‌ها در بافت کراتین، دو بافت سخت (ناخن و مو) و نرم (پوست) کراتین  معرفی می­شوند ]23[. انیکومیکوزیس ناشی از گونه ترایکوفایتون روبروم، بافت کراتین ناخن را تخریب و در صفحات ناخن کانال­های بزرگ را ایجاد می‌کند که بزرگ‌تر از هایف درماتوفیت است که نشان دهنده فعالیت آنزیمی خارج سلولی است
]13.[ حضور خانواده سوبتیلیزین در گونه­های ترایکوفایتون روبروم جدا شده از نمونه­های ناخن در مطالعه حاضر با نتایج Lemsaddek  و همکاران از محاسبه خطر نسبی مرتبط با حضور ژن­های SUB4-7 در جنس ترایکوفایتون با فاصله اطمینان 95 درصد، نشان داد ابتلاء به کچلی ناخن نسبت به کچلی بدن در انسان افزایش می‌یابد، هم­خوانی دارد [7]. حداقل حضور دو توالی ژنی از خانواده سوبتلیزین در ایزوله­ها بومی تهران، ایران گزارش شد، در حالی که در مطالعه مشابه هیچ یک از 7 توالی ژنومی در 4 ایزوله ترایکوفایتون روبروم بومی پرتغال، مشاهده نشد [7].
در این مطالعه SUB6 با کم‌ترین فراوانی گزارش شد که علت عمده آن می‌تواند ناشی از نقش بیان این ژن به عنوان یک آلرژن در ایجاد پاسخ ایمنی میزبان در مرحله تهاجم و نفوذ درماتوفیت به لایه شاخی پوست است [13] و هم‌چنین پروتئین Sub6 در مطالعه Méhul و همکاران از تمام نمونه­های بستر ناخن آلوده (105 مورد) به ترایکوفایتون روبروم، تشخیص داده شد [10]، در مطالعه ما بیش‌تر نمونه پوست و بدون واکنش­های ایمنی بوده است، بنابراین این ژن  با کمترین فراوانی مشاهده گردید. از آن جایی­که پژوهش حاضر حاصل طرح دانش‌جویی و مشمول محدودیت زمانی بوده است، انجام طرحی مشابه در محدوده زمانی طولانی­تر جهت ارائه آمار دقیق­تر و گونه‌های بیش‌تر به ­همراه تشخیص مراحل درماتوفیتوزیس در نمونه­های مختلف بالینی، پیشنهاد می‌گردد.
نتیجه‌گیری
در مطالعه حاضر با گزارش فراوانی متفاوت از حضور ژن­های سوبتلیزین در ایزوله­های ترایکوفایتون روبروم از نمونه­های بالینی، حاکی از اهمیت هر یک از ژن­ها در مراحل مختلف عفونت و نوع بافت کراتین (پوست و ناخن) است.
تشکر و قدردانی
بدینوسیله از کارشناسان محترم آزمایشگاه قارچ‌شناسی دانشکده علوم پزشکی تهران در جمع‌آوری نمونه‌های بالینی همکاری نمودند، قدردانی می‌شود.
.
 
 
 
 
 
 
 
 
References
 
 
[1] Nenoff P, Kruger C, Ginter-Hanselmayer G, Tietz HJ, Nenoff P, Kruger C, et al. Mycology - an update. Part 1: Dermatomycoses: causative agents, epidemiology and pathogenesis. J Dtsch Dermatol Ges 2014; 12(3): 188–209.
[2] Baldo A, Monod M, Mathy A, Cambier L, Bagut ET,  Defaweux V, et al. Mechanisms of skin adherence and invasion by dermatophytes. Mycoses 2012; 55(3): 218-23.
[3] Latka C, Dey SS, Mahajan S, Prabu R, Jangir PK, Gupta C, et al. Genome sequence of a  clinical isolate of dermatophyte, Trichophyton rubrum from India. FEMS Microbiol Lett  2015; 362(8):1-4
 [4] Peres NT, Maranhão FC, Rossi A, Martinez-Rossi NM. Dermatophytes: Host-pathogen interaction and antifungal resistance. An Bras Dermatol 2010; 85(5): 657-67.
 [5] Maranhao FC, Paiao FG, Martinez-Rossi NM. Isolation of transcripts over-expressed in human pathogen Trichophyton rubrum during growth in keratin. Microb Pathogenesis 2007; 43(4): 166–72.
 [6] Leng W, Liu T, Wang J. Expression dynamics of secreted protease genes in Trichophyton rubrum induced by key host’s proteinaceous components. Med Mycol 2009; 47(7): 759–65.
[7]  Lemsaddek L, Chambel L, Tenreiro R. Incidence of fungalysin and subtilisin virulence genes in dermatophytes. Current Research,Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology. Microbiol Bo Ser 2010; 1(13): 656-65.
[8] Moallaei H, Zaini F, Rezaie S, Nourbakhsh F, Larcher G. The Enzymatic Activity and Molecular Characterization of a Secreted Subtilisin-Like Protease in Microsporum gypseum and Trichophyton vanbreuseghemii. Iranian J Publ Health 2009; 38(1): 25-33.
[9]  Hadadi F, Sabokbar A, Dezfulian M. Study of Relationship between Genetic Pattern and Susceptibility to Terbinafine in Clinical Isolated of Trichophyton rubrum. J  Ardab  Univers  Medic Scien 2014; 14(2): 133- 46.
[10]  Méhul B, Gu Z, Jomard A, Laffet G, Feuilhade M, Monod M. Sub6 (Tri r 2), an Onychomycosis Marker Revealed by Proteomics Analysis of Trichophyton rubrum Secreted Proteins in Patient Nail Samples. J Invest Dermatol 2016; 136(1): 331-3
[11]  Monod M, Capoccia S, Léchenne B, Zaugg C, Holdom M, Jousson O. Secreted proteases from pathogenic fungi. J Med Microbiol 2002; 292(5-6): 405-19.
[12]  Monod M. Secreted proteases from dermatophytes. Mycopathol 2008; 166(5-6): 285–94.
[13] Jousson O, Lechenne B, Bontems O, Mignon B, Reichard U, Barblan J. Secreted subtilisin gene family in Trichophyton rubrum. Gene 2004; 339(2004): 79-88.
[14] Shokohi T, Hajheidari Z, Haghani E, Khalilian A, Aghili S, Miahi S. The study of 101 cases of onychomycosis and associate factors in patients referred to Boali Sina Hospital and Toba dermatology outpatient clinics in Sari. J Mazandaran Univ Med Sci 2009; 19 (71): 33-43. [Farsi]
[15] Karami Robati A, Khalili M, Hashemi Hazaveh SJ, Bayat M.  Assessment of the subtilisin genes in Trichophyton rubrum and Microsporum canis from dermatophytosis. Comp Clin Pathol 2018; 27(5): 1343-47.
[16] Noorbakhsh F, Mirrahimi M, Rezaie S, Ajodanifar H. Characterization of squalene epoxidase encoding gene in dermatophyte pathogen Trichophyton violaceum. J Microbial World 2013; 6(3): 212-18. [Farsi]
[17]  Ghafoori Harat S, Basirnia  T, Moosavi MR. A simple method to extract filamentous fungal genomic DNA. Rese PlanPathol 2016; 5(4): 57-66. [Farsi]
[18] Peres NT, Sanches PR, Falcao JP. Transcriptional profiling reveals the expression of novel genes in response to various stimuli in the human dermatophyte Trichophyton rubrum. BMC Microbiol 2010; 10(1): 2-10.
[19] Achterman RR, White TC. Dermatophyte virulence factors: Identifying and analyzing genes that may contribute to chronic or acute skin infections. Int J Microbiol 2012; 2012(5): 1-8.
[20]  Chinnapun D.  Virulence Factors Involved in Pathogenicity of Dermatophytes. Walailak J Sci & Tech 2015; 12(7): 573-80.
[21]  Mathy A, Baldo A, Schoofs L,  Cambier L, Defaweux V, Tabart J, et al. Fungalysin and dipeptidyl-peptidase gene transcription in Microsporum canis strains isolated from symptomatic and asymptomatic cats. Vet Microbiol 2010; 146(1-2): 179–82.
 [22]  Staib P, Zaugg C, Mignon B, Weber J, Grumbt M, Pradervand S, et al. Differential gene expression in the pathogenic dermatophyte Arthroderma benhamiae in vitro versus during infection. Microbiol  2010; 156(Pt 3): 884-95
[23] Richa Sharma R. Effect of keratin substrates on the growth of keratinophilic fungi. J Acad Indus Res 2012; 1(4): 170-2.


Studying the Subtilisin Virulence Genes (1-7) in Trichophyton Rubrum Isolated from Clinical Samples of Skin and Nail in 2017:[12] 
A Descriptive Study
A. Karami Robati[4], M. Khalili[5], S.J. Hashemi Hazaveh[6], M. Bayat4.
 
 
Received: 22/05/2018  Sent for Revision: 01/10/2018    Received Revised Manuscript: 13/10/2018              Accepted: 14/10/2018
 
 
Background and Objectives: The subtilisin genes (SUBs) of Trichophyton rubrum play an important role in destroying the keratin to produce a nutritional source and virulence. This study was carried out to determine the presence of subtilisin genes in T. rubrum isolated from patients with dermatophytosis in Tehran in 2017.
Materials and Methods: This descriptive study was performed on 32 patients with fungal infections referring to Tehran University of Medical Sciences from July to September 2017. Based on microscopic and macroscopic observations, T. rubrum was isolated and identified. Dermatophyte DNA was extracted and SUB1, SUB2, SUB3, SUB4, SUB5, SUB6 and SUB7 genes of T. rubrum were amplified by polymerase chain reaction (PCR) using specific primers. The relative frequency of the seven genomic sequences was also calculated.
Results: Seven species of T. rubrum were isolated from the clinical specimen of skin (5 cases) and nail (2 cases). The presence of subtilisin family (SUB1-7) was reported with a frequency of 57%. While SUB5 gene was observed in all isolates (100%), the SUB6 gene with the lowest frequency (4 out of 7 cases) and SUB1-7 genes presence in isolates from nail samples were reported.
Conclusion: The presence and absence of subtilisin genes in T. rubrum DNA may indicate the importance of genes in different stages of dermatophyte infection  (adherence, invasion and inflammation) and the type of nail and skin structure.
Keywords: Subtilisin genes, Dermatophytosis, Trichophyton rubrum, Skin, Nail, Tehran
  • : This was a self-funded study.
Conflict of interest: None declared.
Ethical approval: The study was approved by the Ethics Committee of Tehran University of Medical Sciences (IR.TUMS.SPH.Rec1395.1339).
 
How to cite this article: Karami Robati A, Khalili M, Hashemi Hazaveh S.J, Bayat M. Studying  the Subtilisin Virulence Genes (1-7) in Trichophyton Rubrum Isolated from Clinical Samples of Skin and Nail in 2017: A Descriptive Study. J Rafsanjan Univ Med Sci 2019; 17 (10): 925-36. [Farsi]
 
 
[1]- گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، واحد علوم وتحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
[2]- گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید باهنر، کرمان، ایران
[3]- (نویسنده مسئول) استاد گروه انگل شناسی و قارچ شناسی، دانشکده بهداشت، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران
تلفن: 88951583(021)، دورنگار: 88951583(021)، پست الکترونیکی: sj.hashemi33@yahoo.com
4- گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، واحد علوم وتحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
 
[4]- Dept. of Pathobiology, School of Veterinary, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
ORCID: 0000-0002-5106-2880
[5]- Dept. of  Pathobiology, School of Veterinary, Shahid Bahonar University, Kerman, Iran, ORCID: 0000-0003-1641-8121
[6]- Dept. of Mycology and Parasitology, Faculty of Public Health, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
ORCID: 0000-0001-9626-9335
 (Corresponding Author) Tel: (021) 88951583, Fax: (021) 88951583, E-mail: sj.hashemi33@yahoo.com
4- Dept. of Pathobiology, School of Veterinary, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
 ORCID: 0000-0002-6552-5559
 [j1]تلفن و دورنگار ثبت شود.
 [12]مرتبه علمی نویسنده های محترم و تلفن و فاکس نویسنده مسئول ذکر نشده است.
نوع مطالعه: پژوهشي | موضوع مقاله: ميكروبيولوژي
دریافت: 1397/2/30 | انتشار: 1397/10/25
ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
CAPTCHA
ارسال پیام به نویسنده مسئول

بازنشر اطلاعات
Creative Commons License این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است.

کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق

© 2025 CC BY-NC 4.0 | Journal of Rafsanjan University of Medical Sciences

Designed & Developed by : Yektaweb